NF-κB參與感染誘導血管內皮細胞DcR3表達升高的初步研究*

陳洪衛,侯彥強

上海市松江區中心醫院檢驗科，上海 201600

膿毒癥是由各種致病性微生物(包括細菌、真菌)侵入人體而引起的全身炎性反應。近年來膿毒癥的發病率呈上升趨勢，其細菌成分內毒素(LPS)、脂磷壁酸(LTA)以及酵母聚糖(zymosan)是重要的致病物質，可導致組織損傷和膿毒癥的發生[1]。有研究表明，內皮細胞的大量活化參與了膿毒癥發病的病理過程[2]。誘騙受體3(DcR3)是新近發現的一種缺乏穿膜結構域的可溶性腫瘤壞死因子受體超家族成員，在自身免疫性疾病、炎癥性疾病和腫瘤組織中的表達都有不同程度上調，其主要功能為抑制炎癥、抵抗凋亡和促進腫瘤細胞的增殖與分化[3]。本課題組前期研究發現膿毒癥患者血清DcR3表達升高，為了進一步探討DcR3在膿毒癥中的功能及表達升高的機制，本研究用革蘭陰性菌細胞壁的主要成分LPS、革蘭陽性菌細胞壁的主要成分LTA以及真菌細胞壁的主要成分zymosan刺激人血管內皮細胞(HUVEC)，并檢測細胞上清液以及細胞內DcR3表達水平的變化，旨在闡明核轉錄因子-κB(NF-κB)參與感染誘導DcR3表達升高的信號轉導機制。

1 材料與方法

1.1材料來源 采用購于上海艾研生物科技有限公司的HUVEC，分別用0.1、1.0、10.0 μg/mL LPS，5、50、500 ng/mL LTA和10、100、1 000 μg/mL zymosan，低、中、高3種濃度刺激HUVEC,設置4個處理組：LPS組、LTA組、zymosan組和正常對照組(未經過LPS、LTA和zymosan刺激的HUVEC)。

1.2儀器與試劑 大腸桿菌內毒素0111：PDTC、V0126、PD9859、B412630、CTA以及zymosan均購自美國Sigma公司；TLR2以及TLR4抗體購自美國Santa Cruz公司；DcR3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購置于上海蔚霆生物科技有限公司；反轉錄和PCR試劑、DcR3和GAPDH抗體購置于上海生工生物工程有限公司。iMark酶標儀購于美國伯樂公司；ABI 7500實時熒光定量PCR(qPCR)儀購于美國ABI公司；FACSCaliburTM流式細胞儀購于美國BD公司。

1.3細胞培養及傳代 -80 ℃冰箱中取出HUVEC細胞凍存管，迅速放入37 ℃水浴中，不停搖動，使其在1 min內融化，無菌條件下吸出細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入適量培養液重懸接種于培養瓶中，5% CO2、37 ℃培養箱培養。待細胞長滿細胞瓶時，進行傳代，棄去舊培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗一次，再加入1.5 mL胰酶消化，鏡下觀察細胞回縮變圓、間隙增大時，加入新鮮培養基終止反應，反復吹打細胞重懸，1∶3轉移入培養瓶，5% CO2、37 ℃培養箱繼續培養。

1.4藥物誘導細胞 調整并計數細胞使各孔105個細胞，置于24孔細胞培養板。待細胞貼壁達到約80%時，PBS洗滌細胞2次后，分別用0.1、1.0、10.0 μg/mL LPS，5、50、500 ng/mL LTA和10、100、1 000 μg/mL zymosan，低中高3種濃度刺激細胞，刺激時間為12、24、48 h，各小組設3個復孔，重復實驗3次。

1.5采用ELSIA檢測細胞上清液DcR3水平 單克隆抗體(mAb)包被ELISA板過夜，次日洗板，5%牛血清清蛋白(BSA)封阻。將各組細胞上清液及DcR3純標準品加入酶標板中室溫孵育2 h，洗液洗板4次，加入生物素化的二抗室溫孵育2 h，洗液洗板4次，加入辣根過氧化物酶結合物工作液室溫孵育30 min，洗液洗板4次，加入顯色底物(TMB)，避光孵育15 min，加入終止液，混勻后在酶標儀上測量A450。以吸光度為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，根據標準曲線得出各組細胞上清液中DcR3濃度。

1.6qPCR技術檢測細胞內DcR3 mRNA的表達 Trizol裂解細胞抽提總RNA并逆轉錄成cDNA，采用SYBR green法對DcR3 mRNA的表達水平進行檢測。DcR3特異性引物由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。利用ABI 7500 qPCR儀進行基因擴增。PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火并延伸34 s，進行40個循環。收集每個PCR延伸期的熒光，反應產物經溶解曲線檢測特異性，經SDS2.2軟件分析循環閾值(Ct)值。以GAPDH作為內參(表1)。采用2-ΔΔCt表示計算mRNA的表達，其中ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)，ΔCt=Ct(靶基因)-Ct(內參基因)。

