不同來源殺鮭氣單胞菌毒力因子的比較基因組學研究

郝婧薇，王 藝，賀鳳蘭，傅松哲，申旭東,5，劉 鷹

( 1.大連海洋大學 海洋科技與環境學院，遼寧 大連 116023； 2. 大連海洋大學，設施漁業教育部重點實驗室，遼寧 大連 116023； 3.河北科技師范學院 海洋資源與環境學院，河北 秦皇島 066000； 4.南昌市疾病預防控制中心，江西 南昌 330038； 5.中國水產科學研究院 營口增殖實驗站，遼寧 營口 115004 )

殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicid)是一種嗜冷性革蘭氏陰性菌，是氣單胞菌屬少數不運動的菌株之一，在全球均有分布且宿主范圍廣泛，它包括殺鮭亞種(A.salmonicidassp.salmonicida)、無色亞種(A.salmonicidassp.achromogenes)、殺日本鮭亞種(A.salmonicidassp.masoucida)、史密斯亞種(A.salmonicidassp.smithia)和溶果膠亞種(A.salmonicidassp.pectinolytica)這5個亞種[1]，其中殺鮭亞種是鮭鱒魚類養殖過程中的重點防控病原。但近年來研究發現，殺日本鮭亞種也會造成鮭鱒魚類大面積死亡[2]。殺鮭氣單胞菌不但會感染鮭鱒魚類，還會引起非鮭鱒魚類感染，主要表現為皮膚感染(皮膚潰瘍)，如鯉(Cyprinuscarpio)上皮和真皮出現潰瘍[3]，仿刺參(Apostichopusjaponicus)表皮出現潰瘍[4]等。對16S rDNA序列的遺傳研究發現，不同亞種之間的基因組序列高度相似，且有研究表明，殺鮭氣單胞菌可以由淡水轉移到海水，反之亦然[5]。

為對比不同來源的殺鮭氣單胞菌之間毒力基因的差異，筆者選擇3種來源的4株殺鮭氣單胞菌進行比較基因組學研究，包括1株分離自遼寧營口凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)養殖水體的殺鮭氣單胞菌YK-48[6]，1株自遼寧鞍山患病金魚(Carassiusauratus)病灶處分離的殺鮭氣單胞菌AS.17[7]，以及2株自山東煙臺大西洋鮭(Salmosalar)肝臟分離的殺鮭氣單胞菌S68和S121[8]。首先對YK-48進行了全基因組測序和表征，隨后將其與其他3株已測序的殺鮭氣單胞菌進行基因組學比較，并通過系統發育、耐藥基因和毒力基因的分析，將NCBI數據庫中的致病性氣單胞菌與分離菌株進行比較，以探明其在進化上的關系，旨在為殺鮭氣單胞菌毒力基因和流行特征研究提供參考，并為其防控積累參考數據。

1 材料與方法

1.1 菌株分離

殺鮭氣單胞菌菌株YK-48于2019年分離自遼寧營口大遼河入海口的凡納濱對蝦養殖水體[6]，AS.17(登錄號：SAMN10245534)于2017年分離自病死金魚[7]，S68(登錄號：SAMN07276873)和S121(登錄號：SAMN07276469)[8]于2015年分離自煙臺大西洋鮭養殖場。除YK-48外，其他菌株均造成了養殖動物的大規模病害。分離株置于25%的甘油-LB肉湯中，-80 ℃保存備用。

1.2 細菌形態、菌落特征與理化特性檢查

取純化后菌株移接于LB瓊脂斜面，28 ℃培養24 h，隨后制備成涂片標本，通過革蘭氏染色法鏡檢觀察細菌形態特征；取純化后菌株，分別接種于LB瓊脂、哥倫比亞血瓊脂平板及致病性嗜水氣單胞菌鑒別培養基(青島海博公司)，28 ℃培養24 h，觀察生長狀況及菌落形態特征；取純化后菌株，參照《常見細菌系統鑒定手冊》[9]及《人及動物病原細菌學》[10]對菌株的葡萄糖、氧化酶、脲酶等理化特性進行測定。

1.3 藥物敏感性測定

取培養 48 h 后的菌株，以無菌生理鹽水制成菌懸液，使用K-B法對菌株進行20種抗菌藥物敏感性測定，取50 μL菌懸液涂布于HM平板上，將抗生素紙片(杭州濱合微生物試劑公司)貼于培養基表面，每個平板上5種抗生素，倒置培養24 h后記錄紙片周圍抑菌圈直徑，以抑菌圈直徑大小作為敏感與耐藥的判定指標[11]。

