一株耐鹽硅藻杯狀藻的生長和生化組成分析

張 琪，鄭凌凌，李天麗，劉 津，宋立榮

( 中國科學院 水生生物研究所，淡水生態與生物技術國家重點實驗室，中國科學院藻類生物學重點實驗室，湖北 武漢 430072 )

硅藻作為天然水體中的重要初級生產者，是魚、蝦、蟹、貝類等水產品的重要餌料[1]，同時因其富含蛋白質、多不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素(如巖藻黃素)及其他生物活性物質也被廣泛應用于食品和保健品等[2]。與藍藻一樣，硅藻也是沿?；騼汝懜啕}水體中的常見初級生產者[3]。淡水和耕地資源匱乏問題日益制約著我國經濟發展和生態環境，利用我國豐富的海水資源以及大面積待開發利用的灘涂、鹽堿地，是微藻規?；B殖的重要研究和應用方向[4]。大量研究表明，在潮間帶、江河入?？诩胞}田中，鹽度是影響藻類生長的主要因素之一，并且影響胞內理化成分的合成和積累[5-7]。野外和室內試驗研究均顯示，鹽度明顯影響硅藻生長[8]、硅藻外殼形態[9]、細胞大小[10]、光合作用和初級生產力[11]、氧化脅迫響應[12]以及蛋白、碳水化合物和脂質含量等[13]。在利用灘涂或鹽堿地等進行微藻開放式規?；?鹽)水培養時，培養基的補充和蒸發引起培養基鹽度的大幅波動，導致微藻生物量下降和培養困難，造成培養成本上升[2]。因此，篩選出一株在較寬鹽度范圍內生長良好且生化組成相對穩定的耐鹽藻株，將有助于降低培養基鹽度變化帶來的不利影響。

杯狀藻屬 (Craticula) 是一類殼體對稱的雙殼縫硅藻，其殼體常呈披針形或橢圓披針形、兩端呈喙狀或頭狀，隸屬于硅藻綱、舟形藻目、輻節藻科，廣泛分布于各種生境，常見于酸性、堿性、(高)鹽、(超)富營養化等水體[14]，在堿性、微咸和溫暖的水體中有較高的多樣性[15]，甚至在南極地區也有發現[16]。前期從國內不同的淡水、咸水和海洋環境中分離了多株硅藻，初步篩選出一株自國內鹽湖中分離的鹽度適應性廣、生長較快、營養豐富、具有作為新資源開發潛力的杯狀藻 (Craticulasp.)。通過分析不同NaCl水平對杯狀藻細胞生長、光合參數、多糖、可溶性蛋白、總脂以及脂肪酸組成的影響，總結不同NaCl水平下其生理生化變化特性，為該藻株的篩選評價和開發利用提供依據，同時也有助于理解硅藻對鹽脅迫的生理響應以及鹽度變化的適應特性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料杯狀藻由筆者分離純化，并保存于中國科學院淡水藻種庫(FACHB-collection)，藻株編號為FACHB-2450 (圖1)。

圖1 光鏡 (a) 和掃描電鏡 (b)下杯狀藻藻株FACHB-2450的顯微照片Fig.1 Micrographs of Craticula sp. FACHB-2450 by light microscopy (a) and scanning electronic microscopy (b)

1.2 試驗方法

1.2.1 微藻培養方法

培養條件：采用f/2培養基將保藏的藻種活化擴大培養[17]，然后將活化后的藻種置于不同質量分數NaCl培養基中馴化適應。以f/2培養基(NaCl質量分數為3%)為基礎，設置1.5%、3%、6%、9%和12% 5個NaCl質量分數，對硅藻進行培養并開展相關試驗。采用長度為60 cm、直徑為3 cm的柱狀光生物反應器培養，向300 mL藻液通入空氣 (氣體流量為0.4 L/min)，在一側以光照度8000 lx持續照射，溫度(25±1) ℃。藻細胞接種于對數增長期，初始生物量為(0.35±0.03) g/L，培養周期為15 d，每個NaCl質量分數組均設置3個平行。

1.2.2 測定指標

生物量測定：接種后每3 d取5～10 mL一定體積的藻液，置于105 ℃烘箱烘至恒質量的GF-CTM纖維濾膜 (Whatman，UK)上用滅菌的超純水進行洗鹽后進行抽濾，隨后將濾膜置于105 ℃烘箱中24 h烘干至恒質量，取出濾膜待冷卻后稱量質量。利用抽濾前后濾膜的干質量差計算出單位體積生物量(B,g/L)。

