恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟中轉氨酶活性的影響

劉 盼，楊 慕，賈成霞，張清靖，曲疆奇

( 北京市水產科學研究所 漁業生物技術北京市重點實驗室，農業農村部北方地區漁業資源環境觀測試驗站，北京 100068 )

恩諾沙星又名乙基環丙沙星，是人工合成的第三代喹諾酮類藥物，該藥物具有高效廣譜、副作用小以及不易產生耐藥性等特點，已被應用于動物和人類多種感染性疾病的治療，對水產動物的細菌感染性疾病也具有很好的療效[1-4]。臨床上，恩諾沙星被廣泛應用于淡水魚類疾病中的出血性敗血癥、爛鰓病、腸炎病、赤皮病等，同時也已被應用于鱘魚養殖業中[5-7]。恩諾沙星在不同種類動物體內均可不同程度地代謝成環丙沙星，環丙沙星容易導致細菌產生耐藥性，且易殘留在動物體的血液和肝臟等組織中，對人類健康造成威脅，為保證動物源性食品的安全性，應對其進行藥殘監測[8]。谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶是廣泛存在于魚類細胞漿和線粒體中的重要氨基酸轉氨酶，在魚類蛋白質代謝中起到非常重要的作用，其活性大小不僅反映氨基酸代謝程度的強弱，也是指示肝細胞功能的敏感指標[9-12]。陳琛等[6]研究了恩諾沙星對史氏鱘(Acipenserschrencki)和小體鱘(A.ruthenus)體內谷胱甘肽-S-轉移酶和谷胱甘肽過氧化物酶系活性的影響，結果表明，兩種鱘魚肝臟組織中谷胱甘肽-S-轉移酶和谷胱甘肽過氧化物酶系的變化幅度明顯大于血漿中。艾曉輝等[13]研究了不同水溫下磺胺甲惡唑在草魚(Ctenopharyngodonidella)體內的藥動力，結果表明，水溫越高，草魚體內的藥物代謝越快。但西伯利亞鱘(A.baeri)在不同水溫下恩諾沙星對其機體中轉氨酶的影響還未見報道。筆者選擇西伯利亞鱘最適生長水溫中的較低溫度(15 ℃)和較高溫度(26 ℃)，研究在這兩種水溫條件下口灌恩諾沙星，實驗室暫養的西伯利亞鱘體內的谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性的變化，進而得出溫度對恩諾沙星代謝規律的影響，以期對水產養殖實踐中不同水溫下合理應用恩諾沙星給藥方式、制定休藥期及藥物殘留標準限量提供基礎性的數據。

1 材料與方法

1.1 試驗魚及養殖

試驗魚為人工繁殖的西伯利亞鱘，取自北京市水產科學研究所房山養殖基地。挑選健壯無病無傷的西伯利亞鱘300尾。保證魚的狀態正常，無畸形；體色和皮膚光澤度正常，皮膚緊致無損傷，無病灶；眼球飽滿，角膜清晰。體質量(212.3±5.6) g，體長(21.16±0.14) cm。試驗前于養殖槽中暫養7 d，每日上、下午按體質量1%投喂鱘魚專用不含任何藥物的商品膨化飼料。試驗用水為經活性炭過濾、充氧后經過曝氣的自來水。養殖和暴露期間條件控制：水溫由冷暖機自動控制(海鮮養殖恒溫機，HYH-2DR-B，15 ℃和26 ℃)，水硬度8.0 mg/L，pH 7.6±0.3，溶解氧(8.60±1.04) mg/L。試驗用西伯利亞鱘經抽查，組織中不含恩諾沙星。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥品及試劑配置

恩諾沙星儲備液的配制：恩諾沙星標準品0.1 g，使用流動相[V(乙腈)∶V(磷酸四丁基溴化銨)=5∶95]溶解，定容至500 mL，放入棕色瓶中4 ℃保存。該儲備液質量濃度為200 μg/mL。

