共聚焦顯微拉曼光譜鼻咽癌檢測中的研究進展*

王 雪，王萌萌，張秀明 綜述,熊 丹，3△ 審校

1.深圳羅湖區人民醫院醫學檢驗科，廣東深圳518000；2.汕頭大學醫學院，廣東汕頭 515041； 3.上海市公共衛生臨床中心，上海201500

鼻咽癌(NPC)是起源于鼻咽上皮的頭頸部惡性腫瘤，據2018年發布的最新數據顯示，全球NPC新發病例約 12.9 萬例，其中中國的新發病例占全球的一半以上，該病對華南等NPC高發地區人民的生命健康造成嚴重威脅[1]。早期NPC對放療非常敏感，早期患者經放療及臨床綜合治療，5 年生存率可高達 95%。但NPC發病部位隱匿，大部分NPC患者確診時已處于中晚期，這是導致NPC患者生存率普遍偏低的主要原因[2]。我國作為NPC發病率最高的國家，提高NPC早期診斷、療效和預后評價體系對改善我國NPC防治效果有重要意義。目前，NPC的臨床檢測手段主要包括：(1)EB病毒(EBV)病原體檢測，包括EBV-DNA和EBV編碼的微小RNA(miRNA)及EBV血清學抗體檢測，是目前臨床使用的最廣泛的生物標志物，但僅針對非角化型NPC患者，且靈敏度和特異度均不理想。(2)影像學檢測，包括CT、MRI、PET/CT等，在晚期NPC預后判斷中具有良好的效果，但影像改變往往滯后于疾病進展。(3)鼻腔鏡活檢結合病理組織分期是目前診斷NPC的金標準，但是病理學檢查具有侵襲性，檢測依賴于病理醫師的經驗判斷，具有一定的主觀性，難以對早期腫瘤或微小病灶進行準確診斷。以上手段在NPC的早期診斷上均存在一定的局限性。

拉曼光譜是由印度物理學家拉曼(Raman)于1928年發現的一種散射光譜，拉曼光譜技術可對與入射光頻率不同的散射光譜進行分析以得到分子振動、轉動方面信息[3]。該技術能夠用于分析物質分子化學成分、結構等信息，且操作簡便，無創，水干擾小和分辨能力高，在生物醫學等多個領域具有明顯的優勢和廣泛的應用。傳統的拉曼光譜以單點探測為主，對于復雜的生物組織結構分析具有一定的局限性，難以獲得完整的組化信息。隨著當代技術的發展，新的拉曼光譜分析方法不斷產生，諸如表面增強拉曼光譜、共振拉曼光譜、相干反斯托克斯拉曼光譜法、受激拉曼散射、空間位移拉曼光譜和共聚焦等拉曼光譜。上述諸多新興的拉曼光譜分析方法可對生物樣本實現定性、定量、定位的研究，近年來已被廣泛應用于人體細胞組織、人體體液和生物標志的檢測，其在腫瘤早期診斷和預后監測也有巨大的潛能。例如，表面增強拉曼光譜可識別多種癌癥，包括乳腺癌[4-5]、卵巢癌[6]、皮膚癌[7-8]、前列腺癌[9-10]等，其在化療藥物監測方面也有初步應用[11]。表面增強拉曼光譜同樣應用于NPC診療過程中，如組織的良惡性、NPC分期等[12]。NPC患者體液樣品分析[13]以及內鏡檢查方面的開發[14]也被廣泛研究，該技術能夠檢測NPC癌前病變狀態下細胞、組織以及體液的相關分子改變。但是表面增強拉曼光譜存在操作復雜、重現性較差等弊端，限制了其在臨床上廣泛使用的進程。共聚焦顯微拉曼光譜技術是將拉曼光譜技術與共聚焦顯微分析技術結合起來的一種光譜分析技術，不依賴于表面增強，能夠在無標記、無增強的條件下，對NPC細胞、組織、體液等進行檢測，在NPC早期診斷方面具有極大應用潛力。據此，本文綜述了近幾年來共聚焦顯微拉曼光譜在NPC診斷中的研究進展和應用前景，旨在為共聚焦拉曼光譜在NPC臨床診斷應用的發展提供參考。

