注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀的質量評價

王松 張丹丹 趙海云 于明艷 楊蕙如 陳德俊

(山東省食品藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室，山東省仿制藥一致性評價工程技術研究中心，濟南 250101)

注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀是臨床上常用的由青霉素類抗生素與酶抑制劑組成的復方制劑，兩者合用可有效保護阿莫西林免遭β-內酰胺酶水解[1]，本品適用于產β-內酰胺酶的敏感菌所致的上呼吸道、下呼吸道、泌尿系統及皮膚和軟組織感染；不良反應表現主要為皮膚、胃腸、神經系統、用藥部位、血液系統、泌尿系統損害、免疫功能紊亂和感染。

1985年，注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀由葛蘭素史克在英國上市；2013年原研產品進口至國內，商品名為Augmentin?。根據國家藥品監督管理局藥品數據信息，目前國內共有注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀生產企業31家，批準文號60個，規格為1.2、0.6和0.3 g。本品為阿莫西林鈉與克拉維酸鉀按標示量5:1均勻混合制成的無菌粉末，不含輔料。

2021年，注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀被列為國家藥品評價性抽檢品種。從全國31個省(區、市)共抽到212批次樣品，涉及21家生產企業。其主要執行中國藥典2020年版標準，另有2家企業執行國家藥品監督管理局標準(YBH06162017與YBH05672010)；國外僅英國藥典(BP2020)收載該品種。為客觀評價藥品質量現狀，挖掘影響產品質量的風險點，本文按現行質量標準對全部抽檢樣品進行檢驗，根據檢驗結果對相關指標開展了探索性研究，并對執行標準和生產工藝等方面提出改進建議。

1 儀器與試藥

Q-Exactive Plus四級桿靜電場軌道阱高分辨質譜儀；Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀；F-7000熒光分光光度計；布魯克D8 X射線粉末衍射儀；MS 2000激光衍射粒度分析儀；ZEISS Sigma 300熱場發射掃描電子顯微鏡；Thermo ICS-5000離子色譜儀；ptiVeripac 455真空衰減測試儀。

212批次注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀為2021年度國家藥品評價性抽驗樣品；1批次參比制劑(GSK，批號：SR2M)；硫酸奎寧(BP，批號4159)。甲醇、乙腈、甲酸和甲烷磺酸均為色譜純，磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、磷酸和鹽酸均為分析純，水為超純水。

2 試驗方法

2.1 法定標準檢驗

按現行標準進行檢驗，主要檢測項目包含堿度、溶液的澄清度與顏色、有關物質、水分、不溶性微粒及含量測定。

2.2 探索性研究

2.2.1 有關物質及雜質譜研究

有關物質檢查采用Thermo ODS-2 Hypersil色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A：0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調節pH值至4.0)，流動相B：0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調節pH值至4.0)-甲醇(50:50，V/V)，線性梯度洗脫(0～10 min，B為2%；10～25 min，B為2%→29%；25～35 min，B為29%；35～50 min，B為29%→46%；50～60 min，B為46%；60～75 min，B為46%→65%；75～85 min，B為65%)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為230 nm；柱溫為30℃；進樣體積為20 μL。

采用LC-MS柱切換技術快速確證雜質的結構。一維色譜條件為有關物質檢查色譜條件，僅進樣體積增至80 μL。二維色譜條件：采用Thermo Hypersil GOLD色譜柱(2.1 mm×150 mm，3 μm)；以1%甲酸溶液為流動相A，以1%甲酸的乙腈溶液為流動相B；自切峰后線性梯度洗脫(0～5 min，B為0；5～20 min，B為0→80%；20～35 min，B為80%)；柱溫：室溫；流速：0.5 mL/min；切換用定量環體積500 μL。質譜條件：正離子化模式ESI(+)，噴霧電壓為3.0 kV，毛細管溫度為320℃，鞘氣流量為35 arb，輔助氣流量為10 arb，掃描方式Full MS/dd-MS2模式，掃描范圍為m/z100～1500，碰撞能量分別為NCE10、20和30 V。

2.2.2 單組分原料及制劑中克拉維酸聚合物及其他熒光雜質研究

取本品適量(約相當于克拉維酸0.1 g)，制成每1 mL中約含1 mg的溶液；取硫酸奎寧對照品適量，制成每1 mL中約含0.42 μg的溶液。取供試品溶液與對照品溶液，在激發波長360 nm、發射波長440 nm處分別測定熒光強度。

2.2.3 復溶行為

復溶時間取各企業樣品5瓶，根據西林瓶體積大小分別注入注射用水10或5 mL，振搖觀察并用秒表計時。

粒度與粒度分布采用激光粒度測定法，干法測試，顆粒折射率：1.52；顆粒吸收率：0.1；進樣口寬度：4 mm；進樣速率：50%；分散氣壓：1.0 bar；遮光度：0.5%～5%。