B=(m1-m0)/V

式中，V為所取藻液體積(L)，m0為空濾膜烘至恒質量的質量(g)，m1為濾過藻液后濾膜烘至恒質量的質量(g)。

冷凍干燥藻粉制備：清洗并收集不同培養條件下的濕藻泥，放入-80 ℃冰箱中冷凍至結冰，然后用真空冷凍干燥機進行凍干，凍干的藻粉保存于-20 ℃冰箱備用。

葉綠素熒光活性最大光化學轉化效率Fv/Fm測定：在培養的第8天取樣，采用調制式葉綠素熒光儀 (PAM-WATER-ED，Walz，Germany) 進行葉綠素熒光參數的測定。測量前將待測藻液暗適應15 min，先用檢測光照射測量初始熒光F0，再用強飽和脈沖光激發，測量最大熒光產量Fm，Fv/Fm(Fv=Fm-F0)可通過葉綠素熒光儀直接測定。

總脂含量測定及脂肪酸組成分析：參考文獻[18]的方法，取凍干藻粉置于內含磁力轉子的玻璃離心管中，加入10%二甲亞砜—甲醇溶液2 mL，在恒溫磁力水浴鍋中先于50 ℃水浴抽提0.5 h，再重復抽提2次并合并上清液。加入4 mLV(乙醚)∶V(正己烷溶液)=1∶1，冰浴并磁力攪拌0.5 h，再重復抽提2次，并合并上清液。上清液中加入純水6 mL，充分搖勻后，待混合液體分相，將分層后的有機相移至另一玻璃瓶中。上層有機相經氮氣濃縮至近干，轉移濃縮液至已稱量質量的離心管中，氮氣濃縮至恒質量。總脂含量(ω,%)計算公式如下：

w=(m4-m3)/m2×100%

式中，m2為所取凍干藻粉質量(g)，m3為離心管空質量(g)，m4為將有機相濃縮液加入離心管后氮氣濃縮至恒質量的質量(g)。

參考文獻[19-20]的方法，取1 mg提取的總脂樣品，加入2 mL 2%硫酸—甲醇溶液85 ℃烘箱中反應2.5 h進行脂肪酸甲酯化，再加入NaCl飽和溶液和正己烷萃取得到上層有機相，氮氣吹干后，用正己烷定容至1 mL，待色譜檢測。利用Agilent7890A-5975C氣質聯用儀對樣品進行分析，通過標準脂肪酸的峰面積計算得到脂肪酸組成及其含量。

多糖含量測定：參考文獻[21-22]的方法并加以改進，稱取10 mg凍干藻粉后加入適量鋯珠以及0.5 mmol/L H2SO4溶液1 mL于MiniBeadbeater 16振蕩破碎機 (Biospec, USA) 中破碎，使用Centrifuge 5810 R離心機 (Eppendorf，USA) 10 000 r/min(離心半徑7.0 cm)離心2 min后收集上清液，重復加入1 mL 0.5 mmol/L H2SO4溶液振蕩破碎離心收集上清液5次。將藻渣重新與上清液混合在一起置于恒溫磁力攪拌器中，100 ℃水浴攪拌4 h，3000 r/min(離心半徑11.5 cm)離心5 min，將上清液轉移至容量瓶中定容。取上清液1 mL加入2.5 mL濃H2SO4和0.5 mL 6%苯酚，混合均勻，冷卻至常溫后于490 nm波長下測定吸光度。利用葡萄糖為標準品測量出的數據制作標準曲線，利用標準方程計算出上清液多糖質量濃度，最終得到多糖含量(w1，%)。

w1=ρ×V1/m5×100%

式中，ρ為上清溶液多糖質量濃度(g/L)，V1為定容后的上清液體積(L)，m5為所取凍干藻粉質量(g)。

可溶性蛋白含量測定：可溶性蛋白提取方法參考文獻[22-23]的方法，稱取10 mg凍干藻粉后加入適量鋯珠以及400 μL RIPA裂解液 (碧云天)在振蕩破碎機中破碎，10 000 r/min(離心半徑7.0 cm)離心2 min后收集上清液。在藻渣中加入少量0.5 mmol/L NaOH溶液潤洗、收集藻渣并重新與上清液混合。加入0.5 mmol/L NaOH溶液5 mL至上述收集的溶液中，然后置于80 ℃水浴30 min，3000 r/min(離心半徑11.5 cm)離心5 min收集上清液，反復抽提若干次直至完全后定容。使用Pierce?BCA Protein Assay Kit蛋白定量分析試劑盒 (Thermo Scientific，USA) 通過Lowry法測定蛋白提取液，以牛血清白蛋白作為標準物，根據測定的標準曲線計算蛋白含量。