表1 DcR3和內參GAPDH引物序列

1.7Western blot檢測細胞內DcR3蛋白的表達 以RIPA裂解細胞，BCA蛋白定量試劑盒定量后，取50 μg蛋白，水浴煮沸10 min后進行10.00%十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳，并轉移至PVDF膜上。5.00%脫脂蛋白室溫封閉2 h，加入適量的DcR3和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜，0.10%的PBST漂洗3次，每次5 min。加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h后，PBST洗3次，每次5 min。結果用ECL-Plus化學發光試劑盒檢測，以X線膠片曝光、顯影和定影，并觀察結果。

1.8流式細胞術檢測細胞表面TLR2和TLR4的表達水平 在細胞培養24 h后，收集細胞，以PBS洗3次，調整細胞濃度為2×106/mL，取100 μL細胞懸液與5 μL FITC-抗人TLR2單抗及5 μL PE-抗人TLR4單抗混勻；同時設陰性對照，置4 ℃下孵育30 min，PBS洗3次后重懸于PBS中，用流式細胞儀檢測，以CellQuest軟件分析。

2 結 果

2.1HUVEC細胞表面TLR2和TLR4的表達水平 HUVEC細胞培養24 h后，用流式細胞術檢測細胞表面TLR2和TLR4的表達水平。如圖1所示，HUVEC細胞表面既表達TLR2又表達TLR4。其中表達TLR2的細胞百分比為(82.23%±2.15%)，表達TLR4的細胞百分比為(77.87%±1.06%)。

2.2LPS、LTA以及zymosan刺激細胞后上清液中DcR3表達水平的改變 如圖2所示，低濃度LPS(0.1 μg/mL)、LTA(5 ng/mL)以及zymosan(10 μg/mL)刺激細胞后上清液中DcR3表達水平無明顯升高，中、高濃度LPS(1.0、10.0 μg/mL)、LTA(50、500 ng/mL)以及zymosan(100、1 000 μg/mL)刺激細胞后上清液中DcR3表達水平明顯高于正常對照組，差異有統計學意義(均P<0.05)，且高濃度組DcR3表達水平比中濃度組明顯增高，差異有統計學意義(均P<0.05)。高濃度刺激后12 h,上清液中DcR3的表達稍有升高，隨著時間延長到24 h，上清液中DcR3的表達與正常對照組相比明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3LPS、LTA以及zymosan刺激細胞后細胞內DcR3 mRNA的表達變化 高濃度LPS(10.0 μg/mL)、LTA(500 ng/mL)以及zymosan(1 000 μg/mL)刺激細胞后細胞內DcR3 mRNA的表達見圖3。正常對照組、高濃度LPS刺激組、高濃度LTA刺激組以及高濃度zymosan刺激組細胞內DcR3 mRNA的相對表達水平分別為(1.00±0.05)、(2.28±0.26)、(1.98±0.30)、(2.10±0.16)。經統計學分析顯示，經高濃度LPS、LTA以及zymosan刺激后細胞內DcR3 mRNA表達明顯升高，差異有統計學意義(均P<0.01)。刺激12 h后，細胞內DcR3 mRNA的表達明顯升高，與對照組相比差異有統計學意義(均P<0.05)。

注：A為分別用0.1、1.0、10.0 μg/mL LPS，5、50、500 ng/mL LTA以及10、100、1 000 μg/mL zymosan刺激細胞24 h后，收集細胞上清液，ELISA法檢測上清液中DcR3的表達；B為分別用10.0 μg/mL LPS、500 ng/mL LTA以及1 000 μg/mL zymosan刺激細胞12、24、48 h后，收集細胞上清液，ELISA法檢測上清液中DcR3的表達；與對照組比較，*P<0.05。

注：流式檢測細胞TLR2和TLR4受體；A為陰性對照；B為TLR2表達；C為TLR4表達。

2.4LPS、LTA以及zymosan刺激細胞后細胞內DcR3蛋白的表達變化 Western blot檢測LPS、LTA以及zymosan刺激后細胞內DcR3蛋白的表達見圖4，用高濃度LPS(10.0 μg/mL)、LTA(500 ng/mL)以及zymosan(1 000 μg/mL)刺激后細胞24 h后，細胞內DcR3蛋白的表達水平明顯升高，與正常對照組相比，差異有統計學意義(均P<0.05)。

2.5NF-κB信號通路參與了DcR3的表達 在用LPS、LTA以及zymosan刺激的同時加入P38 MAPK抑制劑或NF-κB抑制劑，24 h后檢測細胞內以及上清液中DcR3的表達，結果如圖5所示，加入NF-κB抑制劑PDTC后，細胞上清液以及細胞內DcR3表達較未加抑制劑組明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，而加入P38 MAPK抑制劑U0126和PD9859后，細胞上清液及細胞內DcR3的表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。

注：A為分別用10.0 μg/mL LPS、500 ng/mL LTA以及1 000 μg/mL zymosan刺激細胞24 h后，收集細胞，qPCR檢測細胞內DcR3 mRNA的表達；B為分別用10.0 μg/mL LPS、500 ng/mL LTA以及1 000 μg/mL zymosan刺激細胞12、24、48 h后，收集細胞，qPCR檢測細胞內DcR3 mRNA的表達；與對照組比較，*P<0.05。

