方格星蟲實時熒光定量PCR內參基因的選擇與驗證

彭冰冰，賓東超，周于娜，楊志會，蔡小輝，彭銀輝

( 1.北部灣大學 海洋學院，廣西北部灣海洋生物多樣性養護重點實驗室，廣西 欽州 536011; 2.北海市漁業技術推廣站，廣西 北海 536000; 3.邢臺市農業農村局，河北 邢臺 054000 )

方格星蟲(Sipunculusnudus)，也稱光裸方格星蟲，又名“海人參”，屬星蟲動物門、方格星蟲科、方格星蟲屬，廣泛分布在灘涂或淺海區域，廣西北部灣海域自然資源最豐富[1]。方格星蟲營養豐富、味道鮮美，含豐富的蛋白質、多種氨基酸以及多種微量元素，具有抗疲勞、抗氧化、抗病毒、降血壓、祛濕、清肺補虛等醫藥價值，素有“海洋冬蟲夏草”的美譽[2-4]。

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)是一種核酸定量技術，可以實現對初始模板的定量分析，具有定量準確、靈敏度高、特異性強等優點，在分子生物學研究領域的基因表達分析中發揮著重要作用[5]。但是在用實時熒光定量PCR技術對某一目的基因的不同樣品的表達量進行數據處理和分析時，會受到起始RNA質量和數量、反轉錄效率、擴增效率以及不同細胞和組織間的差異等變量的影響[6]。因此要選擇表達水平相對穩定的內參基因對目的基因的表達量進行參考和校正，確保結果的可信度[7]。同一組織的內參基因的表達基本沒有差別，但是不同種類、不同試驗條件的內參基因表達量并不一致，用不同內參基因校正會得到不一樣的結果，所以選擇合適的內參基因是試驗的必要前提。

通過查閱相關文獻并結合前期獲得的方格星蟲發育轉錄組數據庫，共篩選出肌動蛋白家族(Actin1)、微管蛋白家族(α-Tub1)、核糖體蛋白(RPL13-b)、延伸因子1-α(EF1-α2)、H3-b(組蛋白)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH1)6個方格星蟲生命活動所必需的基因作為候選內參基因。肌動蛋白是一種細胞骨架蛋白，對細胞分裂、細胞運動以及細胞骨架的維持有重要作用，在多種植物的不同發育時期的花瓣和不同組織中均表現出較好的穩定性[8]；α-Tub1基因是控制表達維持細胞骨架的基本組分蛋白基因[9]，一些研究者指出，其為表達較為穩定的內參基因[10]；核糖體蛋白是真核生物核糖體中表達豐富的一類蛋白，在蛋白合成、核糖體裝配以及細胞的增殖和分化中起重要作用，RPL13-b基因作為穩定的內參基因用于多個物種實時熒光定量PCR中[11]；延伸因子1-α是在mRNA翻譯時促進肽鏈延伸的蛋白因子，具有保守性和穩定性[12]；H3-b基因參與染色質的組裝，協調折疊、包裝DNA，通過調節基因的表達調控細胞的分裂、凋亡以及DNA的修復等細胞生命過程，在進化過程中高度保守[13]；甘油醛-3-磷酸脫氫酶是糖酵解反應中的一種反應酶，具有修復DNA、促進細胞凋亡、調節組蛋白等多種作用[14]，有較好的穩定性[15]。應用實時熒光定量PCR對方格星蟲組織中的內參基因的表達量進行檢測，篩選出相對穩定表達的內參基因并驗證，結果將為方格星蟲目的基因的定量分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用方格星蟲個體采自北部灣福成海域。使用鹽酸普洛卡因(0.25%～0.5%)浸泡方格星蟲5～10 min用于麻醉[16]。使用1 mL一次性注射器抽取方格星蟲體腔液于裝有CAD抗凝劑的離心管中，12 000 r/min離心5 min(離心機型號：sigma 2-16KP)，獲取血淋巴細胞，-80 ℃保存備用。使用剪刀剖取方格星蟲蟲體的體壁肌肉、吻、腎管、腦、腸道、收吻肌、食道，立即投入到液氮中，并轉移至-80 ℃冰箱保存待用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取

將方格星蟲組織轉移至500 μL Trizol中，按照TransZol Up說明書(Invitrogen，USA)提取各方格星蟲組織的RNA。取2 μL RNA樣品用核酸蛋白測定儀測定濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測完整性。

1.2.2 cDNA合成

按照北京全式金生物技術有限公司的TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 說明書將提取到的方格星蟲組織的RNA合成為cDNA。反應體系(20 μL)：2×TS Reaction Mix 10 μL，500 ng total RNA, Random Primer 1 μL，EasyScript?RT/RI Enzyme Mix 1 μL, gDNA Remover 1 μL。擴增程序為：42 ℃反應59 min；85 ℃ 5 s，使EasyScript?RT/RI Enzyme和gDNA Remover失活；4 ℃保存。合成的cDNA于-20 ℃保存備用，用于實時熒光定量PCR分析。