口灌恩諾沙星工作液的配制：取0.5 mL恩諾沙星儲備液，加入流動相9.5 mL，配制成質量濃度為10.00 μg/mL的標準工作液。

1.2.2 給藥及樣品采集

在試驗水溫15 ℃和26 ℃下，從90尾西伯利亞鱘中隨機選取5尾為1組，每個時間點取1組魚，共18個取樣時間點，另取10尾未口灌恩諾沙星的西伯利亞鱘作空白對照。試驗在實驗室帶有循環系統的玻璃缸中進行。用套有橡皮軟管的卡介苗注射器以10 mg/kg[14]給藥劑量口灌恩諾沙星溶液，直立停留幾秒，無回吐者保留試驗。給藥前12 h禁食，并于給藥后0(空白對照)、0.125、0.25、0.5、1.0、1.5、2、4、6、8、12、18、24、36、48、60、72、96 h和120 h分別采取血液和肝臟樣品，采集的血液于3 mL肝素抗凝管中，混勻，4000 r/min(離心半徑1 cm)下離心15 min，分離血漿，-80 ℃保存待測。肝臟取出后剪碎，按1∶9 (m/V)加入預冷生理鹽水(含0.75%氯化鈉和0.03%氯化鉀)，用手持式勻漿機于冰浴中制成勻漿液(10 000 r/min，4 ℃，3 min)。勻漿液經10 000 r/min(離心半徑1 cm)離心10 min，取上清液備用。

1.3 酶活性測定

谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶酶活性測定按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書操作。組織蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定。

1.4 數據處理

試驗數據采用Excel 2010及SPSS 20.0軟件進行統計分析，試驗結果以平均值±標準差(n=5)表示，各組樣本之間采用單因素方差分析和Duncan′s多重比較檢驗均值的差異顯著性，以P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 不同溫度下恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性的影響

2.1.1 不同溫度下恩諾沙星對西伯利亞鱘血清中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性的影響

不同溫度下，恩諾沙星對西伯利亞鱘血清中谷草轉氨酶活性的影響見圖1。兩溫度組中，血清中的谷草轉氨酶活性均被緩慢誘導至峰值。其中15 ℃試驗組谷草轉氨酶活性振蕩較劇烈。谷草轉氨酶活性最大值出現在給藥后的24 h [(199.73±6.06) U/mg]，與對照組[(71.24±2.36) U/mg]差異顯著(P<0.05)，但與其之后36～72 h幾個時間點無顯著性差異(P>0.05)。而在26 ℃試驗組中，血清谷草轉氨酶活性在36 h [(236.02±10.29) U/mg]出現峰值，與對照組[(38.86±2.98) U/mg]差異顯著(P<0.05)，后緩慢下降至平穩。

圖1 不同溫度口灌恩諾沙星后西伯利亞鱘血清谷草轉氨酶活性Fig.1 Glutamic-oxaloacetic transaminase activity in serum of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at different temperatures

不同溫度下口灌恩諾沙星，血清中谷丙轉氨酶活性隨時間變化見圖2。谷丙轉氨酶活性均呈現逐漸升高至一定水平后趨于平穩的變化趨勢。兩溫度組中，血清谷丙轉氨酶活性均在6 h達到最高。其中15 ℃峰值為(66.73±3.71) U/g，與對照組[(18.15±1.27) U/mg]差異顯著(P<0.05)；26 ℃試驗組中，血清中谷丙轉氨酶活性峰值為(286.93±24.50) U/mg，也與對照組[(7.36±1.04) U/mg]呈顯著性差異(P<0.05)。在15 ℃試驗組中，谷丙轉氨酶活性在6 h達到最大值后逐漸下降，至18 h [(42.14±5.29) U/mg]后又緩慢上升，從24 h [(53.98±3.67) U/mg]后數值逐漸穩定，各時間點差異不顯著(P>0.05)。在26 ℃試驗組中，血清中谷丙轉氨酶活性由1 h[(145.65±10.04) U/mg]時間點開始逐步上升至峰值后緩慢下降，在這段時間內各時間點差異不顯著(P>0.05)。由其變化趨勢可見，高溫血清試驗組中谷丙轉氨酶更易被誘導且酶活性水平更高。

圖2 不同溫度口灌恩諾沙星后西伯利亞鱘血清谷丙轉氨酶活性Fig.2 Glutamic-pyruvic transaminase activity in serum of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at different temperatures

2.1.2 不同溫度下恩諾沙星對西伯利亞鱘肝臟中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性的影響

不同溫度下，恩諾沙星對西伯利亞鱘肝臟中谷草轉氨酶活性的影響見圖3。兩溫度組中，肝臟中的谷草轉氨酶活性均被明顯誘導至一定數值后趨于穩定。15 ℃試驗組肝臟谷草轉氨酶活性最大值出現在給藥后的0.5 h [(158.10±14.25) U/mg]，與對照組[(81.33±2.36) U/mg]差異顯著(P<0.05)，但與其之后各組差異不顯著(P>0.05)。而26 ℃試驗組中，肝臟谷草轉氨酶活性則在2 h[(182.79±18.90) U/mg]出現峰值，與對照組[(18.26±1.24) U/mg]差異顯著(P<0.05)，后緩慢下降并趨于平穩，與后面各時間段差異不顯著(P>0.05)。

