探討血清lncRNA聯(lián)合檢測(cè)CEA、CA724、CA199在胃癌診斷中的臨床意義*

吳雯婷，陳 惠，劉 毅，榮婷婷，沈立松

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200092

胃癌(GC)是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。近期，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)發(fā)布的全球最新癌癥數(shù)據(jù)顯示，2020年全球惡性腫瘤發(fā)病率GC排名第五，死亡率排名第四[1]。在我國(guó)，GC的發(fā)病率與死亡率僅次于肺癌，位居第二[2]。目前，GC的診斷依賴于內(nèi)窺鏡檢查、病理檢查和血清腫瘤標(biāo)志物，主要包括癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA)199、CA724、CA50等檢測(cè)。內(nèi)窺鏡和病理檢查雖然是GC診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于其取材困難和患者痛苦較大，且血清腫瘤標(biāo)志物的靈敏度與特異度不高，因此需要優(yōu)化GC的診斷策略與檢測(cè)手段。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)為不編碼蛋白質(zhì)的RNA,其長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸[3]。通過(guò)大量研究發(fā)現(xiàn)，IncRNA在GC、肝癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤中都有表達(dá)失調(diào)的現(xiàn)象[4-6]。有研究報(bào)道，F(xiàn)OXD2-AS1、含銅胺氧化酶4的假基因(AOC4P)在多種癌癥中如鼻咽癌(NC)、肝細(xì)胞癌(HCC)、GC等都可以升高。目前尚鮮見(jiàn)有關(guān)其在GC血清中表達(dá)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)GC患者和健康對(duì)照者血清FOXD2-AS1、AOC4P以及腫瘤標(biāo)志物CEA、CA199、CA724的表達(dá)水平，比較其差異，探討血清FOXD2-AS1、AOC4P及其與CEA、CA199、CA724聯(lián)合檢測(cè)對(duì)GC的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年12月至2020年5月在本院住院治療的經(jīng)組織病理學(xué)確診的GC患者80例作為研究對(duì)象,其中男46例,女34例,平均年齡(63.56±11.60)歲，并根據(jù)AJCC第八版進(jìn)行TNM分期。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)GC患者經(jīng)病理確診;(2) 入院時(shí)為初診GC患者，且術(shù)前均未接受放、化療治療。另外選取在本院進(jìn)行健康體檢的體檢健康者85例作為對(duì)照者，其中男42例，女43例，平均年齡(56.68±12.15)歲。

1.2儀器與試劑 血清總RNA提取試劑(德國(guó)QIAGEN公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑(Takara公司)；PCR擴(kuò)增試劑(上海YEASEN公司)。 QuantStudioTMDx實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；NanoDrop 2000分光光度計(jì)(美國(guó)THERMO公司)；Cobas 8000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀(瑞士Roche公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Revco)；無(wú)菌超凈臺(tái)(Labconco)；細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM，Hyclone，USA)；胎牛血清(FBS，Gibco，USA)。

1.3方法 標(biāo)本的采集及處理：采集所有研究對(duì)象外周靜脈血3 mL，4 000 r/min離心5 min，將血清置于RNAse-free的Eppendorf管中，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

血清RNA的抽提：使用血清總RNA提取試劑(德國(guó)QIAGEN公司)提取血清RNA，使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，選取(A)值(A260/A280)在1.68～2.00的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑(Takara公司)說(shuō)明書(shū)配置20 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。合成的cDNA放-80 ℃冰箱凍存。

引物設(shè)計(jì)與合成：lncRNA RNU1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)：使用QuantStudioTMDx實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，按照Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(High Rox Plus)(上海YEASEN公司)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)體系的配置。反應(yīng)體系如下：SYBER Green Master Mix 5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)0.2 μL，cDNA模板1 μL，無(wú)菌超凈水3.8 μL，共10 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取其均值。通過(guò)熔解曲線評(píng)估擴(kuò)增產(chǎn)物的特異度。應(yīng)用2-ΔΔCt方法計(jì)算血清lncRNA相對(duì)表達(dá)量。

血清CEA、CA199、CA724檢測(cè)：使用Cobas 8000全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀(瑞士Roche公司)及其配套試劑對(duì)入組GC患者及健康對(duì)照者血清檢測(cè)CEA、CA199、CA724的水平。

2 結(jié) 果

2.1FOXD2-AS1、AOC4P在細(xì)胞株中的表達(dá)及定位情況 FOXD2-AS1、AOC4P在6種不同GC細(xì)胞株中(BGC-823、SGC-7901、MGC-803、HGC-27、MKN-45、AGS)中均有表達(dá)，表明FOXD2-AS1、AOC4P可以作為GC診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志。同時(shí)本研究進(jìn)一步檢測(cè)了這兩種lncRNA在GC細(xì)胞株MGC-803的定位情況，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FOXD2-AS1更多是在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而AOC4P更多是在細(xì)胞核中。見(jiàn)圖1。