1 共聚焦顯微拉曼光譜原理

共聚焦顯微拉曼光譜技術是將拉曼光譜技術與共聚焦顯微分析技術結合起來的顯微共聚焦拉曼光譜成像技術(CRMI)，采用了低功率激光器、高轉換效率的全息電荷耦合陣列檢測器，共聚焦顯微鏡將激發光的光斑聚焦到微米量級,進而在不受周圍物質的干擾下對樣品的微區進行精確激光照射分析,產生的拉曼散射可通過光譜儀的解析而獲得照射區域物質的拉曼圖譜[15]。相較于傳統拉曼光譜，共聚焦顯微拉曼光譜具有更高的空間分辨率、工作頻率、運行速度和靈敏度等，其不但能對規模小至 0.5～1.0 μm微量樣品進行分析，而且能夠實現光譜與三維圖像相結合的定性、定量與定位分析。由于待測樣本體積微小，檢測結果幾乎不受熒光干擾，因而適合臨床檢測及化學結構分析[16]。目前，共聚焦顯微拉曼光譜在多領域均有應用，如鑒定和區分細菌菌株[17]，在亞細胞水平上分析化學組成[18]。國內外已有一些共聚焦顯微拉曼光譜在腫瘤檢測中應用的報道[19-20]。在NPC相關研究中，共聚焦顯微拉曼光譜不僅能夠對NPC單細胞進行檢測，同時也能區分NPC和正常組織的化學組成及分子結構，實現對NPC的快速診斷。 除此之外，共聚焦顯微拉曼光譜還能監測化療藥物濃度及預測細胞耐藥性。總而言之，早期診斷及精準治療能夠明顯改善患者預后及提高生存期，這對NPC的防治具有重要意義。

2 共聚焦顯微拉曼光譜在NPC檢測中的應用現狀

2.1共聚焦顯微拉曼光譜在NPC單細胞檢測中的應用 廣泛應用的細胞內成像方法有電子顯微鏡、冷凍電鏡術和免疫熒光顯微鏡等，這些方法由于需要固定、冷凍或熒光標記的特點，均有侵入性，對被測細胞具有破壞性。1990年，PUPPELS等[21]首次應用共聚焦顯微拉曼光譜技術對單細胞內的分子構成進行了研究，自此，該技術因其高靈敏度，抗水干擾性及非標記、非侵入性被廣泛應用于組織鑒別和單細胞生物學的相關研究中。由于共聚焦拉曼光譜在分選癌細胞和正常細胞中具有高度特異度，其有望成為廣泛應用的無標記細胞分選新技術。早期研究已成功將共聚焦拉曼光譜用于區分不同腫瘤的正常和惡性細胞系中，如皮膚癌[22]、黑色素瘤[23]、前列腺癌[24]、膠質瘤[25]。YE等[26]采用共聚焦拉曼光譜發現NPC細胞和鼻炎上皮細胞在1 449、1 657 cm-1光譜區域存在差異，進而成功區分NPC和正常細胞系，并對不同的NPC細胞系(C666和CNE2)進行區分，特異度高達100%。LI等[27]應用顯微拉曼光譜成功區分了3種不同的NPC細胞和正常細胞系(C666-1、CNE1、CNE2和NP69)，靈敏度和特異度均高于90%。這些研究結果表明共聚焦拉曼光譜具有分選腫瘤細胞和正常細胞的潛能，有望成為一種無標記腫瘤細胞分選方法并區分不同類型的腫瘤細胞，為NPC的診斷治療提供參考。

