線性和非線性定量在同位素稀釋質譜法中應用的比較*

馬妍慧,皇甫昱嬋,周韻斕,沈立松

上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院檢驗科，上海 200092

質譜(MS)定量通常使用穩(wěn)定同位素標記(SIL)的分析物作內標(IS)，并通過分析物和IS峰面積比值進行定量。IS用于校正樣品制備、進樣、電離和儀器性能的變化，加入IS的定量方法能夠提高方法的準確度和精度。

穩(wěn)定同位素標記的內標在MS準確定量定性方面具有很大的實用性。然而，在某些情況下，分析物天然存在的同位素或者內參標準品中存在沒有被標記的目標分析物，均對二者信號存在一定“串擾”。對于富含同位素的化合物，例如含有硫、氯或溴的化合物，或是相對分子質量更大的化合物，以及分析物或內標濃度比高的化合物，這種現(xiàn)象變得更加明顯[1-2]。這可能會導致非線性響應的情況出現(xiàn)，影響定量結果[3]。在這些情況下，如果使用非線性回歸，通過實驗確定每個分析物或內標組合的可調校準參數(shù)(如確定一個或兩個常數(shù))，數(shù)據(jù)擬合可能會更準確。因存在分析物中穩(wěn)定同位素的信號，非線性擬合在基于MS測定中提供更準確的定量[2]。相反，它亦可校正同位素內標中分析物作為雜質的存在情況。本文利用已獲得的同位素稀釋質譜法檢測伊立替康(CPT-11)及其代謝產物的數(shù)據(jù)[4]，分析了線性和非線性擬合[5]的比較與實際應用。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 儀器：高效液相色譜(HPLC)儀Agilent 1260(美國Agilent公司)、三重串聯(lián)四級桿質譜API 3200及電噴霧離子源。試劑：CPT-11(純度≥97%)、SN-38(純度≥98%)、SN-38G(純度≥97%)均購自美國Sigma-Aldrich公司；APC(純度≥97%)和IS CPT-11 D10、SN-38 D3、SN-38G D3和APC D3購自Toronto Research Chemicals，Inc(圖1)；乙腈和醋酸(HPLC級)，二甲基亞砜(DMSO)購自德國Merck公司，去離子水制備自美國Milli-Q Plus純水系統(tǒng)。從上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院檢驗科實驗室的7例健康志愿者那里收集空白EDTA血漿，混合后制備標準品和質量控制(QC)樣品。

圖1 標準品及相應同位素內標結構式

1.2液相色譜條件 色譜柱菲羅門反相C18色譜柱 (4.6 mm×50 mm,2.6 μm)，柱溫30 ℃；流動相A為水(含0.1%醋酸，V/V)，B為乙腈(含0.1%醋酸，V/V)，流速300 μL/min，進樣量為15 μL。采用梯度洗脫，前1 min為95%流動相A，>1～7 min為95%流動相A至5%流動相A，>7.0～7.5 min為5%流動相A,>7.5～8.0 min為5%流動相A至95%流動相A，并持續(xù)此梯度至9 min，總時間為9 min。質譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描模式，毛細管電壓4 500 V，干燥氣為氮氣(N2)，溫度180 ℃，流速4 L/min，霧化氣壓力0.4 bar；碰撞氣為N2，碰撞能量為8 eV；掃描質量范圍為質荷比(m/z) 50～1 000。采用多離子反應監(jiān)測模式，定量離子通道選擇m/z CPT-11 m/z 587.216>124.3，SN-38 m/z 393.3>349.2，SN-38G m/z 569.2>393.3，APC m/z 619.2>393.3，CPT-11 D10 m/z 597.3>133.3，SN-38 D3 m/z 396.2>352.3，SN-38G D3 m/z 572.1>396.2，APC D3 m/z 622.3>396.2。

1.3試劑、校準曲線和QC樣本制備 所購買試劑均為1 mg，CPT-11、CPT-11 D10和SN-38、SN-38 D3溶于DMSO獲得終質量濃度分為5 000、1 000、100、1 000 μg/mL儲存液，SN-38G、SN-38G D3和APC、APC D3溶于DMSO∶甲醇(50∶50)獲得終濃度分為100、1 000、5 000、1 000 μg/mL儲存液。儲備液均分裝于2 mL離心管中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ诨旌先搜獫{中準確加入4種標準品和內參儲備液，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｖ谱餍是€時，溶解后漩渦混勻，2倍稀釋后得到CPT-11和APC濃度為2 500、1 250、625、312.5、156.3、78.1、39.1、19.5、9.8、4.9 μg/mL，SN-38和SN-38G濃度為1 000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、2.0、1.0 ng/mL的混合標準溶液。制備200×混合內參儲存液，工作液終濃度分別為CPT-11 100 ng/mL、APC 100 ng/mL、SN-38 50 ng/mL、SN-38G 100 ng/mL。制備高、中、低3種濃度QC血漿樣本，CPT-11為80、400、1 000 ng/mL；SN-38 和 SN-38G為15、100、400 ng/mL；APC為40、200、400 ng/mL，所有QC樣本制備后分裝，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4樣本前處理 準確吸取200 μL EDTA-K2抗凝血漿樣本，加入5 μL混合內標工作液(200×)，加入795 μL乙腈蛋白沉淀，振蕩混勻后4 ℃ 16 000 g高速離心10 min，吸取900 μL 上清，置于35 ℃ N2吹干，再以100 μL 0.1% 醋酸水和乙腈(50∶50)溶液復溶，15 μL進樣分析。樣本重復檢測5次，取均值。

