結直腸癌TP53相關外泌體的差異蛋白分析*

朱 琳，張 澤，賈 坤，周茜寧，周 光△

1.解放軍總醫院第一醫學中心檢驗科，北京 100853；2.解放軍總醫院第六醫學中心檢驗科，n北京 100037；3.首都醫科大學附屬北京友誼醫院臨床檢驗中心，北京 100050

在全球，結直腸癌(CRC)的發病率和死亡率僅次于肺癌及乳腺癌，居所有腫瘤的第三位[1]。抑癌基因的失活和癌基因的激活是CRC發生、發展的關鍵。在已發現的人類腫瘤細胞中，TP53基因突變率從10%(造血干細胞惡性腫瘤)到50%～70%(卵巢癌、大腸癌、頭頸癌)[2]。一旦TP53基因發生突變，就會喪失野生型TP53基因所具有的抑癌功能，同時獲得許多癌基因的特殊功能[3]。外泌體是細胞內多泡體與細胞膜融后釋放到細胞外的納米級膜性囊泡，直徑30～100 nm，內部包含有微小RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)和細胞質蛋白，由多種細胞分泌，介導細胞間物質與信息傳遞[4-5]。腫瘤來源的外泌體存在于腫瘤細胞培養上清液、腫瘤患者血漿或者惡性滲出液中，通過改變腫瘤微環境，促進腫瘤血管新生和腫瘤轉移，以及直接作用于腫瘤細胞等途徑，影響腫瘤的進展[6]。確定腫瘤相關的外泌體蛋白和RNA，能使這些囊泡成為新的生物標記來源并用來監測健康狀態。因此，本文比較分析了TP53基因突變、敲除及野生的腫瘤細胞分泌外泌體的蛋白質組差異，探討突變的TP53基因對腫瘤微環境中的分泌蛋白質的影響。

1 材料與方法

1.1細胞系來源 人類CRC TP53野生型[HCT116-p53(WT)]細胞株購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)；TP53敲除型[HCT116-p53(-/-)]細胞株由約翰霍普金斯大學Bert VOGLESTEIN教授饋贈。

1.2臨床樣本 用于驗證的CRC患者均依據《結直腸癌診療指南(2019年版)》并經病理確診，其血清均來自中國醫學科學院腫瘤醫院腹部外科的住院患者，共62例，其中男32例，女30例，年齡27～81歲，中位年齡64歲。采取外周血前經患者本人知情同意，并且術前未經任何放化療。健康對照組血清取自解放軍總醫院的體檢健康人群，血液生化指標檢測正常，腹部B超結果正常，并排除人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒和梅毒感染者，共61例，其中男35例，女26例，年齡25～73歲，中位年齡50歲。

1.3主要儀器與試劑 飛利浦CM120型透射電子顯微鏡(荷蘭)； AB SCIEX 5600質譜儀(美國)；Agilent technologies超高效液相色譜(美國)。Santa Cruz Biotech兔抗人p53、HSP70多克隆抗體(美國)；Sigma-Aldrich鼠抗人β-actin單克隆抗體(美國)。Qrigene的 TP53 MUTANT (R273H)重組質粒(pCMV6-Myc-DDK-AC)(美國)；天根生物DH5α大腸埃希菌感受態細菌(北京)。SBI ExoQuick外泌體提取液(美國)，優爾生RB1的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢)；AB SCIEX iTRAQ 4重標記試劑盒(美國)。

1.4外泌體的提取 將HCT116-p53(WT)、HCT116-p53(-/-)和HCT116-p53(R273H)細胞培養上清液進行濃縮后，加入等體積的ExoQuick上下顛倒混勻，冷藏靜置過夜；混合物于4℃條件下，1 500×g離心30 min，棄上清，沉淀即為富集的外泌體，少部分沉淀重懸在1 mL的1×PBS中用作電鏡觀察，剩余的沉淀用含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液提取蛋白，-80 ℃冰箱保存備用。

1.5外泌體的電鏡觀察 取重懸在1×PBS中的外泌體溶液1滴，載于直徑2 mm的銅網上。滴加2%磷鎢酸溶液，室溫負染10 min，濾紙吸干負染液后白熾燈下烤干約2 min，將此銅網置于透射電鏡下，于80 kV下觀察外泌體形態，在鏡下用標尺量取外泌體的直徑并拍攝照片。

1.6外泌體蛋白的提取和定量 在富集的外泌體沉淀中，加入100 μL的蛋白裂解液混勻，冰上放置30 min以充分裂解外泌體，12 000×g，4 ℃離心15 min后取上清，分裝-80 ℃冰箱保存備用。Bradford法測定樣品蛋白的濃度，具體方法參照Coomassie Plus Protein Assay說明書。

