注射用頭孢尼西鈉殘留溶劑質量分析

李佩 李雪 洪建文 田潔

(1 廣東省藥品檢驗所，廣州 510663；2 國家藥品監督管理局藥品評價中心，北京 100022)

頭孢尼西鈉(cefonicid sodium)，為第二代廣譜、長效的頭孢類抗生素，通過抑制細菌細胞壁合成產生抗菌活性，對革蘭陽性和陰性菌以及一些厭氧菌均有抗菌作用，對大多數β-內酰胺酶穩定。臨床上適用于下列敏感菌引起的感染：下呼吸道感染、尿路感染、敗血癥、皮膚軟組織感染、骨和關節感染，也可用于手術預防感染[1-2]。

本實驗室承擔了2019年注射用頭孢尼西鈉國家評價性抽驗[3-4]，抽樣共涉及13家生產企業80批次樣品，通過對制劑的梳理，發現制劑質量受原料質量的影響較大，使用同一原料的不同制劑生產企業，其產品殘留溶劑的種類和量呈現同一趨勢，研究采用氣相色譜的方法[5-6]對原料及制劑中的殘留溶劑進行研究分析，提示企業應根據其生產工藝來建立個性化的質量控制要點，以保證產品的質量。

1 儀器與試藥

氣相色譜儀(Agilent 6890、Thermo Trace1300)，檢測器(氫火焰離子化檢測器)，色譜工作站(Empower、變色龍軟件)，電子天平(Sartorius CP225D，十萬分之一)，毛細管色譜柱(DB-1毛細管柱，30 m×0.53 mm，1.0 μm，SN：US4886831H、SUPELCO WAX-10毛細管柱，30 m×0.53 mm，1.0 μm，SN：64181-01A)，樣品(2019年國家評價性抽驗樣品以及企業提供的6批原料樣品)。

2 方法與結果

2.1 殘留溶劑的種類和量

照《中國藥典》2020年版二部頭孢尼西鈉殘留溶劑檢測方法對樣品進行檢測[7]，分析不同生產企業的注射用頭孢尼西鈉殘留溶劑的差異。

2.1.1 色譜條件

以DB-1，30 m×0.53 mm，1.0 μm(SN：US4886831H)為色譜柱，程序升溫，起始溫度為45℃，保持5 min，再以10 ℃/min的速率升溫至180℃；載氣為氮氣，流速為3 mL/min；FID進樣口溫度為150℃；檢測器溫度為200℃；頂空平衡溫度為90℃，平衡時間為20 min。

2.1.2 溶液的制備及測定

對照品溶液精密稱取甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、四氫呋喃和二氯甲烷各適量，加水定量稀釋制成每1 mL中分別含甲醇0.6 mg、乙醇1.0 mg、乙腈0.082 mg、丙酮1.0 mg、乙酸乙酯1.0 mg、四氫呋喃0.144 mg和二氯甲烷0.12 mg的溶液，精密量取5 mL，置頂空瓶中，密封。

供試品溶液精密稱取樣品1.0 g，置頂空瓶中，精密加水5 mL使溶解，密封。

將對照品溶液與供試品溶液，分別頂空進樣，記錄色譜圖。

2.1.3 供試品中殘留溶劑的檢測結果

按“2.1.1”項下的色譜條件對國評抽樣中的26批制劑以及企業提供的6批原料進行檢測，檢測出第二類溶劑甲醇和四氫呋喃，第三類溶劑乙醇和丙酮，未檢出第一類溶劑乙腈和二氯甲烷。不同企業間甲醇和乙醇的殘留水平較為接近，且均在限度范圍內；丙酮的量廠家A、B、C高于其他廠家，其主要受原料來源的影響；四氫呋喃僅存在廠家D～M中，廠家A、B、C中不存在，主要也是受原料的影響。通過對不同制劑及原料殘留溶劑的檢測，發現制劑殘留溶劑的種類和量主要受原料影響，兩家原料企業均未檢出第一類溶劑，第二類和第三類溶劑均在可控范圍內，使用原料企業B的制劑在殘留溶劑方面質量優于企業A。結果見表1～2和圖1。

圖1 殘留溶劑典型色譜圖Fig.1 Typical chromatogram of residual solvent

表1 供試品中殘留溶劑測定結果Tab.1 The results of residual solvents in samples

2.1.4 需關注的溶劑

本次檢測除藥典規定的殘留溶劑種類外，還發現3個溶劑峰。對3個溶劑進行研究，通過采用對照品定位、氣相質譜聯用等方法對溶劑進行定性。

溶劑峰1為異丙醇，屬中國藥典殘留溶劑項下規定的第三類溶劑，應限制使用，推測原料合成工藝中使用了該溶劑，企業應對其進行控制，可采用中國藥典現有殘留溶劑方法進行檢測控制。

溶劑峰2為異亞丙基丙酮，通過GC-MS聯用技術，并使用異亞丙基丙酮對照品進行定性，其存在于原料企業B中，含量在0.001%～0.008%之間。典型色譜圖見圖2～3。

圖2 異亞丙基丙酮對照品色譜圖Fig.2 Chromatogram of isopropylidene acetone reference substance

由于在頭孢尼西鈉原料合成過程中未使用該物質，推測異亞丙基丙酮殘留可能有以下兩個原因：①原料合成過程中使用了回收再利用的丙酮，該丙酮中含有異亞丙基丙酮，從而導致其殘留在原料中；②合成過程中使用的丙酮與起始物料反應產生了該物質。異亞丙基丙酮為不飽和酮具有遺傳毒性致癌警示結構(QSAR評估——3類雜質：不飽和酮，含有與原料藥有無關的警示結構，無致突變性數據)，企業應確保將該溶劑控制在安全閾值以下。

