HSP60和NRF2在透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床價(jià)值*

鮑 晨，董學(xué)敏，楊靜茹，胡倩倩，柳 俊△，米 琳，王 勇

1.安康市中心醫(yī)院病理科，陜西安康 725000;2.安康市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，陜西安康 725000;3.陜西省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，陜西西安 710068

透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌(ccRCC)是起源于腎小管上皮的惡性腫瘤，是ccRCC最常見的病理類型，每年發(fā)病率為4.99/10萬[1]。早期ccRCC的治療以根治性手術(shù)為主，對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移性ccRCC以內(nèi)科綜合治療如靶向治療、免疫治療等為主[2]。約31%的ccRCC患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，最終導(dǎo)致患者不良生存預(yù)后的發(fā)生[3]。深入研究ccRCC機(jī)制，對(duì)ccRCC的診治具有重要的臨床價(jià)值。熱休克蛋白60(HSP60)是線粒體中主要的ATP依賴分子伴侶，在維持線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)中起至關(guān)重要的作用。有文獻(xiàn)表明，HSP60參與包括病毒性感染、炎癥性腸病等多種炎癥性疾病等許多復(fù)雜的生理病理過程[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，HSP60在人類多種腫瘤中存在異常表達(dá)升高或降低的現(xiàn)象，HSP60能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活、抑制凋亡和促進(jìn)腫瘤血管生成，是一種新的腫瘤標(biāo)志物，有利于判斷腫瘤患者的預(yù)后[6]。核因子E2相關(guān)因子2(NRF2)基因位于2q31.2，該基因編碼蛋白是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合下游靶基因啟動(dòng)子中的ARE反應(yīng)元件，參與正常細(xì)胞的發(fā)育和分化的調(diào)節(jié)過程。NRF2與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。研究表明，在非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤中NRF2表達(dá)上調(diào)，NRF2能夠激活磷脂酰肌醇3激酶信號(hào)通路，導(dǎo)致下游AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的過度激活，促進(jìn)腫瘤的惡性增殖，是腫瘤患者不良預(yù)后的重要標(biāo)志物[7]。目前HSP60、NRF2在ccRCC中的表達(dá)及相互作用關(guān)系尚不清楚。本研究通過檢測ccRCC中HSP60、NRF2的表達(dá)，初步探討其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年3月至2019年3月在安康市中心醫(yī)院(下稱本院)行ccRCC根治術(shù)或保留腎單位手術(shù)的89例ccRCC患者為研究對(duì)象，其中男52例，女37例；年齡37～74歲、平均(49.1±6.3)歲；病理Furhman分級(jí)：1+2級(jí)33例，3+4級(jí)56例；腫瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期65例，Ⅲ～Ⅳ期24例；伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移19例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移70例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 12例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移76例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次發(fā)現(xiàn)，無放化療及免疫治療史。(2)病理組織學(xué)檢查明確為ccRCC。(3)一般狀況良好，能夠耐受手術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并精神障礙性疾病，不能配合治療。(2)合并慢性腎病、腎功能衰竭。(3)合并其他惡性腫瘤。患者和家屬均知情同意并簽字，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測HSP60、NRF2 mRNA表達(dá) 將約50 mg的癌組織及癌旁組織冰上剪碎，液氮中研磨，Trizol法提取組織中總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃冰箱保存待測。HSP60正向引物序列5′-ATG CTT CGG TTA CCC ACA GTC-3′，反向引物序列：5′-AGC CCG AGT GAG ATG AGG AG-3′，NRF2正向引物序列5′-TCA GCG ACG GAA AGA GTA TGA-3′，反向引物序列5′-CCA CTG GTT TCT GAC TGG ATG T-3′，以GAPDH為內(nèi)參，正向引物序列5′-GTG TAG ACC TTT TAG CCG ATG C-3′，反向引物序列:5′-GTG CCA GTA CAG TAG CAG TGG-3′。qPCR總反應(yīng)體系20 μL，包括SYBR Green Master Mix 10 μL，正、反向引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。qPCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，變性、退火、延伸共45個(gè)循環(huán)。HSP60、NRF2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt值法表示。