圖3 不同溫度口灌恩諾沙星后西柏利亞鱘肝臟谷草轉氨酶活性Fig.3 Glutamic-oxaloacetic transaminase activity in liver of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at different temperatures

不同溫度下口灌恩諾沙星，肝臟中谷丙轉氨酶活性測定見圖4，谷丙轉氨酶活性均呈現逐漸升高至一定水平后趨于平穩的變化趨勢。不同溫度下，15 ℃試驗組中肝臟谷丙轉氨酶活性在短時間內被顯著誘導，在1.5 h時即達到活性峰值[(134.29±3.98) U/mg]，與對照組[(17.352±1.53) U/mg]差異顯著(P<0.05)，隨后逐漸趨于平穩。26 ℃試驗組中，肝臟在36 h達到最大值[(129.40±16.00) U/mg]，與對照組[(60.13±2.325) U/mg]差異顯著(P<0.05)，但與其后的各時間段差異不顯著(P>0.05)。由其變化趨勢可見，兩個溫度下，肝臟組織中谷丙轉氨酶更易被誘導且酶活性水平更高。

圖4 不同溫度口灌恩諾沙星后西伯利亞鱘肝臟谷丙轉氨酶活性Fig.4 Glutamic-pyruvic transaminase activity in liver of Siberian sturgeon orally administrated with of enrofloxacin at different temperatures

2.2 恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶的影響

2.2.1 15 ℃下恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性的影響

15 ℃下恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉氨酶活性影響見圖5。由圖5可見，口灌恩諾沙星0～4 h(除0.25 h外)，魚體血清和肝臟中谷草轉氨酶活性差異不顯著(P>0.05)，而6～24 h時，血清中的谷草轉氨酶活性顯著高于肝臟中谷草轉氨酶活性(P<0.05)，但36～120 h(除72 h外)，肝臟中谷草轉氨酶活性又顯著高于血清中谷草轉氨酶活性(P<0.05)。

圖5 15 ℃下口灌恩諾沙星后西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉氨酶活性Fig.5 The activity of glutamic-oxaloacetic transaminase in serum and liver of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at 15 ℃

15 ℃下恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟中谷丙轉氨酶活性影響見圖6。與谷草轉氨酶不同，對比0.25～4 h、36～120 h兩個時間段，肝臟內谷丙轉氨酶活性顯著高于血清中谷丙轉氨酶活性(P<0.05)，而試驗中6～24 h時間段內，血清和肝臟中谷丙轉氨酶活性差異不顯著(P>0.05)。

圖6 15 ℃下口灌恩諾沙星后西伯利亞鱘血清和肝臟中谷丙轉氨酶活性Fig.6 The activity of glutamic-pyruvic transaminase in serum and liver of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at 15 ℃

2.2.2 26 ℃下恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性的影響

26 ℃下恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉氨酶的影響見圖7。0～0.5 h，西伯利亞鱘血清中谷草轉氨酶活性比肝臟中谷草轉氨酶活性略高，但差異不顯著(P>0.05)；1～4 h，肝臟中谷草轉氨酶活性又略高于血清中谷草轉氨酶活性，差異也不顯著(P>0.05)；6～120 h，西伯利亞鱘血清中谷草轉氨酶活性均高于肝臟中谷草轉氨酶活性，其中在18、24、36 h時間點上差異顯著(P<0.05)。

圖7 26 ℃下口灌恩諾沙星后西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉氨酶活性Fig.7 The activity of glutamic-oxaloacetic transaminase in serum and liver at of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at 26 ℃

26 ℃下恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟中谷丙轉氨酶活性影響見圖8。與谷草轉氨酶活性變化相似，0～0.5 h，鱘魚肝臟中谷丙轉氨酶活性顯著高于血清中谷丙轉氨酶活性(P<0.05)；1.5～120 h，鱘魚血清中谷丙轉氨酶活性均高于肝臟中谷丙轉氨酶活性，4～120 h中每個時間點血清中的谷丙轉氨酶活性均顯著高于肝臟中谷丙轉氨酶活性(P<0.05)。

