益生芽孢桿菌對魚類生長與抗病力影響的研究進展

張宇柔，陳玉珂，于夢楠，雷新雨，王嘉婧，高永生，王秋舉，MAHMOUD M. Elsadek，張東鳴,3

( 1.吉林農業大學 生命科學學院，吉林 長春 130118； 2.吉林農業大學 動物科學技術學院/動物醫學院，動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，吉林省動物營養與飼料科學重點實驗室，吉林 長春 130118；3.通化師范學院，吉林 通化 134000 )

隨著我國水產養殖業的快速發展，我國水產養殖的產量已達到世界總產量的3/4[1]。而隨著魚類產量的提高，魚類疾病成為水產養殖業的一個嚴峻的問題[2]。過去很長一段時間，抗生素等藥物一直是預防魚類疾病的有效選擇，但抗生素的大量使用也導致了藥物殘留和耐藥性細菌的出現[3]，同時也損害魚類的免疫系統，并對魚類的消化道菌群產生不利影響[4-6]。魚類的腸道環境是機體抵抗疾病發生的重要生理屏障，吞噬細胞對抗原攝取和處理主要發生在魚類腸道的黏膜表面，黏膜屏障與病原微生物之間的動態相互作用可以誘發炎癥反應以及改變腸道的屏障功能[7]。研究發現，益生菌可通過調節魚類腸道黏膜屏障功能防止病原菌定殖，其在魚類黏膜免疫中發揮重要作用[8]。因此，近年來益生菌作為抗生素的安全替代品之一，以飼料添加劑形式廣泛應用于水產養殖中[9]。與乳酸桿菌(Lactobacillus)等相比，芽孢桿菌(Bacillus)可形成保護其免受環境影響的內生孢子，在魚類疾病的預防上更加具有優勢。益生芽孢桿菌可作為飼料添加劑促進生長、促進消化、抑制病原菌和增強魚類免疫，同時調節魚類腸道微生物區系，對魚類的健康養殖具有重要意義。筆者概述了益生芽孢桿菌的種類、特征及作用機理，綜述了其在魚類養殖過程中對魚類的生長性能、免疫功能以及抗病力的影響，為魚類的疾病防控和健康養殖提供理論依據。

1 益生芽孢桿菌的概述

1.1 益生芽孢桿菌的種類和特征

芽孢桿菌屬為革蘭氏陽性，過氧化氫酶陽性，桿狀(2.5～10.0 μm)，無莢膜，是需氧或兼性厭氧菌，具有豐富的鞭毛用于運動[10]。在非選擇性培養基上，芽孢桿菌通常呈現大而扁平的菌落形態[11]。芽孢桿菌與其他益生菌的顯著區別在于在其培養的最后階段會在細胞內形成厚壁芽孢，也稱內生孢子，具有耐高溫、高pH、高鹽、干燥和抗氧化等特點，可保護芽孢桿菌免受不良環境的影響[12-14]，從而保持良好的生物活性，可在魚類的消化道中持續生存。同時，芽孢桿菌具有可產生纖維素酶、植酸酶、單寧酶、幾丁質酶、木聚糖酶、蛋白酶和脂肪酶的能力[15-20]。大部分用于水產養殖的益生芽孢桿菌是從魚類自身腸道、池塘底泥、土壤、堆肥或水環境中分離出來的，研究表明，芽孢桿菌是魚類本身細菌群落的一部分[21-22]。由于益生菌菌株與病原菌在魚體內共享相同的生態位[23]，因此在水產養殖中可能更傾向于使用魚源細菌，以避免對宿主自身的微生物區系產生不良影響。而且這些魚類內源性芽孢桿菌由于能適應相同的環境從而免受競爭性排斥作用，更具潛力[24-26]。

目前常用于水產養殖的益生芽孢桿菌有地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、凝結芽孢桿菌(B.coagulans)、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、納豆芽孢桿菌(B.natto)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、堅強芽孢桿菌(B.firmus)等40種以上[27]。其中，地衣芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌經過嚴苛試驗及安全評估被許可收錄進2013年我國農業部發布的微生物飼料添加劑品種目錄中。

1.2 益生芽孢桿菌在魚體內的作用機理

魚類胃、腸道及腸道微生物區系的有效功能對其自身健康起著至關重要的作用[28-30]。如果沒有腸道菌群的保護，魚類正常的免疫功能受損，降低抵抗致病菌感染的能力，同時損害腸道健康，致使腸道菌群失調，增加宿主感染的風險[31-36]。在魚類腸道中，魚類的消化功能直接影響魚類的腸道健康，而腸道黏膜和共生微生物區系則是影響魚類消化功能的重要因素。其中，腸道微生物區系又分為腸道內微生物和黏附在黏膜表面的微生物，它們對宿主病原菌置換、抗菌因子的產生等具有促進作用[37-38]。