1.3 數據處理

采用Excel 2010軟件對數據進行處理和制圖，并用SPSS 17.0統計軟件進行差異顯著性分析。

2 結 果

2.1 不同質量分數NaCl對杯狀藻生長的影響

杯狀藻在NaCl質量分數為1.5%、3%、6%、9%和12%時的生物量隨時間變化的曲線見圖2。在整個培養周期中，杯狀藻的生物量均呈現逐漸增加的趨勢，但生長速率隨NaCl質量分數增加而呈現先升后降的趨勢，按生物量大小排序依次為6%、3%、1.5%、9%和12%質量分數組。在NaCl質量分數為6%時，藻細胞生長最快，培養結束時生物量和生物量產率分別為1.79 g/L和95.33 mg/(L·d)；在NaCl質量分數為12%時，藻細胞的生長受到明顯抑制，培養結束時生物量和生物量產率分別為0.69 g/L和22.78 mg/(L·d)。

圖2 不同質量分數NaCl下杯狀藻生物量的變化Fig.2 Biomass of Craticula sp. FACHB-2450 under different NaCl mass fractions

2.2 不同質量分數NaCl對杯狀藻最大光化學轉化效率Fv/Fm的影響

對培養第8天處于對數生長期的杯狀藻最大光化學轉化效率Fv/Fm進行測定。結果表明，隨著NaCl質量分數的升高，該藻的最大光化學轉化效率Fv/Fm呈現先升后降的趨勢(圖3)。在NaCl質量分數為3%時，該藻Fv/Fm值最高，達到0.63；而在NaCl質量分數為12%時，Fv/Fm值最低，降至0.40。

圖3 不同質量分數NaCl對杯狀藻最大光化學轉化效率Fv/Fm的影響Fig.3 The effect of different NaCl mass fractions on maximum photochemical efficiency Fv/Fm of Craticula sp. FACHB-2450標有不同小寫字母表示差異顯著(P< 0.05)，下同.The means with different letters are significantly different (P< 0.05); et sequentia.

2.3 不同質量分數NaCl對杯狀藻多糖、可溶性蛋白和油脂含量的影響

經培養15 d后，對不同質量分數NaCl培養條件下的杯狀藻多糖、可溶性蛋白和油脂含量進行測定。結果表明，隨著NaCl質量分數的升高，該藻的多糖含量呈現先升后降的趨勢 (圖4)。在NaCl質量分數為6%時，該藻的多糖含量最高，為藻細胞干質量的9.96%；而在NaCl質量分數為12%時，多糖含量降至最低，僅為藻細胞干質量的7.01%。該藻的可溶性蛋白含量在NaCl質量分數為1.5%、3%、6%和9%時差異不顯著，分別為藻細胞干質量的23.60%、22.78%、23.65%和23.29%；而在NaCl質量分數為12%時，可溶性蛋白含量顯著降低，僅為藻細胞干質量的8.39%(P<0.05) (圖5)。隨著NaCl質量分數的升高，該藻的油脂含量呈現先升后降的趨勢 (圖6)。在NaCl質量分數為3%時，該藻的油脂含量最高，達到藻細胞干質量的32.46%；而在NaCl質量分數為12%時，油脂含量降至最低，為藻細胞干質量的22.09%。

圖4 不同質量分數NaCl下杯狀藻的多糖含量Fig.4 Polysaccharides content of Craticula sp. FACHB-2450 under different NaCl mass fractions

圖5 不同質量分數NaCl下杯狀藻的可溶性蛋白含量Fig. 5 Soluble proteins content of Craticula sp. FACHB-2450 under different NaCl mass fractions

圖6 不同質量分數NaCl下杯狀藻的總脂含量Fig.6 Total lipid content of Craticula sp. FACHB-2450 under different NaCl mass fractions

