IL- 17 在2 型糖尿病患者血清、房水中的表達水平及臨床意義

付鵬，沈念，萬小波，黃艷玲，楊水平

柳州市人民醫(yī)院眼科，廣西柳州 545006

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）為糖尿病后期常見且嚴重并發(fā)癥，為目前DR 患者致盲重要因素，對其病理改變上以視網(wǎng)膜出血、滲出、微血管瘤以及新生血管形成為改變。同樣，機體各類激素同樣參與疾病發(fā)生發(fā)展，如氧化應激、蛋白激酶C 激活和晚期糖基化產(chǎn)物等，但目前對致病相關機制尚不明確[1]。 近年來研究指出，DR 發(fā)生、 發(fā)展過程中炎癥介導慢性炎癥反應在其中發(fā)揮著重要作用[2]。 白細胞介素-17（IL-17）作為超強炎癥因子，與特異性受體結合后并激活P13K/Akt/ERK 及p38MAPK 等炎癥信號傳導通路，啟動炎癥級聯(lián)反應，此時機體炎癥發(fā)生、感染以及宿主反應等多個過程中承擔重要角色[3]。 該次研究就2017 年1 月—2019 年12 月該院收治的白內(nèi)障超聲乳化聯(lián)合人工晶體植入術或玻璃體切割術的45 例2 型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者測定血清及房水IL-17水平， 分析IL-17 在DR 患者血清房水中表達水平及臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取該院收治的白內(nèi)障超聲乳化聯(lián)合人工晶體植入術或玻璃體切割術的45 例2 型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者作為研究對象， 所有患者接受眼底檢查、熒光血管造影，依據(jù)檢查結果分為糖尿病無視網(wǎng)膜病變期（NDR）組15 例、非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變 （NPDR） 組15 例、 增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變（PDR）組15 例，選取同期收治的15 例單純老年性白內(nèi)障患者作為對照組。 NDR 組中男5 例， 女10例；年齡51～72 歲，平均（60.6±4.4）歲。 NPDR 中男6例，女9 例；年齡52～72 歲，平均（60.6±4.6）歲。 PDR組中男5 例，女10 例；年齡52～73 歲，平均（61.6±6.5）歲。 對照組中男4 例，女11 例；年齡51～73 歲，平均（61.5±6.6）歲。 4 組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。 該次研究經(jīng)該院倫理委員會批準。

納入標準： ①符合世界衛(wèi)生組織糖尿病專家委員會提出糖尿病診斷標準[4]；空腹血漿葡萄糖水平≥7.0 mmol/L； 糖耐量試驗2 h 血漿葡萄糖水平≥11.1 mmol/L；②知曉該次研究內(nèi)容，并自愿參與。 排除標準：①糖尿病伴急性并發(fā)癥者，如糖尿病酮癥酸中毒、高滲性高血糖綜合征等；②長期應用糖皮質(zhì)激素藥物者；③臨床一般資料不全者。

1.2 方法

1.2.1 研究材料 人IL-17、IL-23、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒（96T）:購自武漢華美生物工程有限公司；96孔酶標板（ELISA）：購自北京博特生物技術有限公司；-80℃超低溫冰箱（規(guī)格：日本三洋MDF-U52V、美國Thermo 900)； 低溫高速離心機 （規(guī)格： 德國Centrifuge 5424R）； 電熱恒溫培養(yǎng)箱（規(guī)格：泰斯特DH6000BⅡ）； 酶標儀（規(guī)格：英國Biochrom Anthos 2010）。

1.2.2 操作方法 標本采集及處理：所有患者采血前均禁飲、進食，次日清晨空腹狀態(tài)肘正中靜脈采取靜脈血5 mL，置于速凝管中，低溫離心機上離心3 000 r/min，去上清液移至消毒的Eppendoff 管內(nèi)密封，保存于-80℃冰箱中。測定空腹血糖、糖化血紅蛋白、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、尿素氮、肌酐、血清IL-17、房水IL-17 水平。 房水標本采集及處理方式：手術前抽取未稀釋房水0.2 mL，置于1 mL無菌注射器針管內(nèi)，置于冰上在10 min 內(nèi)轉(zhuǎn)移至消毒Eppendoff 管內(nèi)，低溫離心機離心3 000 r/min，10 min后取上清分裝置于-80℃冰箱中保存。 實驗方式：酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清及房水標本IL-17 含量，每個標本重復3 次。酶標儀測定。依據(jù)試劑盒說明操作， 步驟如下： 將標準品選擇稀釋液定比稀釋后混合，酶標板各孔依次編號，每個相應孔中添加不同濃度標準品或標本100 μl，封板膠紙封住反應孔，37℃孵箱孵育90 min， 稀釋好洗滌液洗板4 次， 充分甩干。 各孔中添加生物素抗體工作液100 μl，封板膠封住反應孔，37℃下孵箱孵育60 min，洗板4 次。 每孔添加酶結合物工作液100 μl，37℃孵箱孵育并封住板孔，37℃孵箱孵育30 min。 然后洗板4 次，每孔加入顯色劑100 μl，37℃避光孵育10～15 min 后每孔添加終止液100 μl，混勻后選擇酶標儀波長450 nm處讀書，5 min 內(nèi)測定各孔吸光度值， 測定標本IL-17 含量。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料符合正態(tài)分布，以（±s）表示，采用t 檢驗和方差分析， 采用Pearson 相關分析探究相關性，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4 組生化指標比較