圖8 26 ℃下口灌恩諾沙星后西伯利亞鱘血清和肝臟中谷丙轉氨酶活性Fig.8 The activity of glutamic-pyruvic transaminase in serum and liver of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at 26 ℃

3 討 論

3.1 谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶在生物體內的代謝機理

谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶是動物機體中參與藥物代謝的兩個關鍵的轉氨酶，它們在機體蛋白質代謝中起重要作用[15-16]。二者均為非特異性免疫功能酶，但它們存在的組織不同[17-20]，谷草轉氨酶廣泛分布于各個組織器官，而存在于肝細胞線粒體中較多，細胞質和線粒體中的谷草轉氨酶是保證蘋果酸穿梭作用的重要酶系之一；谷丙轉氨酶主要存在于各組織細胞中，只有少量釋放入血液中[21-22]。谷草轉氨酶與谷丙轉氨酶活性的大小不僅反映氨基酸代謝程度的強弱，其活性變化與肝細胞的炎癥、變性等也密切相關；血清中的轉氨酶活性亦可表征肝功能是否受到損傷，因此血清和肝臟中的谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性變化均為反映肝功能正常與否的主要敏感指標，可借以評價藥物的毒副作用[10]。

谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的主要作用是催化氨基酸生成酮酸。谷草轉氨酶催化谷氨酸與草酰乙酸的轉氨作用，谷丙轉氨酶催化谷氨酸與丙氨酸的轉氨作用。當機體中谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性較弱時，轉氨作用較弱；反之，當機體中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性較高時，加快尿素生成，轉氨作用相應增加，聯合脫氨作用容易進行，氨基酸的氧化分解作用增強，減少氨基酸代謝產物對機體的毒害，從而保持機體的穩定[9,17,23]。通過對血清及肝臟中轉氨酶活性的檢測，可以查明機體肝功能是否健康。健康血清中這兩種酶的活性均不高[24]。

3.2 不同溫度下口灌恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性的影響

在本試驗中，口灌10 mg/kg恩諾沙星，15、26 ℃條件下西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性均有所升高。15 ℃下西伯利亞鱘血清中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性最大值分別出現在給藥后的24 h和6 h，而26 ℃下谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性最大值出現在36 h和6 h。15 ℃下西伯利亞鱘肝臟中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性最大值出現在0.5 h和1.5 h，而26 ℃下谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性最大值則分別出現在2 h和36 h。這說明低溫下誘導谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性達到峰值的時間較高溫更短。

由峰值看，15 ℃下血清中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的峰值為(199.73±6.06) U/mg和(66.73±3.71) U/mg，顯著低于26 ℃下血清中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性的峰值[(236.02±10.29) U/mg和(286.93±24.50) U/mg]。與血清指標不同，15 ℃下肝臟中谷草轉氨酶的峰值[(158.10±14.25) U/mg]與26 ℃下谷草轉氨酶的峰值[(182.79±18.90) U/mg]差異顯著(P<0.05)，但谷丙轉氨酶活性峰值在兩個溫度下差異不顯著(P>0.05)。試驗結果表明，谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性在高溫下的峰值均高于低溫下的峰值。說明谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性在高溫下更易被誘導。

在兩個溫度下，西伯利亞鱘血清和肝細胞內谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性隨時間推移而升高，之后則趨于平緩，這與乳酸諾氟沙星對南方大口鲇(Silurussoldatovimeridionalis)[25]肝臟谷草轉氨酶活性的影響和高效氯氰菊酯殺蟲劑對鯽(Carassiusauratusauratus)[26]體內谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性的影響相似。在低溫下6～24 h，血清中谷草轉氨酶活性高于肝臟，而隨著時間延長，肝臟中谷草轉氨酶活性又高于血清，說明藥物未對魚體造成損傷；但高溫18～36 h，血清中谷草轉氨酶活性一直高于肝臟。與谷草轉氨酶相似，谷丙轉氨酶低溫下從0.25 h開始肝臟中谷丙轉氨酶活性顯著高于血清，但高溫下血清中的谷丙轉氨酶活性顯著高于肝臟。這是因為在高溫下，肝細胞受到藥物刺激，產生了一定的應激反應，細胞膜的通透性增大，肝細胞內這兩種酶的活性降低，導致大量谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶滲入血液，致使肝臟中的谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性明顯下降[25]。試驗結果表明，實際生產中，在應用有效藥物含量之前，要充分考慮到環境因素。高溫天氣下，要適當減小用藥量，盡量避免藥物對西伯利亞鱘機體帶來的影響。