益生芽孢桿菌可通過調節微生態平衡來促進宿主生長和預防疾病，是水產養殖的熱門飼料添加劑之一。目前，有關其在魚體內的作用機理主要有以下3種：(1)益生芽孢桿菌進入魚類的腸道后，在腸道內大量繁殖迅速形成優勢菌群，同時消耗腸道內的氧氣創造了一種有利于厭氧益生菌生長的環境，抑制大腸桿菌(Escherichiacoli)、氣單胞菌(Aeromonas)、葡萄球菌(Staphylococcus)等有害菌群的生長，創造有益微生態環境[39]。(2)益生芽孢桿菌黏附在腸道或其他組織上，與黏膜上皮緊密結合并形成致密菌膜，與病原微生物競爭黏附位點，抑制病原微生物在腸道黏膜上的黏附，阻止其定殖。黏附過程可以通過物理化學因素等非特異性方式實現，也可以通過細菌表面的黏附素分子與上皮細胞上的受體分子結合等特異性方式實現[40-41]。(3)益生芽孢桿菌自身可以直接抑制病原微生物的生長和代謝毒物的產生，分解腸道內殘餌和代謝廢物，促進宿主腸道蠕動，維持腸道黏膜屏障完整，使腸道微生態系統中的能量流、物質流和基因流可以正常運轉[42]。這3種理論雖然機制有所不同，但功效一致，均為抑制病原菌，調節宿主微生態平衡，利于宿主生長。

2 益生芽孢桿菌在魚類養殖中的研究進展

2.1 益生芽孢桿菌對魚類生長性能的影響

隨著水產養殖的集約化程度越來越高，提高魚類的生長性能和水產品品質一直是水產研究的熱點和目的。益生芽孢桿菌作為飼料添加劑能夠促進魚類生長主要有兩方面的原因：一方面，是通過為魚類提供營養同時影響消化酶活性從而提高消化率或飼料利用率來促進魚類生長[43]。淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶是益生芽孢桿菌在宿主體內調節的主要消化酶，它們能夠消化腸道內的脂類、蛋白質和碳水化合物。魚類消化酶活性直接反映了宿主對飼料的消化吸收能力，間接反映了魚類的生長性能。而益生芽孢桿菌對魚類消化酶活性具有促進作用，其原因可能是益生芽孢桿菌能分泌外源酶，對宿主的內源性酶進行一定的補充，亦或是益生芽孢桿菌能夠促進魚類內源酶的產生[44]。另一方面，益生芽孢桿菌通過產生維生素、有機酸等增加魚類食欲，降解腸道中難以消化的成分，改善腸道形態，促進營養物質吸收來促進魚類生長[45]。Adeoye等[46]以尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)為研究對象，對其投喂添加外源酶和3種益生芽孢桿菌的飼料，發現添加外源酶和益生芽孢桿菌組合可使羅非魚腸道的杯狀細胞豐度、微絨毛直徑和腸上皮細胞總吸收面積均高于對照組，改善羅非魚的生長性能。Kuebutornye等[47]也在尼羅羅非魚上證實了相似的結果。益生芽孢桿菌對草魚(Ctenopharyngodonidella)、鰻鱺(Anguillajaponica)、金頭鯛(Sparusaurata)的腸道形態參數也有積極影響[48-50]。

益生芽孢桿菌對魚類產生影響的一個必要前提是在魚腸道內定殖，因此其黏附性是益生芽孢桿菌篩選的標準之一。Zhao等[51]將從草魚腸道分離的副地衣芽孢桿菌(B.paralicheniformis)添加到飼料中后飼喂草魚2周，在停止飼喂后的220 d內使用免疫熒光法標記副地衣芽孢桿菌在草魚腸道內的動態，結果發現，其熒光信號在第40天到第60天間趨于平穩，第80天依然在草魚腸道中保持可見，在第220天仍能從腸道內容物中重新分離到副地衣芽孢桿菌。說明副地衣芽孢桿菌可在草魚腸道內黏附并定殖?，F有的研究成果(表1)表明，飼喂效果好的益生芽孢桿菌大部分分離自魚類自身腸道，其原因可能是這些魚類內源性芽孢桿菌能適應相同的環境從而免受競爭性排斥作用，且這些內源性芽孢桿菌在宿主腸道的黏附作用具有特異性，因此在魚類飼料應用方面更具有潛力。