1.2免疫組織化學(xué)(IHC)檢測HSP60、NRF2蛋白表達(dá) 將組織用10.0%組織固定液固定過夜，石蠟包埋后進(jìn)行切片，切片厚度5 μm，60 ℃烤片1 h；切片入二甲苯兩次，每次10 min；乙醇水化；微波爐抗原熱修復(fù)；3.0%H2O2阻斷30 min；5.0%羊血清封閉30 min；一抗37 ℃ 2 h(HSP60、NRF2單抗購自Abcam公司，貨號(hào)ab190828、ab76026)；二抗37 ℃孵育2 h；DAB顯色1 min；蘇木素染細(xì)胞核30 s；梯度乙醇脫水，封片鏡檢。免疫組織化學(xué)評(píng)分根據(jù)陽性染色強(qiáng)度及染色面積評(píng)估。不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深褐色為3分；染色面積<25.0%為1分，25.0%～50.0%為2分，>50.0%為3分。染色強(qiáng)度評(píng)分乘以染色面積評(píng)分的為免疫組織化學(xué)評(píng)分。0～2分為陰性，3～9分為陽性。根據(jù)免疫組織化學(xué)評(píng)分，將89例患者分為低表達(dá)組(<4分)和高表達(dá)組(≥4分)。

2 結(jié) 果

2.1ccRCC癌及癌旁組織中HSP60、NRF2 mRNA表達(dá)比較 ccRCC癌組織中HSP60、NRF2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.483±0.112、1.725±0.285，癌旁組織分別為1.227±0.265、0.551±0.101，癌組織HSP60的相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=24.397，P<0.001)，而NRF2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=36.629，P<0.001)。見圖1。

圖1 癌組織與癌旁組織中HSP60、NRF2 mRNA表達(dá)量比較

2.2ccRCC癌及癌旁組織中HSP60、NRF2蛋白表達(dá) 癌組織中HSP60、NRF2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。ccRCC癌及癌旁組織中HSP60蛋白陽性表達(dá)率分別為84.3%(75/89)、100.0%(89/89)；NRF2蛋白表達(dá)陽性表達(dá)率分別為47.2%(42/89)、13.5%(12/89)。癌組織中HSP60蛋白陽性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.195，P<0.001);癌組織中NRF2蛋白陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.925，P<0.001)。見圖2。

圖2 癌及癌旁組織中HSP60、NRF2蛋白表達(dá)(×200)

2.3ccRCC癌組織中HSP60、NRF2表達(dá)的相關(guān)性 Spearmen秩相關(guān)分析結(jié)果，ccRCC癌組織中HSP60與NRF2表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.520,P<0.001)。配對(duì)χ2檢驗(yàn)結(jié)果：兩個(gè)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)χ2=8.144,P=0.004，提示兩個(gè)指標(biāo)有密切關(guān)聯(lián)；差異性檢驗(yàn)χ2=19.105,P<0.001，提示兩個(gè)指標(biāo)水平相對(duì)變化很大，與其呈負(fù)相關(guān)關(guān)系有關(guān)。一致性系數(shù)Kappa為負(fù)值(Kappa=-0.233)，也與差異性明顯及負(fù)呈相關(guān)關(guān)系互為佐證。

2.4ccRCC癌組織中HSP60、NRF2蛋白表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系 ccRCC癌組織中HSP60、NRF2的表達(dá)與腫瘤分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(均P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理Furhman分級(jí)無關(guān)(均P>0.05)。腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及伴淋巴轉(zhuǎn)移的ccRCC癌組織中HSP60表達(dá)明顯較低，NRF2表達(dá)明顯較高(P<0.05)。見表1。

