團頭魴三倍體的微衛星遺傳特征及生長性能分析

李寶玉，鄭國棟，崔文濤，陳 杰，鄒曙明

( 上海海洋大學，農業農村部團頭魴遺傳育種中心，農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306 )

三倍體魚類通常存在減數分裂異常的現象，導致其性腺往往不能正常發育，因此利用其不育特性培育的三倍體品種可以避免養殖逃逸后在自然水域中過度繁殖造成的生態失衡，以及保護自然種群的種質資源，具有環境友好的特性。同時還可以保持品種自身優良性狀，避免保種不當造成的種質衰退。理論上性腺發育異常使三倍體魚類有可能將性腺發育所需能量轉化到魚體生長上，在性成熟時期比二倍體具有一定的生長優勢[1]。實際上對于不同物種，三倍體化的影響并不相同。關于三倍體水產生物的育種，目前已經比較成熟，開展三倍體育種研究較早的物種如虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、大西洋鮭(Salmosalar)、長牡蠣(Crassostreagigas)等已經在生產上得到推廣應用[2-3]。對于三倍體魚類的研究主要集中在誘導方法、生長、生理以及育性等方面，針對遺傳結構的研究較少。Delomas[4]在溪紅點鮭(Salvelinusfontinalis)、大鱗大馬哈魚(O.tshawytscha)不同倍性群體中分別利用擴增子測序進行基因分型，發現三倍體魚類和正常二倍體在SNP位點上存在等位基因數目差異。

微衛星具有多態性好、雜合率高、共顯性遺傳等特點，廣泛應用于水產動物育種研究，多用于比較群體之間的遺傳多樣性差異。如張倩倩等[5]利用18個微衛星標記分析了不同鳊魴魚類群體的遺傳多樣性并繪制了DNA指紋圖譜；徐湛寧等[6]利用20個微衛星位點對2種雌核發育團頭魴(Megalobramaamblycephala)群體的純合性進行了評價。目前，國內外對于利用微衛星標記探究某一物種三倍體和二倍體群體之間的遺傳結構差異的研究較少，主要涉及在微衛星位點開發較為成熟的水產生物上，如劉慧等[7]利用微衛星分子標記對褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)三倍體和二倍體的遺傳結構進行了比較，結果表明三倍體誘導使褐牙鲆的遺傳多樣性有所下降；Hernández-Urcera等[8]利用5個家系的大菱鲆(Scophthalmusmaximus)三倍體和二倍體群體，開發出一個基于微衛星位點的倍性鑒定多重PCR體系，鑒定結果與流式細胞術鑒定結果相近，達到了較高的識別率；通過9個高度多態的微衛星位點，并根據位點的等位基因數目差異，Sanz等[9]在虹鱒上也取得了較好的倍性鑒定結果。團頭魴的微衛星位點開發較為豐富，但利用微衛星標記探究2種倍性遺傳結構差異的研究尚未見報道。