表1 飼料中添加益生芽孢桿菌對魚類的生長性能、消化酶活性和腸道菌群的影響Tab.1 Effects of dietary probiotic Bacillus on growth performance, digestive enzyme activities and intestinal microflora in fish

益生芽孢桿菌對多種魚類的生長具有促進作用，并在魚類腸道中定殖且形成優勢菌群。不同魚類對益生芽孢桿菌的最適需求量也不同。然而也有部分證據表明，飼料中添加益生芽孢桿菌對達氏鱘和大菱鲆的生長性能和消化酶活性無顯著影響[64]。原因可能是益生芽孢桿菌的添加量和飼喂方法不同，也可能是養殖條件不同，如水的理化參數、放養密度、攝食率以及魚的規格等因素均會對魚類的性能產生影響。目前益生芽孢桿菌添加量與魚體規格間還沒有具體的規定，但總體來說，大規格魚需要添加較多劑量的益生芽孢桿菌，小規格魚需要益生芽孢桿菌的劑量較少。當益生芽孢桿菌作用于魚類時，益生芽孢桿菌單獨或組合使用，多會提高宿主的生長性能和飼料利用率，且不同益生芽孢桿菌對同種魚類的作用效果不同，同種益生芽孢桿菌的劑量不同對宿主的作用效果也不同。

2.2 益生芽孢桿菌對魚類免疫和抗氧化功能的影響

益生芽孢桿菌已成為抗生素的安全替代品，可作為飼料添加劑增強魚類免疫力而減少疾病的產生。在抑制疾病方面，魚類的非特異性免疫比特異性免疫更為重要[67]，其中體液免疫因子作為魚類非特異性免疫應答的效應分子，對病原微生物具有直接的防御作用。益生芽孢桿菌可通過調節魚類的體液免疫因子和免疫基因的表達來調節魚類的非特異性免疫[44]。研究發現，酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶、溶菌酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶等血清免疫因子對病原微生物具有殺滅作用[12,48,68-69]。目前報道較多的還有補體C3、干擾素、免疫球蛋白、白細胞介素、腫瘤壞死因子α以及其他頭腎免疫相關基因mRNA的表達。以上免疫指標活性的增加均能證明魚類免疫應答的增強[70-73]。有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)單獨或共同作為添加劑均可通過調節血清免疫和黏膜免疫增強尼羅羅非魚的免疫應答[73]；地衣芽孢桿菌對草魚也具有同樣的效果[48]。Li等[74]研究表明，貝萊斯芽孢桿菌可通過調節雜交石斑魚(E.lanceolatus♂×E.fuscoguttatus♀)酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、補體C3的活性及同時調節白細胞介素8、免疫球蛋白、CC趨化因子、Toll樣受體(TLR-3、TLR-5)等相關免疫基因來增強其免疫功能。另外，益生芽孢桿菌也對魚類腸道黏膜免疫活性起作用[75-76]。魚類的腸黏膜上皮為單柱狀細胞，包括腸上皮細胞、杯狀細胞和散在的纖毛細胞。其中杯狀細胞能分泌具有殺菌作用的黏液，在腸道內形成保護性黏液層，可防止病原體進入腸道，同時維持腸上皮的完整性。Elsabagh等[68]研究發現，投喂益生芽孢桿菌的尼羅羅非魚腸道內PAS陽性杯狀細胞數量與對照組相比明顯增多，證實隨著腸道黏膜免疫活性的增強，黏液分泌的增加與魚類服用益生芽孢桿菌有關。

益生芽孢桿菌對魚類的抗氧化能力也有一定影響。當魚類因生存的水環境發生變化而受到刺激時，組織或細胞內的自由基增加會導致氧化劑如活性氧的產生，當氧化劑的蓄積超過組織或細胞的抗氧化能力時，魚類就會出現氧化應激反應。這種損傷可通過抗氧化酶活性的增強來抵消。Hindu等[77]研究發現，益生芽孢桿菌在魚體內產生的超氧化物歧化酶可有效的消除自由基來調節魚類的抗氧化能力；Qin等[48]也發現，地衣芽孢桿菌可通過提高草魚血清中超氧化物歧化酶活性和降低丙二醛水平來增加其抗氧化能力。