2.2GC組織與癌旁組織、GC患者與健康對(duì)照者lncRNA的表達(dá)差異 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，F(xiàn)OXD2-AS1在GC中明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4。另對(duì)16組GC組織及癌旁組織的AOC4P進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示AOC4P在GC中明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對(duì)52例初診GC患者、51例健康對(duì)照者血清FOXD2-AS1、AOC4P進(jìn)行檢測(cè)，F(xiàn)OXD2-AS1的相對(duì)表達(dá)量分別為0.054(0.033～0.085)和0.015(0.005～0.027)；AOC4P的相對(duì)表達(dá)量分別為1.470(0.987～3.472)和0.093(0.030～0.677)。GC初診患者血清FOXD2-AS1(Z=-6.636，P<0.01)、AOC4P(Z=-6.227，P<0.01)的相對(duì)表達(dá)量明顯高于健康對(duì)照者。見(jiàn)圖2。

注：A為FOXD2-AS1在不同細(xì)胞株中的表達(dá)；B為AOC4P在不同細(xì)胞株中的表達(dá)；C為FOXD2-AS1、AOC4P在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)。

注：A為TCGA中FOXD2-AS1在GC組織及癌旁組織中的表達(dá)；B為AOC4P在GC組織及癌旁組織中的表達(dá)；C為FOXD2-AS1在GC及健康對(duì)照者中的表達(dá)；D為AOC4P在GC及健康對(duì)照者中的表達(dá)。

2.3GC患者和健康對(duì)照者CEA、CA199和CA724的表達(dá)差異 對(duì)52例初診GC患者、83例健康對(duì)照者血清腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 GC患者和健康對(duì)照者CEA、CA199和CA724的表達(dá)差異

2.4血清FOXD2-AS1、AOC4P的相對(duì)表達(dá)量對(duì)GC的診斷效能 ROC曲線分析結(jié)果顯示，F(xiàn)OXD2-AS1、AOC4P、CEA、CA199和CA724的曲線下面積(AUC)別為0.879、0.856、0.699、0.654和0.626；其靈敏度分別為90.38%、84.62%、40.38%、32.69%和67.31%，特異度分別為74.51%、76.47%、80.39%、96.08%和56.86%。見(jiàn)圖3。

圖3 GC患者血清FOXD2、CEA、CA199、CA724的單獨(dú)ROC曲線分析

2.5血清FOXD2-AS1、AOC4P相對(duì)表達(dá)量與CEA、CA199、CA724聯(lián)合診斷對(duì)GC的診斷效能 通過(guò)檢測(cè)初診GC患者血清FOXD2-AS1、AOC4P的相對(duì)表達(dá)量和CEA、CA199、CA724的濃度，分別計(jì)算FOXD2-AS1、AOC4P與CEA、CA199、CA724聯(lián)合診斷的GC的靈敏度、特異度。用多元Logistic回歸模型預(yù)測(cè)FOXD2-AS1、CEA、CA199和CA724聯(lián)合檢測(cè)診斷GC時(shí)的AUC最高為0.917，靈敏度和特異度分別為94.23%和74.51%，見(jiàn)表3及圖4。

圖4 FOXD2-AS1、AOC4P與CEA、CA199、CA724聯(lián)合診斷的ROC曲線

表3 FODX2-AS1、AOC4P、CEA、CA199及CA724的單獨(dú)或聯(lián)合診斷效能

2.6GC患者血清FOXD2-AS1、AOC4P表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 分析GC患者血清FOXD2-AS1、AOC4P的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其與年齡、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4與表5。

表4 GC患者FOXD2-AS1表達(dá)水平與病理特征的關(guān)系

續(xù)表4 GC患者FOXD2-AS1表達(dá)水平與病理特征的關(guān)系

表5 GC患者AOC4P表達(dá)水平與病理特征的關(guān)系

3 討 論

GC是起源于胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，由于GC早期癥狀隱匿，缺乏比較可靠的早期診斷標(biāo)志物。目前我國(guó)臨床診斷GC仍依賴于內(nèi)窺鏡、病理檢查以及血清腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，但血清腫瘤標(biāo)志物靈敏度和特異度不高，內(nèi)窺鏡篩查率低，導(dǎo)致多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，其5年存活率僅25.00%[7]。因此，深入研究GC的發(fā)病機(jī)制和探索新型分子生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)GC的早期診斷及治療有重要意義。

