腫瘤教育血小板源性miRNA-122和miRNA-21在肝癌早期診斷中的應用研究*

余戀雨，王 宇，唱 凱，陳 鳴

陸軍軍醫大學第一附屬醫院檢驗科，重慶 400038

肝細胞癌(HCC)是世界上最具破壞性的惡性腫瘤之一，其發病率在所有惡性腫瘤中排名第5位，死亡率排名第3位[1]。HCC起病隱匿，早期往往無明顯癥狀，易漏診或誤診，臨床癥狀明顯者病情大多已進入中晚期，亟待靈敏度更高特異度更強的肝癌標志物來及早甄別出早期患者。

血小板是外周血中豐富的無核細胞碎片，具有形成血栓、監測外周血中的病原體、與免疫細胞相互作用等多種功能。更重要的是，它們可以接受癌細胞的“教育”。血小板在整個生命周期中可以吸收并攜帶蛋白質和核酸等物質，包括mRNA、pre-mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA和線粒體RNA等。在腫瘤組織的發生、發展過程中，腫瘤細胞可以直接或者間接通過不同的信號分子或受體影響血小板的RNA信息及蛋白質水平，形成受腫瘤教育的血小板(TEP)[2-3]。研究表明,TEP RNA正逐漸成為疾病診斷和預后的潛在新型血清生物標志物[4]。TEP RNA作為癌癥診斷的生物標志物有許多優點：(1)血小板不含細胞核，因此受到來自基因組DNA的干擾非常小；(2)血小板易于收集、分離和分析，易于在普通臨床實驗室中標準化；(3)TEP miRNA對外界刺激反應迅速，能夠為癌癥的進展提供動態miRNA信號，這可能使早期檢測癌癥具有更好的靈敏度[5]。

作為TEP RNA中含量最高的RNA，miRNA是一種小的(20～24個核苷酸)非編碼RNA，通過負向調控靶mRNA來調節基因表達和細胞過程[6]。miRNA譜具有不同的細胞類型，并產生不同的功能。肝臟miRNA譜可通過調節肝臟代謝，在肝臟損傷、纖維化和腫瘤的發展中發揮重要作用，包括miRNA-122、miRNA-194/192、miRNA-223、miRNA-21、miRNA-155等。其中，miRNA-122是一種肝臟特異性的miRNA，是肝臟發育和肝臟疾病中的關鍵調控因子，研究表明，miRNA-122在HCC患者肝臟組織中的表達顯著下調，但是在外周循環中表達上調[7-8]。miRNA-21是血液循環中檢測到的最豐富的miRNA之一，幾乎在所有實體癌癥中高表達，在腫瘤細胞中起著抗凋亡、促存活的作用[9-10]。本研究探討腫瘤教育血小板源性的 miRNA-122和miRNA-21在HCC中的表達水平，并評估其對HCC的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2021年12月在本院采集的15例原發性肝癌患者和15例健康受試者的臨床剩余全血樣本2 mL，分別歸入肝癌組和健康對照組。其中肝癌組男8例，女7例，年齡35～56歲，平均(47.67±6.42)歲；健康對照組男8例，女7例，年齡28～58歲，平均(44.60±9.61)歲。兩組間性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。本研究納入的原發性肝癌患者均按照中國臨床腫瘤學會制定的《原發性肝癌診療指南2020》明確診斷。排除標準：(1)已經外科手術治療或多次化療；(2)伴有心、肺等其他重要臟器嚴重功能不全；(3)伴有嚴重感染性疾病(包括細菌、病毒、支原體、衣原體感染等)；(4)伴有嚴重精神疾病；(5)血液標本明顯有脂血、渾濁、污染等情況。本研究經本院倫理委員會批準，受試者均獲得書面知情同意。

1.2方法

1.2.1血小板分離提取(低速離心法) 將所收集的2 mL全血樣本于室溫下，120×g離心10 min提取上清獲得富血小板血漿后再次120×g離心10 min去除血漿中殘留的紅細胞和白細胞。使用全自動血細胞分析儀計數血小板以確認血小板被成功分離提取。隨后在室溫下360×g離心20 min，去除上清以獲得血小板沉淀。

1.2.2血小板中總RNA的提取以及實時熒光定量PCR(RF-qPCR) 將所獲得的血小板沉淀用miRNA提取試劑盒(德國Qiagen)進行總miRNA提取后，用NanoPhotometer?N50對RNA的濃度和純度進行檢測，隨后采用miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit(莖環法，中國生工)將上述總miRNA逆轉錄為cDNA，最后使用2×SG Fast qPCR Master Mix Kit(中國生工)檢測miRNA-122和miRNA-21的表達水平，并根據2-ΔΔCt方法以U6為內參分別計算它們的相對表達量。其中，hsa-miR-122-5p的莖環法逆轉錄引物序列為 5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACC AAA CA-3′，PCR正向引物序列為5′-AAC ACG CTG GAG TGT GAC AA-3′，反向引物序列為 5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′； hsa-miR-21-5p的逆轉錄引物序列為 5′-CTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG AGT CAA CA-3′，PCR正向引物序列為5′-CGC GCG CGT AGC TTA TCA GAC TGA-3′，反向引物序列為 5′-ATC CAG TGC AGG GTC CGA GG-3′；內參基因U6的逆轉錄引物序列為 5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA TA-3′，PCR正向引物序列為5′-AGA GAA GAT TAG CAT GGC CCC TG-3′，反向引物序列為5′-ATC CAG TGC AGG GTC CGA GG-3′。