1.7質譜分析 采用iTRAQ標記和高精度質譜鑒定相結合的同位素標記相對和絕對定量聯合液相色譜串聯質譜(iTRAQ-LC-MS/MS)策略。

1.7.1多肽濃度的檢測 酶切后的多肽樣品溶于1‰ FA后采用BCA法測定多肽濃度。標準品采用血管緊張素Ⅱ配成1.00、0.50、0.25、0.10、0.05及0.00 g/L的不同濃度梯度，取不同濃度的標準品10 μL和多肽樣品分別加入96孔板中，再加入200 μL配好的工作液，室溫放置10 min，顯色后在酶標儀的波長562 nm處測其吸光度，根據標準品的濃度及其相應的吸光度值制作標準曲線，計算出樣品濃度。

1.7.2iTRAQ標記 iTRAQ 4重標記試劑盒室溫平衡半小時后，加入70 μL乙醇混勻。在樣品中加入36 μL TEAB緩沖液，室溫下14 800 r/min離心5 min，棄去沉淀，將樣品溶液轉入新的離心管中，測pH值大于8時進行iTRAQ標記。將iTRAQ試劑加入含樣品的離心管中，振蕩混勻后離心，室溫避光反應2 h標記多肽。之后加入等體積的滅菌水終止反應，充分振蕩，高速離心后放入旋轉蒸發儀，真空干燥，標記的多肽可避光于-80 ℃冰箱保存。

1.7.3質譜鑒定 質譜條件設定為：掃描質荷比為400～1 800的離子；離子電荷數大于2；噴霧電壓設定為2 000 V；真空規溫度設定為250 ℃；一級質譜自動增益設定為1 000 000，分辨率設定為30 000；二級質譜自動增益設定為30 000，分辨率設定為7 500；母離子分離窗口設定為3；離子注射時間設定為150 ms。所得質譜圖用MASCOT軟件檢索，所用數據庫為人類的蛋白質數據庫(ftp.ncbi.nihIgov/)。

1.7.4蛋白定量結果校正與差異蛋白選取 將原始的蛋白定量結果進行log2轉換，然后分析定量結果的分布。如果定量結果為典型正態分布時，分別計算該正態分布的均值和標準差值；如果均值不為0，說明蛋白的上樣量有差異，需要通過校正的方法校正上樣量差異，將每個蛋白的定量結果均減去均值，新的值作為蛋白定量值，校正后的蛋白比值仍為正態分布，而其均值應為0。

差異蛋白的選取采用重復的方法進行顯著蛋白選取。計算每個蛋白在兩次重復之間定量結果之間的變化值，取95%的蛋白的變化值均小于設定值時的卡值作為顯著性蛋白選取的依據，蛋白比值大于該卡值的蛋白作為顯著性差異蛋白。

1.8生物信息學通路分析 KEGG通路分析工具采用DAVID數據分析軟件。將差異蛋白的基因名稱上傳至DAVID網站后，選擇Pathways選項進行通路富集分析，通路富集的參數為默認參數。采用PANTHER網絡分析軟件對差異蛋白進行細胞定位、分子功能、生物學過程的分析，將差異蛋白號上傳至PANTHER網站，種屬選擇人類，選擇對應的biological process、molecular function、cellular component選項進行分析。網絡富集分析采用IPA軟件進行，差異蛋白號及比值上傳至IPA網站后，選擇canonical pathways選項分析顯著性變化蛋白的經典通路富集。

1.9統計學處理 采用SPSS17.0統計學軟件進行統計學處理。ELISA數據結果根據適用情況選擇Mann-Whitney 檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.13種細胞系來源的外泌體的鑒定 采用ExoQuick試劑盒提取HCT116-p53(WT)、HCT116-p53(-/-)和HCT116-p53(R273H)細胞培養上清中的外泌體，在透射電鏡下觀察，如圖1A顯示3種細胞系來源的外泌體均呈大小不一的圓盤狀，由脂質雙分子層包裹的小囊泡，直徑在30～100 nm。圖1B展示的是用免疫印跡檢測3種細胞系分泌的外泌體標志性分子熱休克70(HSP70)，均在70×103處顯示出條帶信號。

注：A為3種細胞系來源的外泌體經負染后在透射電鏡下的形態，呈大小不一的圓盤狀，標尺為100 nm，放大倍數為120 000；B為免疫印跡檢測3種細胞系來源的外泌體的標志性蛋白HSP70，1代表細胞全蛋白，2代表外泌體蛋白。