團頭魴是一種草食性淡水魚類，因其管理粗放、抗逆性強，被作為大宗淡水魚類廣泛養殖，2019年養殖產量762 858 t[10]。由于團頭魴性成熟周期長，增加了良種選育的難度，制約了團頭魴養殖業的發展。利用三倍體誘導技術誘導團頭魴三倍體，可以在短時間內實現良種選育，同時探究三倍體化對團頭魴的影響也有助于增進對魚類三倍體的認識。鄒曙明等[11]利用團頭魴四倍體與正常二倍體雜交獲得了團頭魴倍間三倍體，此后張新輝[12]利用冷休克技術誘導獲得了團頭魴三倍體，團頭魴三倍體的研究主要集中在誘導方法和基于倍性鑒定的血細胞形態研究。筆者以靜水壓處理誘導獲得了團頭魴三倍體，選取多態性較高的微衛星位點初步探究團頭魴三倍體和二倍體之間遺傳結構的差異，對團頭魴三倍體1齡至2齡的生長進行對比，以期為團頭魴三倍體遺傳結構研究和培育團頭魴三倍體新品種提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以團頭魴“浦江2號”為親本，父母本均為2齡，性成熟且發育良好。16：00采用人絨毛膜促性腺激素與促黃體素釋放激素A2混合注射進行催產，雄魚注射劑量較雌魚減半。將已經注射過催產藥物的親魚暫養在直徑2 m圓形的產卵池中，流水刺激；翌日清晨拉網起捕親魚，取精、卵進行人工干法授精。將受精卵脫黏后，均勻分成2等份，1份用靜水壓力機(受精后3 min，壓強45 MPa，處理3 min)處理，另1份作為對照，受精卵放入孵化桶中孵化，待魚苗卵黃囊消失，并能夠平游時，將魚苗轉移至4.0 m×6.0 m×1.2 m水泥池進行培育。2種魚在相同養殖條件下培育20 d至體質量約0.5 g、體長2～3 cm時，用1 mL無菌注射器穿刺尾柄處尾靜脈取血約0.5 μL，用800 μL的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染液染色30～60 s后，用流式細胞儀(Partec CyFlow Ploidy Analyser，Germany)檢測倍性。以親本尾靜脈血作為參照，將檢測出的三倍體保留，靜養恢復健康后，足1月齡時用于后續生長對比試驗。

1.2 微衛星分析

1.2.1 基因組DNA的提取

每個群體隨機挑選30尾魚，剪取2種倍性團頭魴的胸鰭鰭條，置于95%乙醇中-80 ℃保存。用海洋動物組織基因組試劑盒(離心柱型，天根生化科技有限公司)提取DNA。完成后檢測濃度，-20 ℃保存備用。

1.2.2 微衛星標記篩選和來源

篩選出20個團頭魴微衛星標記用于2個群體的遺傳結構分析，均能擴增出穩定且清晰的條帶，引物來源均參考文獻[6，13-16]。所用引物序列由生工生物工程(上海)有限公司合成。微衛星位點及引物信息見表1。

表1 團頭魴微衛星引物特征Tab.1 Characteristics of microsatellite primers of blunt snout bream M. amblycephala

1.2.3 PCR反應體系、擴增程序、產物檢測與數據統計

反應總體系為10 μL：5 μL的2×Taq PCR MasterMix(Taq DNA Polymerase：0.1 U/μL； MgCl2：4 mmol/L；dNTPs：各0.4 mmol/L)，上下游引物(10 μmol/L)及模板DNA(30～50 ng)各0.5 μL，3.5 μL ddH2O。反應程序：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 30 s，50～65 ℃(按照表1對退火溫度進行調整)30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。擴增完成后加樣量1 μL，在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行擴增片段的分型，銀染后拍照。2種倍性群體一般顯示為1～2條帶，采用PopGene(Version 1.32)軟件統計遺傳多樣性數據：等位基因數、有效等位基因數、觀測雜合度、期望雜合度；根據Botstein等[17]公式計算哈迪—溫伯格遺傳偏離指數；位點的多態信息含量用軟件PIC-CLC分析。

1.3 養殖試驗和生長性能

隨機選取體質量約0.5 g的健康團頭魴二倍體、三倍體各150尾，將二倍體、三倍體各50尾分為一組，放入1口0.067 hm2土塘中同塘養殖，二倍體剪去一側腹鰭，三倍體不剪鰭，以便區分倍性，共放入3口塘。保證養殖條件相同的條件下，定期換水保證水質清新。日投喂量按照魚體質量1%投喂，根據魚體生長狀況及時調整，日投喂3次，每次投喂同種商品飼料(天邦淡水魚配合飼料，粗蛋白含量28.5%，粗脂肪含量3.0%)。試驗開始時記錄初始體質量，分別在2月齡、3月齡、12月齡及18月齡測量體質量，計算絕對質量增加率。結果使用SPSS 17.0進行分析，數據經方差同質性檢驗不齊性，采用非參數檢驗分析數據之間的差異。絕對質量增加率(RWAG)按下式計算：