2.4 不同質量分數NaCl對杯狀藻脂肪酸組成的影響

經培養15 d后，對不同質量分數NaCl條件下杯狀藻脂肪酸組成的分析結果顯示(表1)，微藻細胞內主要的脂肪酸為肉豆蔻酸(C14:0)、棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、棕櫚油酸(C16:1)、油酸(C18:1)和二十碳五烯酸(C20:5)等。棕櫚油酸 (C16:1)占總脂肪酸含量的30.17%～43.75%，在低質量分數NaCl組相對占比較高。棕櫚酸 (C16:0) 占總脂肪酸含量的22.53%～31.45%，隨著NaCl質量分數的增加呈現先升后降的趨勢，在NaCl質量分數為6%時占比最高。二十碳五烯酸 (C20:5)占總脂肪酸含量的14.79%～20.92%，隨著NaCl質量分數的增加也呈現先升后降的趨勢，在NaCl質量分數為9%時占比最高。

表1 不同質量分數NaCl條件下杯狀藻的脂肪酸組成(占總脂肪酸的比例) %Tab.1 Fatty acid composition (percent of total fatty acids) of Craticula sp. FACHB-2450 under different NaCl mass fractions

3 討 論

3.1 不同質量分數NaCl對杯狀藻生長的影響

硅藻主要生活在淡水、微咸水、海水乃至高鹽水體(>30)中，可以適應較寬鹽度范圍的生境[24]。但不同的硅藻種類具有各自的鹽度需求，特定的硅藻類群偏好特定的鹽度環境。鹽度變化可以影響微藻的生長、形態和生理生化特性。為了響應鹽脅迫，微藻可以通過積累脂類 (如脂肪酸、甘油)、碳水化合物 (如葡萄糖等單糖以及蔗糖、海藻糖等雙糖) 和蛋白類 (如谷氨酸和脯氨酸等自由氨基酸)等具有調節滲透壓功能的有機化合物，利用反滲透物質調節滲透壓，防止細胞質壁分離[25-26]。

本試驗中，所用杯狀藻鹽度適應范圍比較廣，在NaCl質量分數為1.5%～12%時均能生長 (在NaCl質量分數為6%時生長最快)，但是過高或過低質量分數NaCl均會抑制生長。一些硅藻區系研究表明，許多發現于高鹽生境中的硅藻物種也可以生活在海洋或咸水環境中，可以在較寬的鹽度條件下生長[27-29]。廣鹽性是生活在高鹽生境中的硅藻對環境鹽度變化的一種適應方式[30-31]。已有的研究表明，微藻在鹽脅迫條件下耗費了大部分能量用于維持細胞膨壓和抵御滲透壓，而不是用于支持生長[25,32]。本試驗結果同樣也支持了鹽脅迫會降低微藻生物量產率的觀點[33]。最大光化學轉化效率Fv/Fm表示光合系統PSⅡ的最大光化學量子產量，即PSⅡ的原初光能轉換效率[34]。在非脅迫條件下Fv/Fm值變化較小，但在脅迫條件下Fv/Fm值會有不同程度的下降，這是一個反映微藻生長環境良好與否的重要參數[35]。在本試驗中，過高或過低質量分數NaCl均會造成Fv/Fm值下降，表明藻株處于不佳的生長狀態。該藻株在NaCl質量分數為6%時生長最快，而在NaCl質量分數為3%時Fv/Fm值最高，其原因可能是最大光化學轉化效率不能完全反映或嚴格對應不同鹽脅迫條件下藻株生長的變化。盡管如此，隨著NaCl質量分數的升高，這兩個指標均呈現出先升后降的趨勢。鹽脅迫導致了光合活性下降從而引起微藻生長和生物合成所需的光合作用產物的減少，因此Fv/Fm參數可以用于快速評價不同微藻品種對鹽脅迫的適應性，也可作為預測在鹽脅迫條件下生物量產率變化的參考指標[2,36]。