1.5標準曲線分析 以Excel中LINEST擬合分析功能分析線性回歸、曲線回歸(二次函數(shù)和三次函數(shù))和有理多項式逼近函數(shù)Padé[1,1]近似，y=(a0+ a1x)/(1-a2x)。

表1 LINEST常用分析

2 結 果

2.1同位素稀釋質譜法分析CPT-11及其代謝產物和內參色譜結果 在本實驗條件下，4種物質(1 μg/mL)的混合標準溶液，采用正離子模式電噴霧離子化后，根據(jù)保留時間依次出峰時間分別為SN-38G(4.61 min)、APC(4.65 min) CPT-11(4.72 min)和SN-38(5.16 min)，與各相應同位素內參保留時間一致，見圖2A。標準品單獨分析時，SN-38和SN-38 D3洗脫峰在5.16～5.21 min，其他時間沒有峰出現(xiàn)(圖2A和2B)。但混合標準品和內參后，在SN-38G D3(50 ng/mL)色譜結果中提取到SN-38碎片離子峰(圖2C)，CPT-11 D10中亦可提取SN-38離子峰。考慮SN-38主要結構均存在于CPT-11、SN-38G和APC分子結構中，發(fā)生源內裂解時可能存在部分交叉。

圖2 CPT-11及其代謝產物色譜圖和SN-38、SN-38 D3 提取m/z 393.3>349.2離子色譜圖

2.2數(shù)據(jù)分析 實驗室對CPT-11的校準范圍是4.9～2 500.0 ng/mL，方法線性定量范圍9.8～1 250.0 ng/mL。應用LINEST分析4種標準曲線，外推校準曲線見圖3。4種計算公式分別為：線性函數(shù)y=91.51x-48.59；二次函數(shù)y=0.167x2+83.02x-19.40；三次函數(shù)y=-0.009 3x3+0.88x2+71.10x-0.55；Padé[1,1]y=(-19.60+83.32x)/(1-0.001 8x)，R2均>0.999。二次函數(shù)、三次函數(shù)曲線回歸和Padé[1,1]近似3種濃度QC計算結果偏差10%以內(表2)。

表2 基于同位素稀釋質譜法的4種標準曲線計算CPT-11 QC樣本偏差

續(xù)表2 基于同位素稀釋質譜法的4種標準曲線計算CPT-11 QC樣本偏差

對SN-38的校準范圍是1.0～1 000.0 ng/mL，方法線性定量范圍2.0～500.0 ng/mL。應用LINEST分析4種標準曲線，外推校準曲線，見圖4。SN-38 4種計算公式分別為：線性函數(shù)y= 133.3x-4.22；二次函數(shù)y=0.018x2+133.24x-4.2；三次函數(shù)y=-3.99x3+21.16x2+109.44x-1.5；Padé[1,1]Y=(-4.13+132.93x)/(1-0.000 8x)，R2均>0.999。線性回歸、二次函數(shù)曲線回歸和Padé[1,1]近似3種濃度QC計算結果偏差10%以內(表3)。

注：黑色虛線為線性方程，正方形表示曲線為二次函數(shù)，三角形表示曲線為三次函數(shù)，十字曲線為Padé[1,1]近似。

注：黑色虛線為線性方程，正方形表示曲線為二次函數(shù)，三角形表示曲線為三次函數(shù)，十字曲線為Padé[1,1]近似。

表3 基于同位素稀釋質譜法的4種標準曲線計算SN-38 QC樣本偏差

對SN-38G的校準范圍是1.0～1 000 ng/mL，方法線性定量范圍2.0～500.0 ng/mL。應用LINEST分析4種標準曲線，外推校準曲線，見圖5。SN-38G 4種計算公式分別為：線性函數(shù)y=41.91x-9.15；二次函數(shù)y=1.62x2+24.62x+4.64；三次函數(shù)y=0.25x3-2.53x2+40.57x-2.04；Padé[1,1]y=(3.3+27.7x)/(1-0.031 4x)，R2均>0.999。二次函數(shù)和三次函數(shù)曲線回歸，Padé[1,1]近似3種濃度QC計算結果偏差15%以內(表4)。