RWAG=(m2-m1)/t×100%

式中，m2為終末體質量(g)，m1為初始體質量(g)，t為養殖天數(d)。

2 結果與分析

2.1 團頭魴三倍體的倍性檢測結果

用流式細胞儀檢測倍性，倍性分析結果見圖1，圖中峰對應的橫坐標中值為細胞的相對DNA含量，二倍體為48～54，三倍體為72～81，三倍體血細胞的DNA含量約為二倍體的1.5倍。

圖1 團頭魴二倍體(a)和三倍體(b)細胞DNA相對含量Fig.1 Relative DNA content histograms in erythrocytes of normal diploid (a) and triploid blunt snout bream M. amblycephala (b)

2.2 2種倍性團頭魴群體的SSR擴增結果

使用20個微衛星標記在團頭魴2種倍性群體進行PCR擴增，均能夠獲得穩定、清晰的條帶，在三倍體群體中的擴增效果見圖2，擴增條帶大小175～200 bp。在對擴增結果進行分析后獲得各位點和群體的遺傳多樣性信息(表2)。在2個群體中獲得了66個等位基因，在團頭魴二倍體中擴增獲得了61個等位基因；在團頭魴三倍體中獲得了55個等位基因。每個位點檢測到的等位基因數為1～5個，2種倍性群體的平均等位基因數：二倍體3.05個，三倍體2.75個；平均有效等位基因數：二倍體2.3033個，三倍體2.1859個。二倍體的觀測雜合度、期望雜合度、多態信息含量分別為0～1.0000、0～0.7065、0～0.7058；對應的平均值為0.7783、0.5412、0.4378。三倍體的觀測雜合度、期望雜合度、多態信息含量分別為0.1667～1.0000、0.1554～0.7033、0.1410～0.6993；對應的平均值為0.7900、0.5061、0.4249。

表2 2個群體的遺傳多樣性參數Tab.2 Genetic diversity parameters of two fish groups

圖2 三倍體群體在Me.Am.-15標記中的PAGE分析Fig.2 PAGE diagrams of triploid group amplified by primer Me.Am.-15M.50 bp DNA marker； 1～30.團頭魴三倍體.M.50 bp DNA marker； 1—30.Triploid blunt snout bream M. amblycephala.

2.3 哈迪—溫伯格平衡遺傳偏離指數

對20個位點進行哈迪—溫伯格平衡的卡方檢驗，顯著性經Bonfferin校正后，多數位點偏離平衡，三倍體12個位點均極顯著偏離平衡 ，二倍體14個位點偏離平衡(2個位點顯著偏離平衡，12個位點極顯著偏離平衡)。計算各位點的平衡偏離指數，多數位點出現了雜合子過剩現象(表3)。

表3 哈迪—溫伯格平衡的卡方檢驗概率值(P)與遺傳偏離指數Tab.3 Hardy-Weinberg equilibrium Chi-square test probability value (P) and genetic deviation index

2.4 特異性標記的篩選

為了對團頭魴三倍體和二倍體進行分子鑒定，自20個標記中篩選出可區分2個群體的2個特異性標記TTF1、Mam-EST110(圖3)。TTF1在二倍體群體中的擴增條帶為300～325 bp，三倍體群體中的條帶為260～307 bp；Mam-EST110在二倍體群體中的擴增條帶為210～298 bp，三倍體群體中的條帶為273～315 bp。2個特異性標記在團頭魴三倍體和二倍體中的聚丙烯酰胺凝膠條帶大小存在顯著差異，可順利鑒別三倍體和二倍體種群。

圖3 2個試驗魚群體在2個特異性標記Mam-EST110(a)、TTF1(b)中的PAGE分析Fig.3 PAGE diagrams of 2 fish groups amplified by primers Mam-EST110(a) and TTF1(b)M.DNA markerⅠ; 1～5.團頭魴二倍體; 6～10.團頭魴三倍體.M.DNA markerⅠ; 1—5.diploid blunt snout bream M. amblycephala; 6—10.triploid blunt snout bream M. amblycephala.