溶劑峰3為2-乙基己酸，原料合成過程中的成鹽劑2-乙基己酸鈉是頭孢尼西酸的成鹽過程中提供鈉離子的載體，反應過程中2-乙基己酸鈉轉化成2-乙基己酸，2-乙基己酸是一種有害物質，對皮膚、黏膜有刺激作用[8]，因此需要對該溶劑的殘留進行控制。

表2 原料中殘留溶劑測定結果Tab.2 The results of residual solvents in API

2.2 2-乙基己酸檢測方法的建立

為了更好地對2-乙基己酸的殘留量進行控制，在《中國藥典》2-乙基己酸的檢測方法基礎上，建立頭孢尼西鈉中2-乙基己酸檢測方法，并進行了方法驗證。

2.2.1 色譜條件

以SUPELCO WAX-10毛細管柱，30 m×0.53 mm，1.0 μm(SN:64181-01A)為色譜柱，載氣為氮氣，流速為7.0 mL/min，檢測器為FID，檢測器溫度為300℃，柱溫為150℃，進樣口溫度為200℃，進樣體積為1 μL。

2.2.2 溶液的制備及測定

鹽酸溶液：量取33 mL濃鹽酸，置100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，即得。

圖3 供試品典型色譜圖Fig.3 Typical chromatogram of sample

內標溶液：精密稱取3-環己丙酸約250 mg，置250 mL量瓶中，用環己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

對照品溶液：精密稱取2-乙基己酸對照品75 mg，置50 mL量瓶中，用內標溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取l mL，置離心管中，加33%鹽酸溶液4.0 mL，劇烈振搖1 min，離心，取上層清液。

供試品溶液：精密稱取供試品約0.3 g，置離心管中，加33%鹽酸溶液4.0 mL使溶解，精密加入內標溶液l mL，劇烈振搖1 min，離心，取上層清液。

將對照品溶液與供試品溶液，精密量取1.0 μL，分別進樣，記錄色譜圖。

2.2.3 線性關系考察

精密稱取2-乙基己酸對照品適量，制成不同濃度的標準溶液，按“2.2.1”色譜條件分別進樣，記錄峰面積，以進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果表明2-乙基己酸在濃度0.0501～2.5050 mg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程y=0.9401x+0.0039，相關系數r=0.9997。

2.2.4 準確度試驗

內標溶液：精密稱取3-環己丙酸約250 mg，置250 mL量瓶中，用環己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

對照品儲備液制備：精密稱取2-乙基己酸75 mg，置25 mL量瓶中，加內標溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

對照品溶液1、2、3：分別精密量取對照品儲備液2、2.5和3 mL，分別置5 mL量瓶中，用內標溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

取注射用頭孢尼西鈉(批號：068180301)約0.3 g，精密稱定，稱取9份，分別置10 mL離心管中，將9份溶液分別加入33%鹽酸溶液4 mL，精密加入對照品溶液1、2、3各l mL，劇烈振搖1 min，離心，取上層清液，測定2-乙基己酸的量。結果見表3。

表3 2-乙基己酸準確度測定結果Tab.3 The accuracy results of 2-ethylhexanoic acid

2.2.5 重復性試驗

照“2.2.2”項下方法配制成供試品溶液6份進行測定。結果表明，6份供試品中2-乙基己酸含量的RSD為1.6%，符合要求。重復性結果見表4。

表4 重復性實驗結果Tab.4 The results of repeatability

2.2.6 檢出限和定量限試驗

精密稱取2-乙基己酸對照品，用內標溶液逐級稀釋，取各濃度試驗用溶液依次注入氣相色譜儀進行分析。調節儀器靈敏度，以信噪比3為檢出限，最低檢出濃度為2.4 μg/mL；信噪比10為定量限，最低定量濃度為4.8 μg/mL。

2.2.7 耐用性試驗

按照“2.2.1”色譜條件，分別調節流速為5 mL/min、9 mL/min以及柱溫為140℃、160℃，其他色譜條件保持不變，進行試驗，考察2-乙基己酸以及3-環己丙酸的出峰時間、分離度及理論塔板數，結果表明不同條件下分離度及理論板數均符合要求，說明該方法耐用性良好。耐用性試驗檢測結果見表5。

表5 耐用性試驗檢測結果Tab.5 The results of durability

2.2.8 供試品中2-乙基己酸的檢測結果

本次驗證中10家生產企業生產的63批次供試品，均采用上述方法進行檢測，結果均在限度(0.3%)范圍內，且批間穩定性較好。檢測結果見表6。

表6 供試品中2-乙基己酸的檢測結果Tab.6 The test results of 2-ethylhexanoic acid in samples

3 結論

按《中國藥典》2020年版頭孢尼西鈉殘留溶劑方法檢測，國內產品殘留溶劑控制得比較好，未檢出一類溶劑，其他殘留溶劑的量也控制在較低水平。

本次殘留溶劑檢測中發現3個需要關注的溶劑，現有標準未控制，但產品中實際存在，其中2個有一定的毒性，分別為2-乙基己酸和異亞丙基丙酮，需要關注和控制，研究建立了2-乙基己酸的檢測方法對其進行控制。

通過對注射用頭孢尼西鈉殘留溶劑的質量分析，進一步顯示殘留溶劑與原料合成工藝密切相關，也揭示工藝的變化和穩定性，作為藥品安全性指標，《中國藥典》2020年版中對殘留溶劑控制的要求指出，企業應根據生產工藝的特點，制定相應的限度，使其符合產品規范、藥品生產質量管理規范(GMP)或其他基本的質量要求，因此需要企業根據自身產品情況制定方法和限度要求，以保證藥品的安全和質量。