2.3 益生芽孢桿菌對魚類抗病力的影響

細菌感染是魚類養殖過程致病的主要原因，氣單胞菌、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、鄰單胞菌(Plesiomonas)、愛德華氏菌(Edwardsiella)等均會造成魚類的細菌性疾病。多項證據表明，益生芽孢桿菌添加在水產飼料中可抑制魚類細菌性疾病的發生[78-81]。益生芽孢桿菌的抑菌活性表現在其產生的活性物質可對多種魚類病原微生物產生抗菌作用。一方面，益生芽孢桿菌通過對病原菌直接的拮抗作用提高宿主的抗病力。拮抗作用在維持魚類潛在益生菌與病原菌的平衡上不可或缺[82]，益生菌對病原菌的生長抑制作用可能是通過單獨或與其他益生菌或益生元聯合作用產生細菌素、溶菌酶、蛋白酶、鐵載體等抗菌代謝物，或通過產生的有機酸改變腸道內的pH，或與病原菌競爭必需營養素等方式實現的[40]。另一方面，益生芽孢桿菌可調節魚類腸道微生物菌群的平衡，使腸道內優勢菌群及細菌呈上升趨勢，與病原菌爭奪營養空間，使有益菌數量增加，有害菌數量減少，增強魚類免疫系統功能，從而抑制病原微生物對魚類的致病性[83]。也有研究者發現[44]，益生芽孢桿菌可通過降低谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性防止魚類肝組織損傷，而益生芽孢桿菌用于防止魚類免受病毒性疾病的研究在魚類養殖上鮮有報道。由表2可知，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌等可與多種魚類病原菌產生拮抗作用并增強魚類抗感染能力，但也有研究表明，在飼料中添加20 g/kg的芽孢桿菌對金頭鯛病原菌的血清殺菌效果不顯著。其原因可能是益生芽孢桿菌劑量或飼喂時間未達到對病原菌致死的效果，但金頭鯛血清中免疫球蛋白M水平顯著提高，這說明益生芽孢桿菌對其免疫功能具有促進作用[78]。有研究表明，在從鯉腸道中分離出的枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌中，只有解淀粉芽孢桿菌對嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)和不動桿菌(Acinetobacter)這兩種魚類病原菌顯示出抑菌活性[84]。多項研究(表2)表明，添加不同劑量的益生芽孢桿菌對魚類病原菌的抑制效果不同，在處于安全劑量的前提下，通常，細菌劑量高時抑制病原菌和增強魚類免疫力效果更加顯著。

表2 飼料中添加益生芽孢桿菌對魚類抗細菌性疾病能力的作用效果Tab.2 Effect of dietary probiotic Bacillus on anti-bacterial diseases in fish

3 結語與展望

益生芽孢桿菌，因其具有可抵抗不良環境影響而穩定存在的優勢，在魚類養殖上應用前景良好，且由于它對魚類無毒害和無不良副作用，還可對魚類機體內外微生態環境同時進行調節[91]，已成為國內外抗生素替代研究的重點與熱點。多項研究證明，益生芽孢桿菌作為綠色微生態制劑在魚類養殖上具有顯著的功效，但在其生產和應用中仍然存在不足：(1)目前投入生產的魚源菌種依然較少；(2)益生芽孢桿菌在培養和傳代過程中益生功效逐漸降低；(3)益生芽孢桿菌作為水產飼料添加劑其益生功能未得到充分挖掘；(4)益生芽孢桿菌制劑在制作和使用過程中容易失活等。同樣，關于益生芽孢桿菌作用機制的研究中有些問題也未得到解答：(1)益生芽孢桿菌在魚體內的具體黏附機制是什么？(2)益生芽孢桿菌在魚體內抑制病原菌的具體作用方式是什么？(3)益生芽孢桿菌對魚類的病毒感染是否同樣具有抑制作用？針對以上問題，建議今后加強以下方面的研究：(1)繼續篩選和驗證魚源益生芽孢桿菌，擴大魚源益生芽孢桿菌在實際生產上的種類；(2)可利用基因組學[92]技術獲得益生效果更好、穩定性更高的魚源益生芽孢桿菌，使其益生效果在水產飼料應用中充分發揮；(3)繼續探究益生芽孢桿菌添加到飼料中的方式，如微膠囊包埋技術、凍干添加以及熱滅活添加等，也可通過改良制作工藝如冷制粒機的應用，以確保益生芽孢桿菌在添加和使用過程中的活性；(4)可利用代謝組學等技術探究腸道微生物及其代謝產物與宿主之間的作用機制，也可探究其抑制病原菌的免疫方式，代謝組學目前在家畜上應用較為廣泛[93]，但其在魚類養殖上的應用還需進一步開發。這些問題的解決可為益生芽孢桿菌在魚類養殖上的科學利用提供更加詳盡的數據支持和參考。