1.4 全基因組測序

取純化菌株接種于LB瓊脂培養基，28 ℃培養12 h，使用細菌基因組DNA小量純化試劑盒(大連寶生物工程技術有限公司)，按照NO.9763說明書進行菌株全基因組DNA提取，作為PCR模版。通過瓊脂糖凝膠電泳和光密度值測定鑒定DNA質量。經DNA電泳檢測、Qubit 2.0總量檢測合格后，將DNA樣品用Covarisg-TUBE打斷成構建文庫所需大小的目的片段，使用DNA黏合酶將發卡型接頭連接在DNA片段兩端，使用AMpurePB磁珠對DNA片段進行純化選擇，構建SMRTBell文庫。隨后將樣品送往京通生物科技有限公司，使用PacBioRSII平臺進行測序。將Pacbio獲得的下機數據使用HGAP4[12]，CANU (V1.6)[13]軟件進行拼裝，得到scaffold序列。最后使用Pilon (version 1.22)[14]軟件對結果進行校正，最終拼接得到完整序列。測序數據已上傳至GenBank，登錄號：SAMN10245535。

1.5 基因組系統發育分析

總共分析38株殺鮭氣單胞菌，其中包括從NCBI數據庫中獲得的25株公共基因組和1株本試驗測序菌株。以A449基因組作參考基因組，分析單核苷酸多態性(SNP)。首先使用Center for genomic epidemiology (https://www.genomicepidemiology.org/)進行單核苷酸多態性分析。具體的操作步驟為：使用Burrows-Wheeler的BWA比對工具將其他菌株的基因組與參考基因組進行比對得到基因圖譜，再使用SAMtools進一步過濾掉低質量序列(質量得分<30或覆蓋<10片段)。序列經過濾后，從34個基因組中總共鑒定出4912個單核苷酸多態性位點，其中位于重復區域的單核苷酸多態性位點被去除。使用RAxML (版本7.2.8)，以最大似然法構建系統進化樹。

1.6 毒力基因的注釋與分析

將基因組DNA和NCBI數據庫中的基因組數據上傳至毒力因子數據庫(VFDB)，通過 VFDB中的 VFanalyzer進行毒力基因與供試菌全基因組的雙序列比對，尋找其是否含有相關的毒力基因。

1.7 耐藥基因分析

進行藥物敏感性測試后，結合ResFinder (https:∥cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)查找殺鮭氣單胞菌的耐藥基因，查看其是否含有相關耐藥基因。

1.8 細菌黏附性的測定

細菌黏附試驗參考文獻[15-16]。先將人喉表皮樣癌細胞(Hep-2細胞)培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液的24孔細胞培養板中傳代。將傳代好的Hep-2細胞以每孔8×104個細胞鋪于24孔組織培養板中并生長24 h。使用無菌10 mmol/L磷酸緩沖鹽溶液洗滌除去未附著的單層細胞，然后加入400 μL無酚紅的MEM。

制備成牛血清的寡營養培養基(Serum-SAPI)：6.25 mmol/L NH4NO3，1.84 mmol/L KH2PO4，3.35 mmol/L KCl，1.01 mmol/L MgSO4和2.77 mmol/L葡萄糖，加入30%體積的成牛血清(Biological industries，以色列)，以模擬宿主體內環境，配制好后將pH調至7.5，并過濾除菌。殺鮭氣單胞菌菌株在上述培養基中以30 ℃生長過夜，隨后用磷酸緩沖鹽溶液洗3次后，重懸菌體。用DMEM將細菌培養物稀釋至600 nm光密度值為0.3，然后使用殺鮭氣單胞菌菌株以10的感染復數(MOI)感染Hep-2細胞。將平板以600 r/min(離心半徑15 cm)離心 10 min，并于5% CO2濕化培養箱中37 ℃孵育2 h。隨后，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細胞5次，加入0.02% Triton X-100裂解。通過連續稀釋在LB瓊脂平板上平板計數[16]。所有試驗重復5次。