1.2.3 基因引物選擇和實時熒光定量PCR擴增

方格星蟲6個候選內參基因(EF1-α2、α-Tub1、RPL13-b、Actin1、H3-b和GAPDH1)和免疫球蛋白(IgGFc-binding protein)基因序列為本課題組構建的方格星蟲肌肉組織轉錄組數據，根據在線軟件Primer3設計(表1)，并于江蘇東玄基因科技有限公司合成。實時熒光定量PCR檢測內參基因特異性，以方格星蟲腦組織的cDNA為模板，反應體系(12.5 μL)：cDNA 0.5 μL，引物F和R各0.5 μL，r Taq 6 μL，超純水5 μL。反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 10 min，16 ℃ 保存。反應完成后，取5 μL的擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗。

表1 本試驗所用的引物序列Tab.1 Primer sequences used in this study

1.2.4 實時熒光定量PCR擴增

參照北京全式金生物技術有限公司的TransScript?Green qPCR SuperMix試劑盒說明書，QuantStudioTM 6 Flex Real-Time PCR System儀器上進行反應。反應體系(10 μL)： cDNA 0.5 μL，引物F和R各0.4 μL，Passive Reference Day 0.2 μL，Nuclease-free water 3.5 μL。反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個循環；95 ℃ 5 s，70 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個反應設置3個平行。

1.3 數據分析

利用QuantStudioTM 6 Flex Real-Time PCR System軟件獲取引物熔解曲線和Ct值。統計各組平均值，減去每組中最小Ct值，得到ΔCt，并利用公式2-ΔCt得到Q值。應用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件篩選出最穩定的內參基因并進行內參基因驗證試驗。

2 結 果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結果

6個候選內參基因擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1，每個候選內參基因的引物均擴增出了單一正確的產物，無可見的引物二聚體，說明引物的特異性良好。

圖1 候選內參基因擴增產物電泳結果Fig.1 Amplification products electrophoresis of candidate internal reference genesM.DNA maker; 1—6.Actin1, EF1-α2，H3-b,RPL13-b,GAPDH1 and α-Tub1.

2.2 熔解曲線

6個候選內參基因的熔解曲線見圖2，均為單一的信號峰，說明6個候選內參基因擴增后未產生引物二聚體和非特異性條帶。

圖2 內參基因的熔解曲線Fig.2 Melt curves of internal reference genesa—f.Actin1, EF1-α2, H3-b, RPL13-b, GAPDH1 and α-Tub1; RFU.relative fluorescence unit.

2.3 內參基因的表達穩定分析

使用geNorm軟件評估6個候選內參基因表達穩定性(M)，基因的表達穩定值越小，表明穩定性越高。根據geNorm軟件計算的表達穩定值排列順序為：α-Tub1>Actin1>GAPDH1>EF1-α2>RPL13-b=H3-b(圖3)，候選內參基因穩定性順序為：RPL13-b=H3-b>EF1-α2>GAPDH1>Actin1>α-Tub1，說明表達最穩定的基因是RPL13-b和H3-b。

圖3 內參基因的表達穩定值Fig.3 The expression stability of internal reference gene

利用geNorm程序分析內參基因的配對差異值Vn/n+1，結果顯示V2/3值最小，為0.267，大于程序推薦值0.15(圖4)，因此需要3個內參基因才能達到校正的目的。

圖4 內參基因的配對差異值Fig.4 The pairing differences of internal reference genes

進一步使用NormFinder軟件對6個內參基因的表達穩定性進行分析，表達穩定值越小基因表達就越穩定。表達穩定值的順序為：α-Tub1>Actin1>H3-b>GAPDH1>EF1-α2>RPL13-b。結果表明，候選內參基因穩定性順序為：RPL13-b>EF1-α2>GAPDH1>H3-b1>Actin1>α-Tub1，RPL13-b的表達穩定值最小(表2)，是表達最穩定的基因。

表2 內參基因的表達穩定值Tab.2 The expression stability of the internal reference genes

使用BestKeeper軟件評估6個候選內參基因表達穩定性，變異系數越小表示穩定性越高，根據BestKeeper軟件計算的變異系數排列順序為：α-Tub1>Actin1>GAPDH1>EF1-α2>H3-b>RPL13-b(表3)，則候選內參基因穩定性順序為：RPL13-b>H3-b>EF1-α2>GAPDH1>Actin1>α-Tub1。結果表明，RPL13-b的變異系數最小，是表達最穩定的基因。