4 組生化指標比較，NDR 組空腹血糖、糖化血紅蛋白、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、尿素氮、肌酐、IL-23、TNF-α、IL-6 低于NPDR 組、PDR 組，高密度脂蛋白水平高于NPDR 組、PDR 組， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；NDR 組血清IL-17、房水IL-17 水平低于NPDR 組、PDR 組， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1、圖1。

表1 4 組生化指標比較（±s）Table 1 Comparison of biochemical indicators among the four groups （±s）

表1 4 組生化指標比較（±s）Table 1 Comparison of biochemical indicators among the four groups （±s）

指標NDR 組（n=15）NPDR 組（n=15）PDR 組（n=15）對照組（n=15）F 值 P 值空腹血糖（mmol/L）糖化血紅蛋白（%）總膽固醇（mmol/L）三酰甘油（mmol/L）低密度脂蛋白（mmol/L）高密度脂蛋白（mmol/L）尿素氮（mmol/L）肌酐（μmol/L）血清IL-17（pg/mL）房水IL-17（pg/mL）血清IL-23（pg/mL）血清TNF-α（ng/L）血清IL-6（ng/L）7.72±1.32 9.22±1.26 4.28±1.05 2.56±0.48 2.71±0.65 1.56±0.42 5.02±1.11 70.26±4.96 33.26±3.26 22.26±2.26 22.26±5.59 16.13±2.05 98.56±12.26 8.11±1.22 9.45±1.15 4.36±0.74 2.59±0.48 2.96±0.59 1.42±0.44 6.06±1.15 86.26±5.15 42.26±4.46 26.56±3.26 45.26±3.56 45.65±6.56 159.96±14.56 8.16±1.15 9.98±2.15 5.41±1.32 2.65±0.25 3.62±1.05 1.11±0.22 10.52±2.26 139.59±32.26 48.59±4.96 30.26±3.69 64.56±4.56 55.65±7.78 178.96±15.11 5.06±0.15 5.22±0.45 4.11±1.22 1.62±0.45 2.36±0.42 1.89±0.42 3.26±1.15 63.25±8.59 15.59±2.26 10.26±2.63 14.56±2.26 4.62±1.26 65.26±8.59 28.780 37.140 4.270 19.960 8.290 10.560 63.920 61.400 204.940 124.880 443.450 317.930 252.860 0.001 0.001 0.009 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

2.2 血清、 房水IL-17 水平與相關臨床指標相關性研究

血清IL-17、房水IL-17 與空腹血糖、糖化血紅蛋白、總膽固醇、高密度脂蛋白無相關性（P＞0.05）；血清IL-17、房水IL-17 與三酰甘油、低密度脂蛋白、尿素氮、肌酐呈負相關（P＜0.105），與IL-23、TNF-α、IL-6呈正相關（P＜0.05），見表2。

表2 血清、房水IL-17 水平與相關臨床指標相關性研究Table 2 Correlation between serum and aqueous humor IL-17 levels and related clinical indexes

3 討論

糖尿病臨床常見的一類微血管并發(fā)癥之一為糖尿病視網(wǎng)膜病變，該類疾病特點為患病率高、致盲率高[5]。流行病學調(diào)查提示，至2011 年全球糖尿病患病人數(shù)從3.66 億上升至2030 年5.52 億[6]。 全球DR 患者人數(shù)從2010 年1.3 億人增長至2030 年1.9 億。依據(jù)我國相關報道提示， 我國糖尿病并發(fā)視網(wǎng)膜病變?nèi)藬?shù)占比高達34.6%[7]。 DR 發(fā)病機制上存在多種假說，如炎癥反應、細胞因子作用及多元醇途徑激活、蛋白質(zhì)非酶糖基化等[8]。過去認為DR 為一種視網(wǎng)膜微血管改變疾病， 但近年來越來越多證據(jù)表明，DR除微血管病理改變，同樣為一類慢性炎癥性疾病[9]。