1.9 統計學分析

所有試驗結果以平均值±標準差表示。使用SPSS 17.0對所有試驗數據單因素方差分析，若差異顯著，則進行Duncan′s多重檢驗，顯著水平為0.05。

2 結 果

2.1 菌落形態及基本特征

菌株YK-48在NA平板上生長的菌落均呈圓形，淡黃色，直徑約1 mm，無運動能力。對菌株進行的理化分析(36種)發現，YK-48對甲基紅、D-葡萄糖產酸、麥芽糖、氧化酶、半乳糖、D-甘露醇、硝酸鹽還原性、0% NaCl下生長、1% NaCl下生長、V-P反應、海藻糖和L-阿拉伯糖(共12種)呈陽性(表1)。將16S rDNA的結果在NCBI數據庫中進行BLAST序列同源性檢索，結果表明，YK-48與殺鮭氣單胞菌A449的同源性為97.52%，結合16S rDNA BLAST分析和生理生化試驗結果，可以確定病原菌為殺鮭氣單胞菌。為進一步確定亞種類型，對殺鮭氣單胞菌YK-48進行全基因組測序。

表1 分離菌株的生理生化特性Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of the isolates

2.2 基因組基本特征

全基因序列分析，YK-48的基因組序列總長度為 4 751 295 bp，GC含量為60.6%，基因數量為4431個，RNA數量為144個，并對基因組序列，基因預測及非編碼RNA的預測信息進行整理(圖1)。對YK-48進行注釋，發現其含有4276條預測蛋白，占總蛋白數的90.39%。YK-48的可編碼序列(CDS)根據相鄰蛋白的聚簇(COG)可分為21個已知功能組，4個未檢測出預測蛋白組和直系同源蛋白分組比對(eggNOG)數據庫內無對比結果組1個，共26個組。功能分類結果見圖2。

圖1 殺鮭氣單胞菌菌株 YK-48 基因組環狀圖譜Fig.1 Genome circular map of A. salmonicida strain YK-48從內到外，第1圈代表刻度；第2、3圈分別代表負鏈和正鏈可編碼序列在基因組上的位置；可編碼序列在基因組正向鏈中.From the inside to the outside, the first circle denotes the scale; the second circle and the third circle denote the CDS in the reverse and forward strand, respectively; the CDS is located in the forward strand on the genome.

圖2 菌株YK-48基因組中預測蛋白的相鄰蛋白聚簇功能分類Fig.2 Classification of cluster of orthologous groups of proteins(COG) functions of bar protein predicted by strain YK-48 genome

2.3 系統發育分析

使用廣義時間可逆核苷酸取代模型和速率異質性的γ模型下構建殺鮭氣單胞菌的系統發育關系，生成一個最大似然樹，自舉值為100。系統發育顯示，38個殺鮭氣單胞菌基因組共分為5個簇(圖3)，每一個簇對應一個亞種。對于本試驗中的4株殺鮭氣單胞菌，S68和S121與其他日本鮭亞種聚為一類，而AS.17、YK-48和殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種A449菌株聚為一類，與其他3個亞種親緣關系較遠，具有相對較遠的遺傳距離。由于AS.17和YK-48只有3個單核苷酸多態性位點的差異，因此可認定AS.17和YK-48為相同亞型中的同一克隆群。

圖3 殺鮭氣單胞菌基因組的系統發育關系Fig.3 Phylogenetic relationship of A. salmonicida genomes圖3為殺鮭氣單胞菌基因組的最大可能性系統發育，比例尺表示每個可變位點的取代.Fig.3 is the maximum likelihood phylogeny of A. salmonicida genomes,and the scale bar denotes substitutions per variable site.

2.4 毒力基因分析

對38株殺鮭氣單胞菌基因組進行VFdb注釋，對38個大類毒力相關基因進行篩選后，選擇27種出現差異的毒力因子進行比較，對S68、S121、YK-48和AS.17之間毒力基因進行差異分析。YK-48和AS.17含有27種毒力因子中的59.26%(16/27)，S68和S121含有51.85%(14/27)。與S68和S121相比，YK-48和AS.17缺少與黏附功能相關的基因FLP IV型連接相關(flp1) 基因、鞭毛外側(flgC)基因和T3SS分泌系統相關(acr1)基因，而含有多熱穩定性O抗原(脂多糖)(orfM)基因、卷曲纖維(csgG)基因、毒力加強(rtxA)基因、抗吞噬作用相關的莢膜多糖(rmlA)基因和免疫逃逸相關莢膜基因(圖4)。

圖4 殺鮭氣單胞菌基因組毒力基因分析Fig.4 Virulence gene profile of A. salmonicida strains紅色代表基因缺失，藍色代表基因存在；下同.The missing gene is shown in red color, and the present genes are indicated by blue color; et sequentia.