注：A為westen blot結果；B為DcR3與GAPDH的灰度比；與對照組比較，*P<0.05。

注：HUVEC細胞分別用10.0 μg/mL LPS、500 ng/mL LTA以及1 000 μg/mL zymosan處理的同時加入100 μm NF-κB抑制劑(PDTC)或20 μm ERK抑制劑(U0126)或JNK抑制劑(PD9859),細胞處理24 h后，收集上清液和細胞。A為上清液中DcR3表達水平的變化；B為細胞內DcR3 mRNA的表達水平。

3 討 論

膿毒癥是由感染引起的全身性炎性反應，研究表明，多種病原微生物的細胞壁成分(如革蘭陰性菌的LPS、革蘭陽性菌的LTA以及真菌的zymosan等)具有強大的抗原刺激能力，均可通過與細胞表面的受體結合，促進內皮細胞活化，釋放大量炎癥介質，最終導致失控性炎性反應[1-2]。有資料表明，TLRs是病原微生物跨膜信號傳導的重要受體，介導了多種病原微生物的跨膜信號傳導，其中TLR2和TLR4的作用尤為顯著。TLR2識別能力廣泛，能夠識別革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌、螺旋體以及支原體等多種病原體的成分；而TLR4的識別能力較為局限，可能主要參與了LPS的識別與信號傳遞過程[4]。由于內皮細胞的激活在膿毒癥中發揮了核心作用，本研究首先檢測了內皮細胞表面TLRs受體的表達情況，結果顯示內皮細胞系HUVEC細胞表面既表達TLR2又表達TLR4。

本課題組前期研究發現，膿毒癥患者血清中DcR3表達水平明顯高于健康者，且與疾病的嚴重程度密切相關，但DcR3在膿毒癥中表達升高的機制目前尚不明確[5]。本研究利用不同細菌的細胞壁成分作為抗原刺激HUVEC細胞后，觀察細胞內以及上清液中DcR3表達的變化。結果顯示，LPS、LTA以及zymosan刺激HUVEC細胞，均可引起細胞內DcR3表達升高，其程度呈時間、濃度依賴性，同時上清液中DcR3的表達也升高。已知DcR3是新近發現的一種缺乏穿膜結構域的可溶性腫瘤壞死因子受體超家族成員，其在自身免疫性疾病、炎癥性疾病和腫瘤組織中都有不同程度地表達上調。有研究證實，DcR3具有調節巨噬細胞分化、炎性細胞因子和趨化因子分泌的功能，參與免疫調節和免疫監視[6]，提示DcR3可能參與膿毒癥早期病理生理發病機制。

本研究結果顯示，LPS、LTA以及zymosan刺激HUVEC細胞，均可引起細胞內DcR3表達升高，其中LPS的受體主要為TLR4，而LTA以及zymosan的受體主要為TLR2，由于TLR2和TLR4的胞內區在結構和功能上具有部分相似性，因此二者在細胞胞內具有一些共同途徑進行信號傳導，其中主要的兩條途徑為：(1)TLR2/TLR4-髓系分化蛋白(MyD88)/IRAK-NF-κB途徑；(2)TLR2/TLR4-MyD88/IRAK-絲列原活化激酶(MAPK)途徑[7]。為了進一步研究DcR3表達升高的具體機制，本研究在LPS、LTA以及zymosan刺激的同時，加入NF-κB和MAPK信號通路抑制劑，以檢測DcR3的表達情況。結果表明，加入NF-κB抑制劑PDTC后，DcR3的表達水平明顯下降，而加入MAPK抑制劑U0126和PD9859后，DcR3的表達水平無明顯變化，這說明DcR3的表達與激活NF-κB通路有關，而與p38 MAPK通路無關。

NF-κB是一種特殊的核蛋白因子，能與多種蛋白的啟動子和增強子序列位點發生特異性結合，促進基因的轉錄和表達，參與眾多與免疫、炎性反應有關的基因轉錄，同時也參與細胞增殖和凋亡調控等過程[8]。在MAPK通路中，ERK和JNK是并列的兩條通路，也是被人們了解最多的成員，該通路的激活在炎性反應過程中也起著關鍵作用，如產生炎性因子白細胞介素(IL)-1β、IL-6等，還參與細胞生長和細胞周期運行等過程[9]，但本研究發現在HUVEC細胞中，MAPK抑制劑不能阻斷LPS、LTA以及zymosan誘導的DcR3的表達升高，進一步說明了在體外培養的HUVEC細胞中，革蘭陰性菌、革蘭陽性菌以及真菌通過TLRs-MyD88-NF-κB信號通路誘導DcR3的表達，參與炎癥的發生，本研究結果初步闡述了DcR3在膿毒癥中表達升高的機制，下一步筆者將通過過表達以及干擾實驗對DcR3在膿毒癥中的功能進行研究。