表1 ccRCC癌組織中HSP60、NRF2蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.5ccRCC癌組織中HSP60、NRF2蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 89例ccRCC患者隨訪3年，隨訪過程中4例失訪，死亡27例，病死率為31.8%。HSP60低表達(dá)組3年生存率為41.5%(17/41)，明顯高于HSP60高表達(dá)組的3年生存率93.2%(41/44)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=30.79，P<0.001)；HSP60低表達(dá)組平均生存時(shí)間為(23.5±6.1)個(gè)月，明顯高于HSP60高表達(dá)組的平均生存時(shí)間(28.2±6.4)個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.460，P<0.001)。NRF2低表達(dá)組3年生存率為95.2%(40/42)，明顯高于NRF2高表達(dá)組的3年生存率41.9%(18/43)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=30.79，P<0.001)，HSP60低表達(dá)組平均生存時(shí)間為(29.1±6.2)個(gè)月，明顯高于HSP60高表達(dá)組的平均生存時(shí)間(22.4±6.3)個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.941，P<0.001)。

2.6單因素和多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響ccRCC患者生存預(yù)后的危險(xiǎn)因素 以ccRCC透明細(xì)胞癌患者隨訪過程中的生存狀態(tài)為因變量(1=死亡，0=存活，t=生存時(shí)間)，納入年齡(賦值：1=≥60歲，0=<60歲)、性別(賦值：1=男性，0=女性)、Fuhrman分級(jí)(賦值：1=3+4級(jí)，0=1+2級(jí))、腫瘤分期(賦值：賦值1=Ⅲ～Ⅳ期，0=Ⅰ～Ⅱ期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(賦值：1=有，0=無)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(賦值：1=有，0=無)、HSP60(賦值1=低表達(dá)，0=高表達(dá))、NRF2(賦值1=高表達(dá)，0=低表達(dá))為自變量。單因素COX分析結(jié)果表明，HSP60低表達(dá)、NRF2高表達(dá)、腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期的ccRCC患者生存預(yù)后差，多因素Cox回歸分析結(jié)果ccRCC組織中HSP60低表達(dá)、NRF2高表達(dá)、腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期是影響ccRCC患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表2、3。

表2 影響ccRCC患者生存預(yù)后的單因素Cox分析

續(xù)表2 影響ccRCC患者生存預(yù)后的單因素Cox分析

表3 影響ccRCC患者生存預(yù)后的多因素Cox分析

3 討 論

腎癌是常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。ccRCC是最常見的病理類型，約占所有類型的90.0%。ccRCC的治療包括手術(shù)治療、靶向治療及免疫治療等。早期ccRCC根治性手術(shù)患者就能獲得滿意的生存預(yù)后，但對(duì)于晚期ccRCC，患者預(yù)后較差。近年來新的藥物如酪氨酸激酶抑制劑、mTOR抑制劑及免疫檢查點(diǎn)抑制劑等的臨床應(yīng)用，改善了轉(zhuǎn)移性ccRCC患者的總體生存時(shí)間和無進(jìn)展生存時(shí)間[8]。但在臨床治療過程中發(fā)現(xiàn)，部分ccRCC患者對(duì)藥物治療不敏感或治療后發(fā)生耐藥的現(xiàn)象，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[9]。深入研究ccRCC的疾病發(fā)生的機(jī)制，對(duì)于ccRCC臨床診斷和治療有重要意義。