3.2 不同質量分數NaCl對杯狀藻生化組分的影響

微藻可以改變體內的細胞生化組成以響應鹽脅迫環境。BenMoussa-Dahmen等[37]對亞熱帶雙眉藻(Amphorasubtropica)的研究表明，隨著NaCl濃度由0.25 mol/L升至5.00 mol/L，硅藻碳水化合物含量呈現出先升后降的趨勢。這種變化趨勢與本試驗結果一致。高鹽環境可能限制了碳水化合物的累積或消耗更多碳水化合物提供額外能量以抵御鹽脅迫[2,38]。過高或過低鹽度均會導致蛋白含量降低，其原因可能是鹽脅迫條件下藻類生長受到抑制[37,39]。劉梅等[1]研究表明，在鹽脅迫下，如果藻細胞的光合作用并未受明顯抑制，其蛋白質含量也無變化。本試驗結果表明，在NaCl質量分數為1.5%～9%時，杯狀藻藻株的可溶性蛋白含量無明顯變化，但在NaCl質量分數高于12%時，可溶性蛋白含量和光合活性均有明顯下降且生長受到嚴重抑制。依據硅藻種類和試驗條件不同，細胞脂肪含量和組成在鹽度水平變化后發生相應的改變[12,40]。本試驗結果表明，當鹽含量升至一定值時，該藻株的脂肪含量也隨之增加；但當鹽含量超過一定值時，脂肪含量反而會降低[41-42]。許多藻類可以在不利條件下傾向于通過改變脂質合成途徑形成和積累游離脂肪酸來貯存脂質而不是形成結構脂類化合物[41,43]。研究表明，脂肪合成相關基因的表達 (如脂肪合成的關鍵基因乙酰輔酶A合成酶)在鹽脅迫下明顯上調，因此適度的鹽脅迫有利于脂肪的形成[44-45]。但在較強鹽脅迫條件下藻類脂肪含量降低，其可能原因是在鹽脅迫條件下藻類增強了呼吸作用并消耗貯存的脂類物質為這一過程提供額外能量來源[2]。已有的研究表明，硅藻的主要脂肪酸為肉豆蔻酸(C14:0)、棕櫚酸(C16:0)、棕櫚油酸(C16:1)和二十碳五烯酸(C20:5)[46]，這與本試驗結果基本一致。生物柴油中最為常見的C16和C18脂肪酸，如棕櫚酸 (C16:0)、棕櫚油酸 (C16:1)、硬脂酸 (C18:0)、油酸(C18:1)。在不同質量分數NaCl下，杯狀藻藻株C16和C18脂肪酸含量占總脂肪酸含量的73.60%～80.57%。高鹽或低鹽脅迫條件下，亞熱帶雙眉藻、鹽生杜氏藻 (Dunaliellasalina)和杜氏藻 (Dunaliellasp.) 細胞中不飽和脂肪酸的含量會下降[37,47]。與前述研究結果相似，該杯狀藻多不飽和脂肪酸含量隨NaCl質量分數的增加呈現先升后降的趨勢，在NaCl質量分數為6%時最高。該藻株中主要的多不飽和脂肪酸組分為營養價值較高的二十碳五烯酸(C20:5)，最高可占總脂肪酸含量的20.92%。脂肪酸對于水產養殖動物的生長發育至關重要。多不飽和脂肪酸是海水仔魚、蝦蟹貝幼體的必需脂肪酸，關系到仔魚和幼體的生長和存活[48-49]。有研究表明，在飼料中添加富含多不飽和脂肪酸的微藻粉可以降低幼魚的血脂水平和脂肪沉積，促進蛋白質合成，有利于幼魚的生長發育[50-51]。因此，杯狀藻FACHB-2450可以作為生物餌料進行大量培養，為水產動物幼體提供豐富的必需脂肪酸二十碳五烯酸。

4 結 論

本試驗分離得到一株耐鹽的杯狀藻FACHB-2450，其在NaCl質量分數為6%時，藻細胞生長最快，在培養末期生物量達1.79 g/L，多糖含量可達細胞干質量的9.96% (NaCl質量分數為6%)，可溶性蛋白量占細胞干質量的23.65%且在較寬鹽度范圍下含量變化不大，總脂含量可達細胞干質量的32.46% (NaCl質量分數為3%)，二十碳五烯酸(C20:5) 含量可占總脂肪酸含量的20.92%(NaCl質量分數為9%)。

試驗結果初步表明，杯狀藻FACHB-2450是一株可以適應高鹽環境且在較寬的NaCl質量分數范圍內均可較好生長的硅藻藻株，其富含油脂、多不飽和脂肪酸二十碳五烯酸和蛋白。該藻株能夠廣泛培養在半咸水(如河口、咸水湖泊)、海水甚至高鹽(如鹽堿灘涂)生境中，可以作為水產動物育苗用的餌料微藻或綜合開發高值產物的潛在優良藻株。

致 謝

感謝中國科學院水生生物研究所藻種資源與藻類毒理學學科組盧哲博士在生化組分測定試驗方法上給予的幫助，以及公共技術服務中心左艷霞高級工程師在脂肪酸分析過程中給予的技術支持。