2.2共聚焦顯微拉曼光譜在NPC患者體液中的研究 人體體液(血清、血漿、全血、唾液、尿液等)含有無機鹽、糖、維生素、核酸、蛋白質、脂類等各種成分，這些分子的構象、組成和腫瘤的發生發展以及藥物的療效密切相關。共聚焦拉曼光譜可以通過監測體液中分子變化從而實現腫瘤的診斷、治療效果以及預后評估。欒藝等[28]早期采用共聚焦拉曼檢測系統對胃癌患者和非胃癌患者血清檢測時發現，在1 003、1 155、1 446、1 517、1 655、2 873、2 932、3 059 cm-1位移處的8個峰值存在差異，通過合OPLS-DA的統計分析發現共聚焦拉曼光譜技術可對胃癌、胃良性病變患者及健康者的血清做鑒別區分。潘建基等[29]采用共聚焦顯微拉曼光譜對NPC患者和健康者血清進行檢測，發現在900～1 000 cm-1、1 600～1 700 cm-1和1 200～1 400 cm-1波段，NPC患者和健康者血清譜峰存在明顯差異，診斷特異度達91.7%。以上研究表明，共聚焦拉曼光譜可通過體液區分NPC患者和健康人群，其有望成為NPC無創輔助診斷的新方法。

2.3共聚焦顯微拉曼光譜在NPC患者組織中的應用研究 惡性腫瘤組織和正常組織的蛋白質、核酸、脂肪等組成及結構不同，共聚焦顯微拉曼光譜能從分子水平上反映組織化學組成和分子結構上的差異。有研究報道顯示，共聚焦顯微拉曼光譜可通過從分子結構區分不同的腫瘤病理組織類型，例如HSU等[30]通過共聚拉曼光譜與PCA-LAD結合區分胃腺癌的病理分型，如乳頭狀腺癌(PAC)、管狀腺癌(TAC)、黏液腺癌(MAC)和印戒細胞癌(SRC)。此外，整個監測過程只需幾分鐘且無需免疫組化等組織預處理。LI等[31]將共聚焦顯微拉曼光譜與GA-LDA算法結合，通過792～805,867～880,996～1 009,1 086～1 099,1 288～1 304,1 663～1 670,和1 742～1 752 cm-1區域的光譜差異成功區分NPC組織和正常組織，特異度達100.0%。SUN等[32]使用共聚焦顯微拉曼光譜對NPC組織涂片進行檢測，結合多變量統計分析可對NPC和正常組織涂片進行區分，診斷靈敏度和特異度分別為87.2%和85.7%。以上研究表明，共聚焦顯微拉曼光譜能夠快速準確地探測組織化學組成和分子結構，從而區分腫瘤組織與正常組織，這一優點也有助于手術時區分良惡性組織的邊界以確保腫瘤組織的完整切除[33]。

2.4共聚焦顯微拉曼光譜在NPC治療藥物監測中的應用 由于共聚焦顯微拉曼光譜能對單個活細胞的化學成分進行特異度分析且無需標記，不受熒光干擾，因此其不僅能對細胞內存在的藥物進行檢測，也能監測藥物的療效，這將促進體內外細胞與藥物相互作用的相關研究[34]。近年來共聚焦顯微拉曼光譜已經被廣泛用于研究化療藥物對真核細胞的影響[35]。HUANG等[36]通過共聚焦顯微拉曼光譜技術采集不同濃度順鉑處理后的NPC細胞指紋圖譜時發現，順鉑對NPC細胞基因組有降解作用。順鉑對癌細胞的作用機制也在肺腺癌中得到驗證。NAWAZ等[37]使用共聚焦顯微拉曼光譜技術測定肺腺癌細胞對順鉑的反應，并研究了96 h內不同藥物濃度的療效。許元基[38]用共聚焦拉曼光譜對NPCCNE-2細胞系進行了尼妥珠單抗增敏研究，發現隨著藥物濃度的增高，尼妥珠單抗的放射增敏作用越強。此外，有研究表明共聚焦顯微拉曼光譜可以檢測化療藥物在亞細胞內的轉運和積累途徑，并預先識別耐藥腫瘤細胞，從而優化化療療效[39]。以上研究結果表明，共聚焦顯微拉曼光譜能夠定量分析體內外細胞藥物的濃度，監測細胞活力，在分子水平觀測抗腫瘤藥物對NPC細胞的療效，為臨床NPC化療藥物的個性化選擇提供參考。