熱休克蛋白家族是細(xì)胞應(yīng)激過程中產(chǎn)生的應(yīng)激蛋白。生理?xiàng)l件下，該家族成員幫助蛋白質(zhì)或多肽的正確折疊、降解和運(yùn)輸，其作為分子伴侶,發(fā)揮維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，協(xié)助細(xì)胞存活和抑制細(xì)胞凋亡等作用。HSP60是熱休克蛋白家族成員之一，相對(duì)分子質(zhì)量為60×103，作為一種線粒體伴侶蛋白，存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞表面。近年來發(fā)現(xiàn)，HSP60與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，不同腫瘤中HSP60發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。MARINO等[10]報(bào)道，腫瘤中HSP60作為一種促癌基因，抑制抑癌基因p53和caspase依賴的細(xì)胞凋亡，并通過與其他細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用激活核因子κB途徑，促進(jìn)細(xì)胞增殖。但有文獻(xiàn)報(bào)道，HSP60在膀胱癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，其能夠通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫殺傷功能，抑制腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展[11]。目前，關(guān)于ccRCC組織中HSP60的表達(dá)研究報(bào)道較少。本研究中，ccRCC中HSP60表達(dá)明顯降低，目前其機(jī)制尚不清楚，可能與非編碼RNA對(duì)HSP60的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞中miR-17能夠直接結(jié)合HSP60 mRNA的3′非編碼區(qū)，降低HSP60 mRNA的穩(wěn)定性，抑制HSP60的表達(dá)，進(jìn)而激活下游腫瘤壞死因子信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[12]。本文進(jìn)一步研究ccRCC中HSP60低表達(dá)的臨床意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高腫瘤分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中HSP60的表達(dá)明顯較低，表明ccRCC中HSP60的低表達(dá)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。TENG等[13]在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，沉默ccRCC腫瘤細(xì)胞中HSP60的表達(dá)會(huì)破壞呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的完整性并觸發(fā)過多的活性氧(ROS)的產(chǎn)生，ROS激活A(yù)MPK途徑，促進(jìn)ccRCC腫瘤細(xì)胞惡性增殖的同時(shí)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。此外，ccRCC腫瘤組織中HSP60低表達(dá)患者遠(yuǎn)期生存預(yù)后較差，并且HSP60低表達(dá)是患者不良生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示HSP60可作為新的判斷ccRCC患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物，值得臨床深入研究。

NRF2是定位于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，參與血紅素加氧酶-1(HO-1)、NADH氧化還原酶1(NQO1)等氧化應(yīng)激通路中多種基因的表達(dá)[14-15]。有文獻(xiàn)報(bào)道，NRF2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要的調(diào)節(jié)作用，其作為一種原癌基因，參與激活血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板源生長因子通路(PDGF)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖及轉(zhuǎn)移[16]。本研究中，ccRCC癌組織中NRF2的表達(dá)升高，與以往研究結(jié)果一致[7]。ccRCC中NRF2表達(dá)上調(diào)的機(jī)制尚不清楚。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞中NRF2受到Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(KEAP1)的泛素化調(diào)控，腫瘤中KEAP1的表達(dá)缺失或降低導(dǎo)致使NRF2的泛素化-蛋白酶體途徑降解失調(diào)，從而增加了細(xì)胞中NRF2蛋白的量，NRF2易位至細(xì)胞核，然后激活其下游癌基因的表達(dá)[17]。本研究中，高腫瘤分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中NRF2表達(dá)明顯較高，提示ccRCC中NRF2促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。NRF2的腫瘤促進(jìn)作用與其對(duì)腫瘤代謝的影響有關(guān)。研究表明，NRF2能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生代謝重編程，NRF2激活戊糖磷酸途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中由葡萄糖的代謝轉(zhuǎn)變?yōu)猷堰屎塑账岷铣纱x，促進(jìn)谷氨酰胺的生物學(xué)合成，谷氨酰胺作為腫瘤細(xì)胞重要的營養(yǎng)能量來源，維持腫瘤細(xì)胞的增殖能力[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，ccRCC中NRF2高表達(dá)患者的生存預(yù)后較差，提示NRF2可能是判斷ccRCC患者生存預(yù)后的分子標(biāo)志物。多因素COX回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NRF2高表達(dá)是ccRCC患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，本研究通過檢測ccRCC癌組織中NRF2的表達(dá)，有助于對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行初步評(píng)估，指導(dǎo)后續(xù)治療和隨訪。

本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ccRCC中HSP60與NRF2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，在腎腫瘤細(xì)胞中沉默HSP60表達(dá)能驅(qū)動(dòng)ccRCC的代謝重編程，激活NRF2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)線粒體依賴性谷胱甘肽的生物合成，以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[13]。因此，ccRCC中HSP60可能對(duì)NRF2的表達(dá)存在調(diào)控關(guān)系，但二者的具體作用關(guān)系值得深入探索。

綜上所述，ccRCC中HSP60表達(dá)降低，而NRF2表達(dá)升高，HSP60與NRF2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。HSP60及NRF2表達(dá)與ccRCC腫瘤分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，二者共同參與ccRCC的發(fā)生、發(fā)展，是新的ccRCC預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)志物。但HSP60與NRF2間的機(jī)制及其在ccRCC中的臨床意義有待深入研究。