近年來研究指出， 多項炎癥反應指標參與DR發(fā)生發(fā)展，并在其中發(fā)揮著重要作用，如白細胞介素（IL）、C 反應蛋白（CRP）等[10]。 而白細胞介素為免疫細胞間相互作用因子，傳遞信息、激活及調(diào)節(jié)免疫細胞等發(fā)揮著重要作用[11]。 IL-17 初期認為初始CD4+T細胞誘導、分化新型效應性Th17 細胞產(chǎn)生的特征性細胞因子，在局部組織炎癥反應中，為其中主要促炎性因子[12]。 LI-17 可促進多種細胞釋放炎性因子，為中性粒細胞介導炎癥反應重要細胞因子。部分研究指出IL-17 參與糖尿病大血管病變炎癥反應過程，在糖尿病大血管病變發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，成為糖尿病大血管病變獨立危險因素[13]。IL-23 為IL-12家族新成員，主要產(chǎn)生為樹突狀細胞、吞噬細胞及小膠質(zhì)細胞等抗原[14]。與IL-23 生物活性不同，IL-23 與Th 細胞膜上的IL-23 受體結合后， 能促進Th 細胞向Th17 分化，Th17 增殖和存活維持下誘導、 促進IL-17 分泌，當IL-23/IL-17 通路激活后，可產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應[15]。TNF-α 是巨噬細胞、活化單核細胞產(chǎn)生細胞因子，特點為生物活性、生物學效應強。 IL-6為多功能細胞因子，當糖尿病患者發(fā)生視網(wǎng)膜病變，誘導血管內(nèi)皮生長因子生成， 并促進視網(wǎng)膜新生血管形成，血管滲透性提升，改變內(nèi)皮細胞形態(tài)提升內(nèi)皮細胞滲透性，進而誘發(fā)糖尿病。 該研究中，對收治的糖尿病視網(wǎng)膜病變患者開展眼底檢查、 熒光血管造影， 依據(jù)病變程度分為NDR 組、NPDR 組、PDR組， 另納入15 例單純老年性白內(nèi)障患者為對照組，對4 組患者生化指標進行分析， 結果得出，NDR 組空腹血糖、糖化血紅蛋白、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、尿素氮、肌酐低于NPDR 組、PDR 組，高密度脂蛋白水平高于NPDR 組、PDR 組 （P＜0.05）；NDR 組血清IL-17、房水IL-17 水平低于NPDR 組、PDR 組 （P ＜0.05）。 NDR、NPDR、PDR 空 腹 血 糖[（7.72±1.32）、（8.11±1.22）、（8.16±1.15）mmol/L]高于對照組（5.06±0.15）mmol/L；總膽固醇[（4.28±1.05）、（4.36±0.74）、（5.41±1.32）mmol/L]高于對照組（4.11±1.22）mmol/L；尿素氮[（5.02±1.11）、（6.06±1.15）、（10.52±2.26）mmol/L]高于對照組（3.26±1.15）mmol/L；血清IL-17[（33.26±3.26）、（42.26±4.46）、（48.59±4.96）pg/mL]高于對照組（15.59±2.26）pg/mL。通過對血糖、血脂及其他生化指標比較中得出，隨著視網(wǎng)膜病變嚴重，則機體各項指標與健康對照組存在差異性則相對增加，而其反映預后越差。研究指出，對40 例糖尿病視網(wǎng)膜病變、 健康對照組患者血清IL-7 水平比較中，糖尿病視網(wǎng)膜病變?yōu)椋?3.26±3.26）pg/mL，高于健康對照組（15.26±3.26）pg/mL[16]。該研究中NDR、NPDR、PDR 組指標為（33.26±3.26）、（42.26±4.46）、（48.59±4.96）pg/mL， 優(yōu)于對照組 （15.59±2.26）pg/mL （P＜0.05），與相關研究結果一致。 對其結果分析，血清IL-17 水平高低可對DR 產(chǎn)生及發(fā)展有一定預測作用；對其機制分析，IL-17 誘導視網(wǎng)膜局部炎癥反應，胰島素抵抗加劇并引起胰島細胞凋亡， 進而直接、間接參與到微血管病變[17]。 同時，該文研究指出，伴隨著視網(wǎng)膜病變程度加重， 則血清及房水IL-17 水平呈現(xiàn)高表達，依據(jù)其規(guī)律指出，當IL-17 水平越高，則表明病情嚴重程度越高。 該文得出，血清IL-17、房水IL-17 與三酰甘油、低密度脂蛋白、尿素氮、肌酐、IL-23、TNF-α、IL-6 具有相關性（P＜0.05）。 該結果指出，三酰甘油、低密度脂蛋白等指標升高所表現(xiàn)混合性高脂血癥為2 型糖尿病一個標準， 會引起心血管及腎臟損傷。而研究中血清、房水IL-17 水平與空腹血糖、糖化血紅蛋白水平無明顯相關性，進而推測IL-17 對視網(wǎng)膜病變影響獨立于對血糖影響之外。 分析其原因，與DR 初期IL-6 等炎性因子水平升高促進IL-17 分泌相關。部分研究得出，高糖可誘導淋巴細胞IL-17 表達， 但IL-17 水平變化具體來源于固有免疫細胞還是獲得性免疫細胞仍然是未知的，仍需后期下一步深入研究[18]。

綜上所述，DR 患者血清、 房水IL-17 與疾病發(fā)生及發(fā)展關系緊密， 臨床可依據(jù)IL-17 水平診斷疾病，為后續(xù)治療及預后提供合理依據(jù)。