表4 基于同位素稀釋質譜法的4種標準曲線計算SN-38G QC樣本偏差

對APC的校準范圍是4.9～2 500.0 ng/mL，方法線性定量范圍9.8～625.0 ng/mL。應用LINEST分析4種標準曲線，外推校準曲線見圖6。4種計算公式分別為：線性y=123.85x-211.96，R2=0.989；二次函數(shù)y=2.65x2+32.45x+40.96；三次函數(shù)y=0.071 5x3-1.204x2+80.81x-27.67；Padé[1,1]y=(-2.71+60.54x)/(1-0.014 7x)，R2均>0.999。只有Padé[1,1]近似3種濃度QC計算結果偏差10%以內(表5)。

注：黑色虛線為線性方程，正方形表示曲線為二次函數(shù)，三角形表示曲線為三次函數(shù)，十字曲線為Padé[1,1]近似。

注：黑色虛線為線性方程，正方形表示曲線為二次函數(shù)，三角形表示曲線為三次函數(shù)，十字曲線為Padé[1,1]近似。

表5 基于同位素稀釋質譜法的4種標準曲線計算APC QC樣本偏差

3 討 論

復雜物質組分含量的定量分析是當前醫(yī)學檢驗研究中的重要問題之一，而質譜分析技術在生物醫(yī)學領域的迅速應用無疑提供了強有力的分析手段。校準曲線的準確度也決定了樣本定量的準確度。在生物分析和臨床化學領域中，通常以線性擬合用于校準曲線，非線性的校準并不常用[6-8]。但同位素稀釋質譜法常常存在非線性響應，當實驗者觀察到非線性響應時，通常會采用經(jīng)驗多項式(一般以二次函數(shù)曲線擬合為主)來表示觀察到的曲率，而忽略非線性的物理基礎。盡管所有二次函數(shù)都是非線性的，但并非所有非線性方程都是二次的，且對于重要的校準數(shù)據(jù)，某些非二次非線性方程可以適當?shù)赜米餍屎瘮?shù)。為探討此問題，本實驗采用同位素稀釋質譜法對伊立替康及其3種主要代謝產物進行檢測，進行線性和非線性擬合，以及一種非二次非線性擬合方程對數(shù)據(jù)進行分析。

本文對每種化合物均使用了IS，用以更好地完成校準曲線和(或)校正基質效應等影響因素。同時，本文發(fā)現(xiàn)CPT-11 D10中存在相對少量的SN-38(SN-38 D3中的程度較小)會導致SN-38的校準曲線出現(xiàn)問題，推測SN-38檢測下限(LLMI)應該不低于2.0 ng/mL，代謝產物APC亦存在類似情況。本文初步實驗中沒有發(fā)現(xiàn)該方法存在其他重要問題，無殘留效應，批內和批間精密度CV<10%[9]，QC樣品的加標回收率準確性，以及基質效應和樣本回收率均根據(jù)MATUSZEWSKI等[10]確定的比例都在80%～120%，多數(shù)在85%～115%。

實驗中所有的擬合分析是利用Excel中LINEST函數(shù)公式完成，線性擬合未采用加權最小二乘法分析，因此可見CPT-11、SN-38G和APC 3種分析物低濃度時偏差>15%，但如果采用1/x2加權系數(shù)，可能意味著高濃度QC樣本結果出現(xiàn)偏差>15%。SN-38是CPT-11的活性代謝產物，APC和SN-38G是其無活性代謝產物，4種分析物共享主要結構(SN-38)，而且現(xiàn)有商品化標準品種純度不可能達到100%。從4種分析物的4種校準曲線擬合分析結果看，不同的分析物對線性函數(shù)、二次函數(shù)、三次函數(shù)和Padé[1,1]近似4種方程的偏向性存在不同。總體而言，在不采用加權系數(shù)分析時，Padé[1,1]近似獲得的校準曲線中，高中低3種QC偏差相對更小且穩(wěn)定。

對于分析物定量分析而言，尤其是采用穩(wěn)定同位素作為內參時，并非所有的分析方法都符合線性響應函數(shù)。因此，不同的實驗室為避免基于同位素的定量分析中的非線性校正亦采用不同的分析方法，包括：忽略非線性部分的數(shù)據(jù)，使用反比建立線性函數(shù)[11]；應用偏最小二乘回歸統(tǒng)計加權方案來抵消非線性的影響[11]或將坐標變換對數(shù)值。但在同位素稀釋質譜方法中，尤其對于多種結構相似分析物及其同位素內標物的混合物，這兩種物質的同位素比和質量比之間的一般關系既不是線性也不是多項式。相反，它是兩個線性函數(shù)的比率[5]。本文建議實驗中優(yōu)先以線性擬合校準曲線，但同位素稀釋校準曲線擬合時，線性或曲線可能會引入不必要的誤差，此時可應用有理Padé[1,1]近似方程和線性最小二乘擬合來避免這些誤差。