2 結 果

2.1TEP miRNA-122在健康對照組和肝癌組血漿中的相對表達量 肝癌組TEP miRNA-122的相對表達量(11.94±6.28)明顯高于健康對照組(1.76±1.37)，差異有統計學意義(P<0.0001)。見圖1。

注：A為miRNA-122相對表達量；B為miRNA-122相對量，***P<0.000 1。

2.2TEP miRNA-21在健康對照組和肝癌組血漿中的相對表達量 肝癌組TEP miRNA-21的相對表達量(3.47±1.69)高于健康對照組(1.10±0.53)，差異有統計學意義(P<0.000 1)。見圖2。

注：A為miRNA-122相對表達量；B為miRNA-122相對量，***P<0.000 1。

2.3TEP miRNA-122和miRNA-21對原發性腫瘤的診斷價值 繪制TEP miRNA-122和miRNA-21診斷原發性肝癌的ROC曲線，結果顯示，TEP miRNA-122的曲線下面積(AUC)為0.987(95%CI：0.955～1.018)，當最佳截斷值為4.46時，約登指數最高，診斷原發性肝癌的靈敏度為93.3%，特異度為100.0% ；TEP miRNA-21的AUC為0.916(95%CI：0.819～1.012)，當最佳截斷值為1.88時，約登指數最高，診斷靈敏度為80.0%，特異度為93.3%。見圖3。

圖3 TEP miRNA-122和miRNA-21診斷原發性肝癌的ROC曲線

3 討 論

早期診斷、早期治療和精準個體化治療是目前癌癥醫療方面的目標，血清學標志物輔助檢查結合影像學方法是主流的診斷肝癌的辦法，但他們早期診斷的檢出率不高，對于肝癌早期診療的價值有限[11]。液體活檢通過檢測腫瘤釋放到血液中的循環游離DNA、miRNA等核酸分子，以及腫瘤血小板、循環腫瘤細胞、外泌體等結構可以突破組織病理活檢的限制，提高血清學標志物的靈敏度和特異度，同時具有非侵入性檢測、均質化腫瘤異質性、可重復性高、耗時較短、可以實時監測腫瘤的發展變化和治療效果等優點[12]。

長期以來，血小板一直被認為是癌癥的潛在診斷工具。幾項研究表明，簡單的平板計數已經包含潛在的臨床相關信息[13-15]。除了血小板計數外，血小板的大小和血小板蛋白標記物，如 P-選擇素，也用于基于血液的癌癥診斷和預后[16]。 KANIKARLA-MARIE等[17]發現了“富含特異性腫瘤成分的血栓”參與腫瘤細胞的轉移，隨后其對巨核細胞、血小板、癌癥之間相互作用的研究引出了 TEPs 的概念。在腫瘤組織浸潤時，血小板可以響應腫瘤細胞的信號，攝取腫瘤RNA并調節自身mRNA的剪切成為TEP，另一方面TEP也可以釋放多種生長和促血管生成因子、吸引其他血細胞，創造有利于腫瘤轉移的微環境[18]。因此，異常TEP RNA的表達和基因測序用于液體活檢診斷腫瘤或靶向治療越來越受到重視。2015年，BEST等[19]通過對283個血小板樣本的mRNA進行測序，以96.0%的準確率將癌癥患者與健康個體區分開來，并且以71.0%準確率正確識別出6種不同類型的腫瘤，這項研究證實了TEP的診斷潛力。除了mRNA,參與RNA沉默和轉錄后基因調控的非編碼miRNA的水平也在TEP中發生改變。2019年，WANG等[5]發現，TEP miR-34c-3p 和 miR-18a-5p 在鼻咽癌中的表達水平上調，對鼻咽癌的診斷具有重要的臨床價值。2021年，ZHU等[20]通過生物信息學分析和qRT-PCR發現，TEP miR-495-3p和miR-1293在HCC患者和健康對照者中存在差異表達，提示其可能參與了HCC的病理生理過程。

針對TEP miRNA進行液體活檢診斷腫瘤具有很多優勢：首先，響應外部信號的特定剪接事件與血小板直接攝取(剪接)循環 mRNA 的能力相結合，可以為 TEP 提供高度動態的 miRNA 庫，且其具有潛在的癌癥診斷適用性；其次，腫瘤教育血小板上的異常miRNA可以受到血小板的保護，具有易分離、易儲存及易檢測的優勢。

本研究發現，TEP的miRNA-122和miRNA-21在原發性肝癌患者體內的相對表達量均顯著高于健康受試者，差異有統計學意義(P<0.05)，ROC曲線分析結果顯示，TEP miRNA-122的AUC達到0.987，miRNA-21的AUC達到0.916，表明TEP miRNA-122和miRNA-21的相對表達水平可以有效區分肝癌患者和健康受試者。當miRNA-122確定最佳截斷值為4.46時，其診斷的靈敏度和特異度分別達到100.0%和93.3%；而當miRNA-221確定最佳截斷值為1.64時，其診斷的靈敏度和特異度分別達到80.0%和93.3%。因此，TEP的miRNA-122和miRNA-21是具有潛在應用價值的肝癌臨床輔助診斷標志物，有望補充目前用于液體活檢診斷的生物分子庫。但是，本次研究沒有具體分析TEP miRNA的相對表達量在不同病理類型和階段、不同臨床分期的肝癌患者中的區別，而且分析樣本的量較少，所以在將TEP miRNA-122和miRNA-21用于臨床肝癌的早期診斷還需要進一步研究。

綜上所述，肝癌患者血漿中TEP miRNA(miRNA-122和miRNA-21)相對于健康受試者均有較高的相對表達量，可以作為潛在的診斷肝癌的分子標志物，但在不同腫瘤分期、細胞分化程度等方面是否存在差異性表達，仍需進一步研究。