有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可以通過(guò)調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平等方面，最終影響GC細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等[8]。血液樣本因其易獲得且低侵襲性等優(yōu)點(diǎn)被視為更理想的檢測(cè)樣本，可用于檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)從而能夠早期發(fā)現(xiàn)癌癥并對(duì)患者進(jìn)行預(yù)后預(yù)測(cè)[9-10]。有報(bào)道證實(shí),外周血中l(wèi)ncRNAs性質(zhì)穩(wěn)定，表達(dá)水平不受外源性RNA酶和溫度改變的影響[11-12]。

AOC4P是長(zhǎng)度為2 073 bp的lnc RNA,目前為止AOC4P的功能只在結(jié)腸癌和肝細(xì)胞癌中進(jìn)行了研究[13-14]。在結(jié)腸癌中，AOC4P(也稱為 UPAT)在高致腫瘤結(jié)腸癌細(xì)胞中通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的普及和降解參與癌細(xì)胞的表觀遺傳調(diào)節(jié)[14]。在肝癌中,AOC4P表達(dá)降低是疾病預(yù)后不良的因素之一,可以作為肝癌的獨(dú)立預(yù)后因子[15]。目前尚未見(jiàn)AOC4P在血清中的表達(dá)與GC相關(guān)性的研究。而本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AOC4P在不同GC細(xì)胞株中均可表達(dá)，表明AOC4P可以作為GC診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。本研究還通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AOC4P大多是在細(xì)胞核中表達(dá)，但是血清中AOC4P的表達(dá)并不低。AOC4P可能通過(guò)外泌體釋放入細(xì)胞外和體液中。有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可以幫助細(xì)胞核中的lncRNA釋放入外周循環(huán)[16]。轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的過(guò)程，包括腫瘤細(xì)胞侵入原腫瘤部位的局部組織，侵入血液和淋巴血管，以及轉(zhuǎn)移地點(diǎn)的適應(yīng)和增殖。有證據(jù)表明，外泌體參與所有轉(zhuǎn)移過(guò)程[17]。

FOXD2-AS1位于 1p33 染色體，與癌癥的惡化和進(jìn)展有關(guān)。有研究報(bào)道，F(xiàn)OXD2-AS1在幾種癌癥中如鼻咽癌(NC)、肝細(xì)胞癌(HCC)、GC等都可以升高[18-20]。然而，F(xiàn)OXD2-AS1表達(dá)與癌癥臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)仍然具有爭(zhēng)議性。XU等[20]發(fā)現(xiàn)FOXD2-AS1表達(dá)與腫瘤大小、TNM階段和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，但與性別、年齡的差異無(wú)關(guān)。SU等[21]報(bào)告說(shuō)，高FOXD2-AS1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化無(wú)關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FOXD2-AS1與年齡、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，與上述研究結(jié)果相符。但是本課題研究的是血清中的FOXD2-AS1的表達(dá)，與組織中的FOXD2-AS1研究結(jié)果可能不一致。并且由于標(biāo)本量小，因此需要擴(kuò)大標(biāo)本量深入探討FOXD2-AS1和AOC4P與臨床病理特征之間的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，GC初診患者血清中 FOXD2-AS1和AOC4P的相對(duì)表達(dá)量明顯高于健康對(duì)照者，說(shuō)明二者對(duì)診斷GC有明顯的臨床價(jià)值。

另外，本研究通過(guò)ROC曲線分析，結(jié)果顯示FOXD2-AS1和AOC4P的曲線下面積AUC別為0.879和0.856，而單獨(dú)檢測(cè)CEA、CA199、CA724的曲線下面積僅為0.620、0.595和0.634，說(shuō)明lncRNA相比較傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物能更好地作為區(qū)別GC患者與健康人群及對(duì)照人群的指標(biāo)。本研究還分別分析了FOXD2-AS1與AOC4P與 CEA、CA19-9、CA724聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXD2-AS1與CEA、CA199、CA724聯(lián)合檢測(cè)時(shí)AUC(0.917)、靈敏度(94.23%)最高，并且與單獨(dú)檢測(cè)各項(xiàng)目AUC相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究結(jié)果顯示血清中FOXD2-AS1、AOC4P的表達(dá)水平可作為輔助GC診斷的良好指標(biāo)，且FOXD2-AS1與CEA、CA199和CA724聯(lián)合檢測(cè)可提高對(duì)GC的診斷效能。但由于其致病機(jī)制尚不明確，且本研究病例數(shù)量較少，因此需要更大臨床樣本研究進(jìn)一步證明。