2.5 生長對比

2個群體均在相同環境條件下飼養，在2月齡、3月齡、12月齡及18月齡養殖試驗結束時測量試驗魚的體質量，結果見表4。2個群體初始體質量約0.5 g，2月齡團頭魴二倍體、三倍體平均體質量分別為(3.32±0.39)、(3.26±0.45) g；3月齡團頭魴二倍體、三倍體平均體質量分別為(15.71±1.24)、(14.35±0.95) g，二倍體體質量略大于三倍體，但差異不顯著(P>0.05)；12月齡的生長數據顯示，團頭魴二倍體、三倍體平均體質量分別為(392.75±25.99)、(406.30±29.40) g，三倍體體質量略大于二倍體，差異未達到顯著性水平(P>0.05)；18月齡時二倍體體質量以及絕對質量增加率顯著小于三倍體(P<0.05)。結果表明，12月齡之前的三倍體生長速度與二倍體相近，12月齡后三倍體生長速度較二倍體快，表現出明顯的生長優勢。

表4 試驗魚2個群體的生長性能Tab.4 The growth performance in two fish groups

3 討 論

3.1 2種倍性團頭魴的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是生物進化過程中適應環境的結果，是群體中遺傳多樣性信息的總和，能夠在進化過程中維持群體持久性、適應能力[18]。群體的遺傳多樣性主要表現在等位基因數目的豐富度、遺傳雜合度大小和多態信息含量等方面；等位基因數目越多，雜合度越高，多態信息含量越高，群體的遺傳多樣性越豐富[19]。在同一位點處二倍體應有2個等位基因，三倍體魚多出的一套染色體使相應位點存在3個等位基因，理論上三倍體的等位基因數應大于二倍體。然而本試驗中，團頭魴三倍體群體的等位基因數、有效等位基因數稍小于團頭魴二倍體，出現了等位基因缺失的現象。褐牙鲆三倍體上也出現了等位基因缺失的現象，劉慧等[7]認為，這可能與三倍體的誘導方式有關，含有特定等位基因或基因型的個體對低溫處理的條件敏感致死。由于靜水壓處理后的受精卵往往不能全部存活，團頭魴也可能存在對壓力敏感基因或基因型的個體，在處理后死亡。研究表明，受處理條件影響，在經過誘導的魚類中可能會出現染色體丟失的非整倍體或者染色體畸變的個體，導致來自親本的等位基因缺失[20-21]。因此靜水壓處理團頭魴的受精卵阻止第二極體排出的同時，還可能造成受精卵卵核中部分遺傳物質丟失，導致三倍體的等位基因數目減少，遺傳多樣性降低。