表3 內參基因的變異系數Tab.3 Coefficient of variation in internal reference genes

2.4 內參基因穩定性的驗證

為驗證內參基因的穩定性，在方格星蟲組織試驗體系中分別選擇穩定性排名最高和最低的內參基因RPL13-b和α-Tub1，對免疫球蛋白基因的表達水平進行分析。采用穩定性好的內參基因RPL13-b對實時熒光定量PCR數據進行校準時，免疫球蛋白基因在吻中表達量最高，在其他組織中表達量較低(圖5)。但是采用最不穩定的內參基因α-Tub1對實時熒光定量PCR數據校準時，免疫球蛋白基因表達水平在收吻肌中表達量最高，血淋巴細胞和吻中次之，其他組織均較低。因此，使用不同內參基因標準化免疫球蛋白基因的表達會呈現不同模式。

圖5 不同內參基因校準后的目的基因IgGFc-binding protein在方格星蟲組織中的相對表達量Fig.5 Relative expression level of target gene IgGFc-binding protein in peanut worm S. nudus after calibration with different internal reference genes

3 討 論

3.1 實時熒光定量PCR及內參基因的特性

實時熒光定量PCR是一種靈敏度高、特異性強、重現性好的常用的基因表達分析方法[17-18]，但是容易受到試驗中多種變量的影響，需要選定合適的內參基因作為校正，內參基因即內部參照基因，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測基因的表達水平變化時常以其作為參照物。但是在所有試驗條件下普遍適用的內參基因基本不存在[19]，董曉麗等[20]在小鼠研究中發現，同一個體不同組織中基因的表達穩定性會不同；鮑相渤等[21]在蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)的相關研究中發現，在不同處理條件下基因的表達穩定性存在差異；王忠偉等[22]在籽鵝的相關研究中發現，不同發育時期基因的表達穩定性也會不一樣；因此對內參基因進行評估和篩選是保證試驗結果準確性的必要前提[23]。然而，有關方格星蟲內參基因的研究非常少，張家煒等[24]分別對方格星蟲不同發育時期卵細胞和全組織的內參基因進行分析篩選，分別得出了18S rRNA和GAPDH基因為最優內參基因的結論。

3.2 方格星蟲內參基因的篩選

本試驗利用實時熒光定量PCR對Actin1、α-Tub1、RPL13-b、EF1-α2、H3-b、GAPDH1共6個候選內參基因在方格星蟲不同組織中的表達情況進行分析，并利用相關統計軟件GeNorm、NormFinder、BestKeeper[25]對這6個候選內參基因進行穩定性分析。結果顯示，RPL13-b基因的表達穩定性最高，這與在尖裸鯉(Oxygymnocyprisstewartii)[26]和鱖(Sinipercachuatsi)[27]中的研究結果一致，篩選出RPL13基因為適宜內參基因。而費越越等[28]發現，在健康異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)的不同組織中，EF1-α2基因表達最為穩定；吳萍等[29]在鱖的研究中發現，18S rRNA和GAPDH基因的表達最穩定；張家煒等[30]在方格星蟲全組織中篩選出TATA結合蛋白TBP(1)基因為實時熒光定量PCR的最適單內參基因。這可能是選擇不同物種和不同內參基因導致的結果。

3.3 內參基因的穩定性分析

geNorm與NormFinder軟件的算法相似[31]，都是通過比較平均表達穩定值的大小來進行候選內參基因的穩定性評價，表達穩定值越小表示越穩定。geNorm可以引入1個新的內參基因的配對差異值V，根據配對差異分析Vn/n+1來確定最合適的內參基因數量。當Vn/n+1<0.15時，最適內參基因數為n；當Vn/n+1>0.15時，最適內參基因數為n+1[32]。本試驗中，V2/3=0.267>0.15，故需要3個內參基因做校正，分別是RPL13-b、H3-b、EF1-α2。BestKeeper軟件直接導入Ct計算標準差和變異系數，比較標準差和變異系數的大小。標準差和變異系數越小，內參基因的穩定性越高。不同軟件計算的穩定性分析不完全一致[33]，但綜合來說，RPL13-b內參基因的表達穩定性高。為了進一步驗證所篩選內參基因的穩定性，使用最穩定的內參基因RPL13-b和最不穩定的內參基因α-Tub1，對免疫球蛋白基因的表達水平進行分析，結果表明使用不同內參基因標準化免疫球蛋白基因的表達呈現不同模式。

4 結 論

本試驗利用實時熒光定量PCR對方格星蟲Actin1、α-Tub1、RPL13-b、EF1-α2、H3-b、GAPDH1共6個候選內參基因在不同組織中的表達情況進行分析，利用統計軟件GeNorm、NormFinder、BestKeeper分析了候選內參基因穩定性，并使用最穩定的內參基因RPL13-b和最不穩定的內參基因α-Tub1，對免疫球蛋白基因的表達水平進行分析，結果表明，RPL13-b基因在方格星蟲各組織中的表達最穩定，可作為方格星蟲的最適單內參基因。