2.2.4 成鹽率考察

用陽離子交換色譜柱(IonPac CS12A柱)；檢測器為電導檢測器；檢測方式為抑制電導檢測；柱溫為35℃；以6.7 mmol/L甲烷磺酸溶液為淋洗液，流速為1 mL/min，抑制器電流值為20 mA；進樣體積25 μL。

2.2.5 包材密封性研究

真空衰減法：測試壓力35 mbar；抽真空時間12.0 s；測試時間10.0 s；平衡時間10.0 s 。

3 結果與討論

3.1 法定檢驗結果

按現行質量標準檢驗，212批注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀均符合規定，但有5批次樣品溶液的顏色在限度邊緣。

3.2 探索性研究結果

3.2.1 有關物質及雜質譜研究

β-內酰胺類抗生素自身結構不穩定，產品中有機雜質種類復雜且微量[2]，基于β-內酰胺類抗生素的質譜裂解規律，結合降解反應原理，推斷其雜質結構是常用的方法之一[3]。采用柱切換-LC/MS技術，按照優化后的有關物質方法，對注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀中的雜質進行結構解析和來源分析[4-6]，共推斷出15個雜質(圖1)，均為阿莫西林雜質，其中9個在EP中收載，2個在中文獻報道(雜質7和9)，4個雜質(雜質3、5、12和13)未見報道(表1)。

表1 雜質結構及來源分析Tab.1 The structure and source analysis of impurities

圖1 注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀樣品降解溶液典型色譜圖Fig.1 Typical chromatogram of the sample degradation solution

目前國內阿莫西林鈉克拉維酸鉀原料生產企業有3家，A企業和C企業樣品中檢出11號雜質，B企業樣品中檢出8號雜質。分析雜質譜差異的原因，不同企業在阿莫西林復溶成鹽過程中選用的溶媒不同，A企業和C企業采用乙醇為溶媒，B企業使用了甲醇，故其工藝雜質分別為阿莫西林青霉噻唑酸乙酯和阿莫西林青霉噻唑酸甲酯。

14號雜質(阿莫西林閉環二聚體)作為本品中的最大雜質，BP2020對其進行了單獨控制。通過優化的有關物質分析方法，可分離到阿莫西林閉環二聚體、開環二聚體、閉環三聚體以及阿莫西林與相關雜質的聚合產物，提示優化方法可有效監測各類聚合物雜質。文獻報道[7]，阿莫西林閉環二聚體的含量與阿莫西林閉環三聚體的含量呈正相關，可將該雜質作為聚合物的指標性雜質進行控制。

選取原料來源不同的3家企業樣品，于溫度40℃、相對濕度75%條件下進行3個月的加速試驗(圖2)，結果可見，阿莫西林雜質D2、雜質C及雜質總量均呈顯著增長趨勢。值得注意的是，A企業和C企業樣品中主要降解雜質增長趨勢較B企業樣品明顯不同。水分測定結果顯示，B企業樣品的水分值最低，推測水分有利于阿莫西林鈉的降解。

圖2 樣品雜質變化趨勢圖Fig.2 Trend diagram of sample related substances

采用ADMET predictor軟件對阿莫西林諸雜質的毒性進行預測。軟件提示，雜質3、7、9、12和13在大鼠中有致癌性。根據ICHM7指導原則要求，進一步采用Derek Nexus:6.1.1(基于知識規則)和SarahNexus：3.1.1(基于統計學)對阿莫西林雜質進行遺傳毒性評價，阿莫西林相關雜質結果均為陰性。上述結果提示，阿莫西林的相關雜質均為普通雜質。

3.2.2 克拉維酸原料及制劑中克拉維酸聚合物及其他熒光雜質分析

上述雜質譜分析中發現的相關雜質均來源于阿莫西林鈉，參考BP2020中的檢查項目，采用熒光分光光度法對克拉維酸鉀原料及制劑中克拉維酸聚合物及其他熒光雜質進行分析，進而揭示制劑中克拉維酸鉀的雜質水平。

熒光雜質分析結果顯示，E企業和F企業樣品中該類雜質含量最高(表2)。相關性分析結果顯示，克拉維酸聚合物及其他熒光雜質含量與溶液的顏色呈顯著正相關。提示熒光雜質可能是引起本品溶液顏色加深的原因之一。進一步分析發現，顏色較深的樣品均抽自經營單位；E企業中的1批樣品顏色淺于2號標準比色液，為抽自該生產單位的成品倉庫樣品，同時生產日期較新。提示熒光雜質可能與藥品的運輸和儲存條件有關。

表2 部分檢測項目結果比較Tab.2 Comparison of results of some test items

續表1

選取3家原料來源企業的樣品于高溫(60℃)、高濕(92.5%，溫度25℃)及強光照射(4500 Lx)環境下放置5和10 d，進行影響因素試驗(圖3)，結果表明，高濕和光照條件下雜質穩定，溶液的顏色未加深；高溫條件下，克拉維酸雜質含量增長明顯，溶液的顏色顯著加深，提示在包裝條件下，溫度是影響本品質量變化的關鍵因素。