雜合度是評價種群遺傳多樣性的重要參數，包括觀測雜合度、期望雜合度。團頭魴三倍體的觀測雜合度為0.7900，大于二倍體的觀測雜合度，觀測雜合度出現了與其他遺傳多樣性指標差異趨勢不一致的現象，相似的現象也出現在褐牙鲆三倍體上[7]。其原因一是觀測雜合度比較容易受到樣本量的影響，這是由其計算方式決定的，觀測雜合度為群體內雜合個體數量與觀察個體數量的比值，而其他的遺傳多樣性指標都是以等位基因頻率為基礎計算的；二是初級卵母細胞在減數第一次分裂時同源染色體的非姐妹染色單體之間由于交叉互換發生基因重組，導致同一條染色體上原本互為復制關系的姐妹染色單體可能攜帶不同的等位基因，壓力處理使次級卵母細胞保留第二極體，致使三倍體雜合的幾率增大。因而在統計時出現了三倍體群體雜合個體數多于二倍體的現象，使得三倍體的觀測雜合度大于二倍體，但差異不明顯，可能與選取的微衛星標記數目少、微衛星標記多態性有限以及樣本群體數量少有關。所以期望雜合度反映的遺傳多樣性信息可信度高于觀測雜合度[18]。本試驗中團頭魴二倍體的期望雜合度為0.5412，徐湛寧等[6]利用20個微衛星標記發現團頭魴正常二倍體群體的期望雜合度為0.6491，略高于本試驗結果。可能是選取的微衛星位點不同以及本試驗中使用的親本為連續多代選育的群體，遺傳多樣性下降。三倍體群體的期望雜合度為0.5061，略低于二倍體群體的期望雜合度，遺傳多樣性水平較二倍體群體低，對褐牙鲆二倍體、三倍體群體的遺傳結構研究出現了相同的現象。這可能是2種魚的三倍體群體都出現了等位基因的缺失，而雜合度等微衛星統計指標是以等位基因頻率為基礎的，等位基因數目下降，導致期望雜合度減小[22]，染色體數目的增加并未使期望雜合度增加。對銀鯽(Carassiusauratusgibelio)以及普通鯽(C.auratusauratus)的研究表明，銀鯽的期望雜合度小于普通鯽[23-24]，與本試驗結果相符。雖然2種鯽的起源存在爭議，但也可能說明三倍體生物的雜合度以及其體現的遺傳多樣性水平不一定高。唐首杰等[25]發現，團頭魴三倍體的雜合度高于二倍體，與本試驗結果相反，這可能與該群體是倍間雜交三倍體有關，在配子產生過程中存在較為頻繁的連鎖互換，傳代過程中等位基因自由組合度增加以及選取的微衛星位點過少。雜合度通常為0.5～0.8，表明群體的遺傳多樣性水平較高[26]，三倍體的期望雜合度為0.5061，表明三倍體團頭魴的雜合度比二倍體低，但遺傳多樣性仍處于較高的水平。

本試驗中，使用20個微衛星位點進行遺傳分析，根據Botstein等[17]對位點多態性的劃分：多態信息含量為0～0.25為低度多態，0.25～0.5為中度多態，大于0.5為高度多態。多態信息含量用來衡量群體內對應位點的遺傳變異程度，其值越大，說明可以提供的遺傳信息越多。三倍體群體、二倍體群體中度多態位點分別有14個和12個，高度多態位點分別有4個和6個，選取的多數位點均可提供較多的遺傳信息。二倍體群體的平均多態信息含量稍高于三倍體。在位點Mam-EST12、Mam-EST85、Mam-EST110上，二倍體群體的多態信息含量大于三倍體，三倍體群體在TTF8的多態信息含量大于二倍體。這說明位點的多態信息含量差異與群體有關，同時，采樣的隨機性以及群體的數量也會對位點的多態性分析結果產生影響[27]。

3.2 哈迪—溫伯格平衡分析

利用20個微衛星標記檢測2個群體的哈迪—溫伯格平衡時，團頭魴二倍體及三倍體群體分別有14、12個位點出現了偏離哈迪—溫伯格平衡的現象。樣本群體小、近交、等位基因突變、無效等位基因、人工選擇均可導致種群基因偏離哈迪—溫伯格平衡[28-30]。在這些偏離平衡的位點中，均表現為雜合子過剩。本試驗中2種倍性群體多數位點表現為雜合子過剩，可能是因為選取的親本數量較少，產生奠基者效應，從而導致連鎖不平衡[31]，也可能是親本雜合度較高，產生的子代雜合度高；三倍體群體雜合子過量還與其保留了來自母本的兩套遺傳物質有差異的染色體有關，多出的一套染色體增加了位點雜合的可能，降低了純合個體的出現機率。