在細胞黏附試驗中，將S121的細胞黏附力定義為100%，以此為基準表征其他3株菌的黏附力。結果表明，YK-48和AS.17的黏附力顯著低于S121和S68。因此，也進一步驗證了YK-48和AS.17缺失黏附相關基因帶來的表型變化。

2.5 耐藥性和耐藥基因分析

對YK-48進行藥物敏感性測試表明，其對萘啶酸、洛美沙星、壯觀霉素、氧氟沙星和環丙沙星高度敏感，對新霉素、紅霉素、慶大霉素、妥布霉素、鏈霉素、復方磺胺甲惡唑和四環素中等敏感，對桿菌肽、萬古霉素和青霉素耐藥，由于YK-48對利福平低度敏感，因此認為其對利福平耐藥(表2)。通過ResFinder對9大類抗生素的耐藥基因進行分析，除去全部含有和全部不含有的基因發現，89.47%(34/38)的菌株含有β-內酰胺類抗生素耐藥基因(共6種)；23.68%(9/38)的菌株含有磺胺類抗生素耐藥基因(共2種)；

表2 YK-48對17種抗生素的藥物敏感性Tab.2 Antimicrobial sensitivity of strain YK-48 to 17 kinds of antibiotics

圖5 S121、S68、YK-48和AS.17的細菌黏附性Fig.5 Bacterial adhesion of strains S121, S68, YK-48 and AS.17

18.42%(7/38)的菌株含有氨基糖苷類抗生素耐藥基因(共8種)；15.79%(6/38)的菌株含有大環內脂類抗生素耐藥基因(共3種)；21.05%(8/38)的菌株含有四環素類抗生素耐藥基因(共5種)(圖6)。

圖6 殺鮭氣單胞菌基因組的耐藥基因分析Fig.6 Analysis of drug resistance genes of A. salmonicida strains

3 討 論

殺鮭氣單胞菌分布地域廣泛，宿主眾多，是多種水生動物的原發性疾病病原，每年由殺鮭氣單胞菌造成的經濟損失十分嚴重[17]。筆者對自患病金魚和凡納濱對蝦養殖水體中分離出的殺鮭氣單胞菌進行了常規的生物學性狀檢驗，包括形態特征、生理生化特性等表型，結合基因組測序結果分析發現，AS.17和YK-48的基因組遺傳特征極為相似。系統發育分析顯示，AS.17和YK-48位于同一進化分支，由此推測他們有一定的同源性。養殖魚類疾病暴發后，養殖尾水排放到環境中，未經處理的養殖尾水可能會流入養殖場附近的河水中，病原菌株很可能會順著河水向下游傳播，從而引起沿河養殖區域的流行性病害。YK-48與AS.17出現的地理位置相近，可能來自同一源頭。因此，對AS.17和YK-48進行實時監控及有效地防治，控制病源外溢，是亟待解決的重大問題。

3.1 殺鮭氣單胞菌的黏附能力可能會影響殺鮭氣單胞菌的毒力

毒力因子往往是殺鮭氣單胞菌致病的最主要因素。在AS.17和YK-48中均預測到122個毒力因子，但與自大西洋鮭中分離的2株菌株相比，均缺少黏附性、抗吞噬性以及免疫逃逸相關等毒力因子。有研究表明，由于毒力因子的溶血性和細胞毒性的存在，導致患疥瘡病魚類的胃腸中出現無食、少食、充滿黏液、實質性組織點狀出血，以及鱗片脫落和臟器外漏等癥狀[18-19]。YK-48和AS.17與其他菌株相比，缺少與黏附功能相關的基因flp1基因，這表明可能菌株YK-48和AS.17黏附功能較弱。

為了驗證這一點，對4株菌株進行了黏附力試驗。判斷病原在宿主的黏附力需要在嚴格模擬宿主體內環境的條件下才能更好地體現，如極低的初始接種量(102cfu/mL)、CO2(5%)培養環境、寡營養的生長條件(SAPI培養基)以及成年牛血清的添加。為了盡可能還原殺鮭氣單胞菌在宿主體內的黏附情況，使用了SAPI培養基，結果證實，缺失與黏附功能相關基因的YK-48和AS.17，在模擬宿主環境下黏附功能較弱。然而，Jin等[7]前期研究表明，AS.17也可造成觀賞魚的大規模病害，表明黏附功能可能不是造成致病性的決定性因素。由于觀賞魚和大西洋鮭均在高密度養殖條件下進行養殖，因此，養殖動物可能均受到脅迫，有可能黏附功能較弱的菌株也具備一定的致病性。