圖3 影響因素試驗結果Fig.3 Results of influencing factor test

3.2.3 復溶行為

復溶與藥物的臨床應用息息相關，是注射用粉針劑的關鍵質量屬性[8]。比較國內產品和原研產品復溶行為的差異，參比制劑在12 s內全部溶解，國內樣品復溶時間在7～26 s之間。復溶時間較快的樣品，所用西林瓶體積為25 mL，大于參比制劑西林瓶體積(20 mL)。復溶時間較慢的樣品，西林瓶體積均小于參比制劑，部分企業樣品僅能加入5 mL注射用水。提示制劑西林瓶的體積是影響復溶行為的關鍵因素之一。本品溶液的穩定性與濃度有關，濃度越高，溶液越不穩定[9-11]；參比制劑的說明書中亦有提示。可見，選用小規格西林瓶不僅不利于樣品的溶解；且可能因復溶后濃度較高影響溶液的穩定性。

進一步比較參比制劑和不同原料來源的國產制劑晶體特征的異同。參比制劑與不同國產制劑的X射線粉末衍射圖譜相同，均僅含有兩組分的特征衍射峰；采用激光散射粒度分布儀比較其粒度與粒度分布，參比制劑的粒徑d(0.5)約為7 μm，C企業樣品稍大約為9 μm，A企業和B企業樣品基本一致，在12 μm左右；繼續使用掃描電鏡對各企業樣品粉末的微觀形態進行分析(圖4)，可見，阿莫西林鈉呈細小塊狀結構，為主要成分，少量克拉維酸鉀為明顯短棒狀結構；阿莫西林鈉顆粒大小存在顯著差異，參比制劑中阿莫西林鈉的粒徑基本在10 μm以下。可見，制劑中主成分的結晶形態存在一定的差異，提示其結晶工藝不同。進一步探討阿莫西林鈉結晶工藝與產品質量與療效的關系，將促使國產制劑質量的持續提高。

圖4 不同企業樣品的掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron microscopy image of the samples

3.2.4 成鹽率考察

測定部分抽檢樣品的成鹽率，阿莫西林鈉在1.00～1.13之間，克拉維酸鉀在0.94～1.05之間，成鹽情況較好。進一步關注工藝過程中使用的成鹽劑，發現3家原料企業的成鹽劑均為2-乙基己酸鈉或2-乙基己酸鉀。參照ChP2020四部通則對2-乙基己酸進行測定，來源于C企業原料的樣品，2-乙基己酸的殘留量為0.39%～0.51%，其含量相對較高，提示其成鹽工藝需進一步優化。

3.2.5 包材密封性研究

在法定標準檢驗中，發現部分企業產品溶液的顏色較深，相同原料來源，不同制劑企業產品的質量存在差異(表2)。采用真空衰減法，對質量相對較差的E企業和F企業樣品與包裝材質相近、尺寸相同整體質量較好的Q和A企業樣品進行比較，探討包材密封性對產品質量的影響。

測定結果顯示，E企業和F企業樣品的壓差均值分別大于Q企業和A企業樣品的結果，而且離散程度大。Mann-Whitney U檢驗分析表明，上述企業樣品存在統計學差異(P<0.05)；單變量顯著性分析表明，E企業4批樣品中的3批與Q、F與A企業樣品結果均存在顯著性差異(P<0.05)。進一步分析發現，存在顯著性差異的樣品均抽自經營單位，E企業1批無顯著性差異的樣品，抽自該生產單位的成品倉庫，未經流通運輸，同時生產日期也較新。提示包裝的密封完整性差異可能是導致不同企業樣品質量差異的原因之一。

4 結論

注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀為混粉原料無菌分裝，未添加輔料，原料質量的優劣直接影響制劑質量。全國抽驗結果顯示，注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀總體質量較好，但其在原料工藝中的細微差異，如阿莫西林鈉結晶工藝的差異，阿莫西林鈉和克拉維酸鉀成鹽工藝的差異等，將影響產品的雜質譜等與參比制劑存在差異，對其工藝過程細節的持續優化，將有助于國產制劑質量的持續提高。

本品在運輸和儲存條件溶液的顏色易變深，其與克拉維酸鉀降解產生的熒光類雜質的含量呈顯著正相關，并可能與產品包裝的密閉性有關。進一步探討克拉維酸鉀降解反應與溶液顏色變化的規律，有望解決導致其易變色原因這一難題。

探索性研究結果提示，現行質量標準有待改進。建議阿莫西林有關物質項下對主要降解雜質、關鍵工藝雜質和聚合物指標性雜質進行質控，增加雜質校正因子，增訂克拉維酸聚合物及其他熒光雜質檢查項。