3 共聚焦顯微拉曼光譜在NPC轉移代謝監測中的應用前景

共聚焦顯微拉曼光譜不僅在腫瘤診斷治療方面具有很大的優勢，它在腫瘤轉移監測方面同樣具有很大的前景。共聚焦拉曼光譜能夠在單個細胞水平上成像細胞結構并且能定量特定生物分子以此監測腫瘤的代謝過程。有文獻報道[23]通過共聚焦顯微拉曼光譜對兩性細胞膜穿透肽(CPPs)轉運蛋白(Tp)在轉移性黑色素瘤細胞系SK-Mel-2中的浸潤和生理效應的研究中發現，細胞硬度的增加是由Tp誘導細胞骨架改變引起的[23]。CHRISTINA等[40]利用共聚焦顯微拉曼光譜識別并量化了乳腺癌細胞中脂肪組織介導的脂滴形成和生化改變。PACIA等[41]研究表明，利用拉曼三維共聚焦成像結合AFM內皮表面成像分析血管壁各層，證明腫瘤轉移誘導的全身內皮功能障礙導致主動脈內皮發生明顯的化學變化，如蛋白質含量顯著增加(18.0%)和脂質含量輕微降低(4.0%)，這些變化僅限于內皮細胞，不發生在血管壁深層[41]。此外共聚焦顯微拉曼光譜還可以通過監測循環腫瘤干細胞(CCSC)、循環腫瘤細胞(CTC)等在單細胞水平上快速獲取細胞分子表型的重要信息，有助于揭示細胞和組織的代謝病理等機制與過程，預測腫瘤轉移和復發[42]。以上研究表明共聚焦顯微拉曼光譜可用于識別生物樣本中的代謝變化，從而為包括NPC在內的相關腫瘤的發病機制研究提供參考。

4 結 論

在過去的幾年中，大量的研究工作表明共聚焦顯微拉曼光譜作為一種新技術得到了越來越多的認可。與傳統拉曼光譜技術相比，共聚焦拉曼光譜有信號強、靈敏度高、測量時間短、所需樣本量小等優點，該技術能夠實現在細胞、組織、體液等不同類型的樣本中的檢測及對體內外藥物濃度及作用機制進行實時監測，因此在腫瘤的早期診斷及預后研究中具有良好的發展前景[43]。NPC由于其發病隱匿，臨床癥狀及影像學表現往往滯后于疾病進展，早期診斷十分困難。共聚焦顯微拉曼光譜技術無需外源染色和標記，僅通過檢測單個NPC活細胞內化學成分結構差異指紋圖譜即可獲得分子特異性信息，達到快速、無創的診斷。該技術不但可以輔助手術中癌組織的切除，而且能在免受熒光和抗體污染的情況下分選NPC細胞。此外，共聚焦拉曼光譜能對NPC藥物治療進行監測，且在NPC轉移代謝中有很大的應用前景。

共聚焦顯微拉曼光譜雖然在基礎研究領域有廣泛應用，但在臨床應用方面缺少相關經驗。共聚焦顯微拉曼光譜雖能對單細胞進行三維成像，但一次僅能檢測一個細胞，難以對大量的細胞進行高通量檢測，故需結合其他已建立的顯微成像技術，如熒光和電子顯微鏡等。共聚焦顯微拉曼光譜與其他技術相結合能夠更廣泛地了解相關標本特征，評估待測組織或細胞系的細胞分布，結合統計方法，設定獲得有意義結果所需測量的檢測限。正常組織和癌癥組織的拉曼光譜模式有時可能非常相似，因此，可開發自動化的樣品捕獲和有效的診斷算法來解釋微小的光譜變化，此外，確立可靠的細胞組成分布的檢測標準也是共聚焦拉曼技術普及應用的重要前提。最后，共聚焦拉曼光譜用于體內診斷時，也需要考慮組織熱損傷問題。綜上所述，隨著共聚焦拉曼光譜技術的不斷完善和互補技術的建立，它在NPC早期診斷、預后、治療轉移監測等臨床診療領域將會有光明的前景。