2.23種細胞系分泌外泌體的差異表達蛋白質譜 將HCT116-p53(WT)-外泌體的蛋白設為reference 后，最終鑒定到3 437個蛋白，其中3 173個蛋白具有精確的定量信息；對這些蛋白進行整理，去除技術重復和生物重復各自的CV>0.5的數據后得到可信的蛋白數是3 003個。以P-value<0.05，卡值1.6，以及生物學重復ratio>0.625且<1.6為判斷標準，得到最終每組間的差異蛋白：HCT116-p53(WT)-外泌體和HCT116-p53(R273H)-外泌體有144個差異蛋白，HCT116-p53(WT)-外泌體和HCT116-p53(-/-)-外泌體有480個差異蛋白。其中有34個差異蛋白在HCT116-p53(WT)和HCT116-p53(R273H)組和HCT116-p53(WT)和HCT116-p53(-/-)組中共同存在，見圖2，主要富集了細胞周期相關的分子，包括E2F4、CCNB1、HSP90AA1、PCM1、PSMD12，這與TP53基因的主要功能是一致的。

圖2 HCT116-p53(WT)比HCT116-p53(R273H)與HCT116-p53(WT)比HCT116-p53(-/-)組的蛋白比較

2.3差異蛋白質的生物信息學分析 利用GO注釋分別分析了HCT116-p53(WT)比HCT116-p53(R273H)組和HCT116-p53(WT)比HCT116-p53(-/-)組差異蛋白的亞細胞定位、參與的生物學過程及其分子功能，顯示在圖3中，可以看出大部分差異蛋白定位于細胞質、細胞骨架、細胞外基質。主要參與代謝過程、細胞的生物學過程、免疫系統過程、細胞組分的組織、凋亡、應激、增殖、細胞黏附等生物學過程，在功能上主要分為催化活性、結合功能、轉錄翻譯調控、細胞骨架組裝、受體活性、物質轉運。

IPA分析顯示，HCT116-p53(WT)和HCT116-p53(R273H)組的差異蛋白主要富集在泛素化、mTOR信號通路、DNA損傷修復通路中，選擇性地富集了損傷修復因子、信號轉導分子等，HCT116-p53(WT)和HCT116-p53(-/-)組的差異蛋白主要集中在泛素化、EIF2信號通路、糖酵解通路中，如圖4。

注：A為兩組差異蛋白的亞細胞定位分析，左圖是HCT116-p53(WT)比HCT116-p53(R273H)組，右圖是HCT116-p53(WT)比HCT116-p53(-/-)組；B為左側為兩組差異蛋白參與的生物學過程，Y軸的百分比為相應蛋白質占全部具有生物學進程注釋蛋白質的比例；右側為兩組差異蛋白的功能分類，Y軸的百分比為相應的蛋白質占全部具有分子功能注釋蛋白質的比例；MT代表HCT116-p53(WT)比 HCT116-p53(R273H)組的差異蛋白，KO代表HCT116-p53(WT)比 HCT116-p53(-/-)組的差異蛋白。

注：A為是HCT116-p53(WT)比HCT116-p53(R273H)組的差異蛋白富集通路；B為HCT116-p53(WT)比HCT116-p53(-/-)組差異蛋白富集通路。

2.4差異蛋白RB1的血清學驗證 用ELISA試劑盒檢測了年齡、性別相匹配的61例健康對照者和62例CRC患者的血清RB1水平，性別組、年齡組和疾病組的RB1指標經K-S檢驗均為非正態分布，結果用M(P25～P75)表示，結果見表1。健康對照組血清RB1濃度中位數是0.512 3 ng/mL，檢測區間為0.081 5～2.469 0 ng/mL，而CRC患者的血清RB1濃度中位數是1.085 2 ng/mL，檢測區間為0.153 2～5.096 0 ng/mL。經過Mann-Whitney秩和檢驗，二者差異具有統計學意義(P<0.05)。同時，健康對照組中的血清RB1濃度與其年齡、性別之間差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 血清RB1表達水平及其臨床參數相關性[M(P25～P75)]

3 討 論

外泌體是由細胞內多泡體與細胞膜融后釋放到細胞外的納米級膜性小囊泡，直徑在30～100 nm之間，表面含有大量與其來源和功能密切相關的蛋白質和脂質成分，內部包含有miRNA、mRNA和蛋白，因為內部成分在脂質膜的保護下具有充分的生物學活性，可以有效發揮對受體細胞的調節作用[7]。作為一種新的信息傳遞載體，外泌體和靶細胞之間的相互作用可以憑借其表面的生物活性脂、膜受體的轉移、蛋白質的交付對靶細胞進行直接作用[8-9]，通過改變靶細胞的蛋白表達、基因調控網絡或者表觀遺傳編程等來發揮重要生物學功能[10]。