3.2 YK-48出現耐藥基因的原因

對YK-48進行全基因組測序，在此基礎上確定流行株的主要類型及特征。對測序結果進行分析發現，分離株在基因組結構、耐藥基因等多方面幾乎一致，推斷YK-48很可能來源于上游觀賞魚養殖尾水排放。而與菌株AS.17和YK-48相比，來自煙臺大西洋鮭分離的2株菌株含有氟苯尼考、恩諾沙星和四環素相關的耐藥基因。這可能與養殖過程中抗生素的使用情況有關。前期調研發現，在觀賞魚和對蝦養殖過程中，未使用抗生素[7]；而在大西洋鮭養殖過程中，自2014年起氟苯尼考等抗生素連續用于殺鮭氣單胞菌引起的病害防治，從而導致了相關耐藥基因的出現[2]。

近年來，隨著檢測技術的發展，快速檢測殺鮭氣單胞菌的技術越來越多，如根據16S rRNA基因建立的多重PCR方法可以同時檢測出包括殺鮭氣單胞菌在內的3種常見魚類致病菌[20]；還有根據gyrB設計的高靈敏度的PCR檢測技術等[21]。基因組測序成本在不斷降低，通過全基因組測序對水產病原進行分型逐漸代替了其他分子生物學方法，成為水產病原流行病學鑒別方面的“終極”分型方法，隨著測序技術的進步，已測序的水產病原越來越多。就細菌性病原而言，就包括了嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、殺鮭氣單胞菌、嗜冷黃桿菌(Flavobacteriumpsychrophilum)、鮭腎桿菌(Renibacteriumsalmoninarum)、哈維弧菌(Vibrioharveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)和魯氏耶爾森菌(Yersiniaruckeri)等十余種[22]。通過對全基因組數據進行分析，比較不同菌株在全基因組水平單核苷酸多態性位點的差異，對其位點多樣性進行分型，并采用一些生物信息學算法構建不同菌株之間的系統進化關系，已對多個水產病原在全球范圍內的傳播進行了精準分析。

3.3 全基因組的出現為殺鮭氣單胞菌的研究提供有力支持

Brynildsrud等[23]對來自全球的68株引起魚類腎臟壞死的鮭腎桿菌進行了全基因組測序，通過對其基因組單核苷酸多態性的分析，發現其存在2個主要進化譜系，其中譜系1主要分布在大西洋野生魚類中；隨著魚類的遷徙和人類水產貿易的擴大，鮭腎桿菌隨之由北美洲引入英國和挪威，揭示了鮭腎桿菌的跨境傳播機制。Fu等[24]也采用基因組分型的方法對全球100株對蝦相關副溶血性弧菌進行了系統性基因組流行病學分析，結果表明，目前中國、越南、泰國、馬來西亞和墨西哥等地對蝦中分離的副溶血性弧菌菌株分布于6個大類、11個不同的基因組克隆群中。研究結果證明了各國對蝦分離的副溶血性弧菌不存在流行病學關聯，相關疫病在各國獨立發生。

此外，由于全基因組測序數據提供了完整的基因內容，因此可以直接挖掘毒力或抗性基因的數據以預測這些表型。某些移動遺傳元件，如噬菌體、質粒或基因島，通常攜帶增強的毒力或抗生素抗性的基因，可用來確定與關鍵表型特征相關的基因或單個單核苷酸多態性位點，如毒力、抗性或宿主適應基因，并且能夠提供關于關鍵表型性狀的預測信息。

4 結 論

筆者通過比較基因組學探究3種來源殺鮭氣單胞菌之間的進化關系，將藥敏試驗與耐藥基因結合，發現殺鮭氣單胞菌YK-48對利福平、桿菌肽、萬古霉素和青霉素耐藥；對毒力基因進行分析，菌株AS.17和YK-48的毒力基因結果基本一致，與S68和S121相比，AS.17和YK-48特有抗吞噬作用基因和免疫調節相關表達的基因。通過細菌黏附試驗，驗證了菌株YK-48不含黏附相關基因。比較基因組學提供了關于關鍵表型性狀的預測信息。