3.3 群體特異性分子標記的篩選

在大菱鲆[8]、長牡蠣[32]以及虹鱒[9]中均已開發出基于微衛星標記的多重PCR倍性鑒別體系，相對于流式細胞術、染色體計數以及血細胞形態比較等倍性鑒別方法具有成本低、操作簡便以及對魚體損傷小的優點。筆者通過隨機挑選個體的方式，從20個多態性分子標記中，篩選獲得了2個具有群體特異性的分子標記TTF1和Mam-EST110，分別可以在2種倍性群體中產生清晰的特異性條帶，并鑒別2種倍性的團頭魴，為開發基于團頭魴的倍性鑒別體系提供參考。

3.4 團頭魴三倍體的生長性能分析

人工三倍體魚類由于染色體組數為奇數，一般表現為減數分裂異常，表現出不育或敗育，通常認為其因此具備生長的優勢。研究表明，多種魚類三倍體生長速度與二倍體魚類相比，表現為階段性特征，在早期幼魚階段生長速度相近，在性成熟后時期，生長速度相對二倍體魚類提高[2]。染色體組數增加不僅影響性腺的發育，進而影響生長速度，還可能對幼魚早期的生長產生影響，表現出高于或低于二倍體的生長速度。有研究表明，60日齡的三倍體鱖(Sinipercachuatsi)就表現出明顯的生長優勢[33]；Byamungu等[34]發現，三倍體奧里亞羅非魚(Oreochromisaureus)幼魚階段生長速度較二倍體慢，因此三倍體魚類在生長上的表現因種而異。即便是同一物種，不同研究者得出的結論也不同，Hussain等[35]通過試驗比較了尼羅羅非魚(O.niloticus)三倍體和二倍體的生長指標，未發現顯著性的群體差異；Soltan等[36]發現，三倍體尼羅羅非魚在生長上優于二倍體，表現出明顯的生長優勢。這可能是魚類三倍體對環境變化較為敏感，適應性較差，因而在不同的養殖條件下生長表現不同，從而造成不同研究者對同一物種的研究結論有分歧[37-39]。因此，對三倍體團頭魴生長的研究分為早期幼魚階段和性腺逐漸開始發育階段，早期幼魚階段由于試驗條件限制只測定了2、3月齡的體質量數據，12月齡團頭魴處于性腺逐漸開始發育階段，測定一次體質量，最后18個月養殖試驗結束測定一次體質量。2種倍性團頭魴群體在3月齡之前的平均體質量以及絕對質量增加率相近，二倍體略高，但差異不顯著(P>0.05)，早期團頭魴三倍體的生長速度低于二倍體，12月齡時三倍體未表現出較快的生長速度，這可能與飼養條件以及魚類自身因素有關，12月齡三倍體的平均體質量略大于二倍體(P>0.05)，但12月齡至18月齡三倍體的絕對質量增加率極顯著大于二倍體。團頭魴三倍體的生長優勢可能與1齡后性腺逐漸開始發育有關，三倍體由于減數分裂異常導致性腺發育異常，相對二倍體能將更多能量用于生長，三倍體的生長優勢逐漸顯現；三倍體在18月齡的平均體質量顯著大于二倍體(P<0.05)，隨著性腺的發育，表現出明顯的生長優勢。綜合18月齡的絕對質量增加率以及平均體質量，團頭魴三倍體的生長優勢較為明顯，具備一定的生產應用價值。

4 結 論

利用20個微衛星標記對2種倍性團頭魴的遺傳結構進行了分析，群體之間雖然在遺傳多樣性信息上有差異，但未達到顯著性的水平；可能與研究采用的微衛星位點多態性不高、無效等位基因的干擾有關。另外，聚丙烯酰胺凝膠難以區分分子量十分相近的DNA分子，這些都可能會造成基因型統計失誤，導致等位基因的缺失，影響試驗結果。筆者通過篩選獲得了微衛星標記TTF1和Mam-EST110，可用于2種倍性團頭魴的鑒定。通過對團頭魴三倍體和二倍體的生長對比，三倍體在試驗后期表現出較明顯的生長優勢，證明其具備生產應用價值。研究為團頭魴三倍體種質資源研究、育種以及倍性鑒定提供了基礎資料。