近年來針對結直腸癌細胞分泌的外泌體的研究屢有報道，比如研究發現CRC細胞的外泌體含有27種和細胞周期相關的mRNA，可有效促進內皮細胞的生長及血管形成[11-12]。用流式細胞術對CRC患者血漿中的外泌體進行定量，發現腫瘤患者的外泌體量顯著高于健康對照組，并且CRC患者血漿中外泌體的含量和CEA值的水平相一致，和腫瘤的分化程度及患者生存期相反[13]。有文獻證實，273位點是CRC TP53基因突變熱點，與腫瘤的發生密切相關[14-16]，因此TP53基因的273位點成為目前研究腫瘤發生、發展的熱點。腫瘤的發展離不開腫瘤微環境，所以確定突變的TP53對腫瘤微環境的影響是十分必要的。雖然目前已知突變的TP53是如何影響腫瘤細胞生物學行為，但突變的TP53對腫瘤細胞分泌到腫瘤微環境中的分泌蛋白質的影響卻知之甚少。為了檢測是否TP53的狀態影響外泌體的組成和行為，本文從TP53野生型、TP53突變型、TP53敲除型的HCT116結直腸癌細胞系培養上清中純化出外泌體進行研究。利用iTRAQ-LC-MS/MS對外泌體進行蛋白質組學分析，結果顯示TP53狀態可以改變外泌體的成分。本研究的結果提示突變的TP53可以通過外泌體改變細胞的信號釋放，為周圍的腫瘤細胞提供生長條件。盡管還并不清楚TP53突變是如何分選外泌體中蛋白的，但是結果顯示TP53突變型和TP53野生型的CRC細胞系分泌的外泌體差異蛋白主要富集在泛素化通路，而泛素化涉及外泌體內容物的分選[17]，所以推測突變的TP53通過影響外泌體中的泛素化蛋白來進一步調節分選其他內容物進入外泌體，從而為腫瘤的發展創造有利條件。

此外，本文從HCT116-p53(R273H)和HCT116-p53(WT)與HCT116-p53(-/-)和HCT116-p53(WT)這兩組差異蛋白中選擇及和CRC有關，并且與TP53(WT)相比均上調的視網膜母細胞瘤蛋白(RB1)進行后續的血清學驗證分析。RB1是一種細胞周期調控蛋白，可以通過抑制細胞周期進程防止細胞過度生長，被CDK3/cyclin-C磷酸化后促進細胞周期從G0至G1轉變。RB1還是一種染色體改造酶(甲基化酶和乙酰化酶)的招募蛋白。這個基因缺陷可以引起兒童視網膜母細胞瘤、膀胱癌、骨肉瘤，在多種腫瘤中為一種抑癌蛋白。研究顯示，RB1功能的丟失能充分誘導干細胞不受控的增殖[18]。然而，與它作為抑癌蛋白經典的角色相矛盾，CRC細胞保留抑癌蛋白RB1的表達，CRC組織較癌旁組織表達的RB1水平更高，并且較少發生RB1基因的丟失或者突變[19]。RB1基因在CRC中的mRNA和蛋白表達水平都比正常腸黏膜要高，RB1在人類多種腫瘤中都是滅活的，目前公認CRC中RB1蛋白的活性通常是存在甚至是放大的[20]。此外，研究發現RB1蛋白和通常在CRC高表達的抗凋亡Bcl-2相關的永生基因蛋白(BAG-1)相互作用，CRC中RB1的表達受到BAG-1抗凋亡活性的嚴格控制。與之前的報道一致，核內的BAG-1通過提高NF-κB的活性來促進細胞生存，研究人員證實了BAG-1提高NF-κB活性的能力可以被RB1表達抑制而抑制。因此，RB1可能有個新的功能，即通過調節BAG-1的功能促進細胞生存[21]。本文在年齡、性別相匹配的61例健康成人和62例CRC患者的血清中利用ELISA檢測了RB1水平。結果表明，CRC患者的血清RB1水平明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(P=0.001 2)，與本文的iTRAQ定量結果相吻合。

綜上所述，可以推測表達高水平RB1的外泌體作為腫瘤細胞間信號交流的介質，可以抑制腫瘤細胞的凋亡，從而促進腫瘤的進展。