微衛星不穩定性，EGFR蛋白，P53蛋白的表達與大腸癌的臨床病理特征關系的相關性

郝鵬巖 吳勇 劉曉梅 張鏑 李文杰

【摘要】目的：探討大腸癌中微衛星不穩定性（microsatellite instability，MSI）狀態，EGFR蛋白及P53蛋白的表達與臨床病理特征的相關性。方法：應用免疫組化方法，檢測90例大腸癌組織中MSI蛋白（MLH1蛋白，PMS2蛋白，MSH2蛋白，MSH6蛋白）、EGFR蛋白及P53蛋白表達狀態，檢測MSI基因體系及胚系突變情況，分析不同臨床病理特征的關系。

結果：在90例大腸癌組織中，免疫組化檢測出微衛星不穩定共16例，占比17.8%，基因檢測出微衛星不穩定體系突變6例，占比6.7%，其中體系與胚系均突變1例，占比1.1%。免疫組化結果顯示：腺癌伴粘液腺癌成分共15例，微衛星不穩定6例，占比40%，高于腺癌占比13.3%（P=0.014）。右半結腸癌共21例，微衛星不穩定7例，占比33.3%，高于左半結腸癌占比13.0%（P=0.033）。

免疫組化檢測出EGFR陽性共49例，占比54.4%。其中，年齡大于67歲者46例，EGFR陽性30例，占比65.2%，高于年齡小于66歲者占比43.2%（P=0.036）;腫瘤最長徑小于4.7cm者共42例，EGFR陽性34例，占比81%，高于腫瘤最長徑大于4.7cm者占比31%（P=0.000）.

免疫組化檢測出P53突變共59例，占比65.6%。其中，淋巴結無轉移者55例，P53突變41例，占比74.5%，高于淋巴結有轉移者占比51.4%（P=0.024）。

結論：在大腸癌組織中，微衛星不穩定性與癌癥類型及部位相關，EGFR蛋白表達與患者年齡及腫瘤大小相關，P53蛋白與腫瘤淋巴結轉移相關。因此，MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、EGFR、P53聯合篩查可以為靶向治療提供用藥指導，可以提高患者的生存預期。

【關鍵詞】大腸癌;微衛星不穩定;MMR;EGFR;P53

研究背景：

大腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一。隨著政府對大腸癌篩查的重視，腸鏡的應用，使很多大腸癌能夠做到早發現，早治療。但隨著人們生活習慣的改變，發病率仍呈現上升化、年輕化趨勢。目前大腸癌多采取以手術為主，放、化療為輔的綜合治療手段。雖然部分患者可以通過免疫療法或靶向治療獲益，但大腸癌患者的死亡率和發病率仍然呈現上升的趨勢，5年生存率僅在50%左右，疾病防控形式仍然嚴峻。

林奇綜合征是由四種錯配修復基因（MLH1，MSH2， MSH6， PMS2）突變引起的，會增加患癌癥的風險，尤其是結直腸癌和子宮內膜癌。錯配修復基因是造成微衛星不穩定的主要因素，也就是說是由于錯配修復蛋白（ Mismatch repair? MMR） 的表達缺失造成的。確認林奇綜合癥攜帶者能預防和早期發現癌癥，并且對高危親屬的進行體檢;可以改善疾病的預后，降低醫療成本。

表皮生長因子受體（ EGFR） 屬于受體酪氨酸激酶HER/erbB。EGFR參與細胞損傷修復、介導細胞黏附、侵襲、遷移、生存、分化以及激活重要的細胞信號通路等。根據相關文獻顯示，EGFR 的過表達與多種實體瘤的轉移和侵襲密切相關。

p53的研究較多， 是迄今發現的與人類腫瘤關系最密切最常見的突變基因。 p53 基因在大腸癌中突變率高達70 %。因此檢測P53基因突變，并能改善p53 基因的功能對治療結腸癌尤為重要。Rayburn 等 研究發現， 通過改善p53 的功能，TLR9（ tol1-1ike receptor 9） 激動劑可促進結腸癌細胞的凋亡， 增加癌細胞對放、化療的敏感性。

本研究通過免疫組化SP方法研究MMR蛋白質的表達，EGFR蛋白及P53蛋白表達，MSI基因體系及胚系突變情況，并分析其表達情況與大腸癌臨床病理特征的關系。希望可以找到該蛋白是如何影響大腸癌的發病及在不同部位大腸癌中的表達意義。

材料與方法：

研究對象：本研究得到了中美醫院道德倫理委員會的批準。選取2018 年1月至2020 年12月在京東中美醫院手術的大腸癌患者90 例。納入標準： 病理診斷證實為原發性大腸癌，術前未接受任何放化療等治療，臨床病理資料完整，均自愿參加并簽署知情同意書。大腸癌患者中男性47 例，女性43 例，年齡中位數為66歲，平均腫瘤直徑（4.7±1.77） cm; 腫瘤部位： 左半結腸69 例，右半結腸21 例; 臨床分期： Ⅰ期18 例，Ⅱ期35 例，Ⅲ期33 例，Ⅳ期4例; 淋巴結轉移35 例，組織學分化： 低分化15 例，中分化44 例，高分化31 例。腺癌伴粘液腺癌成分15例。所有患者的組織樣本，均經10% 的甲醛溶液固定，制成石蠟包埋切片。

MMR基因檢測：取患者癌組織（腫瘤成分在80%以上）及癌旁5cm處正常黏膜，常規切片8μm厚10張，送往北京基石醫學檢驗實驗室有限公司進行檢測。檢測內容：NR21、Bat26、NR27、Bat25、NR24、Mono27、Penta C、Penta D、Amelogenin 。檢測方法：多重熒光PCR—毛細管電泳。檢測設備：ABI 3730xl型遺傳分析儀。按照NCI對腫瘤MSI的評判標準進行判讀，有2個及以上改變為高度微衛星不穩定性（microsatellite instability-high，MSI-H），1 個改變為低度微衛星不穩定性（m i c ro s ate l l i teins tabi l i ty- l ow，MSI -L），無改變為微衛星穩定（microsatellite stable，MSS）。

免疫組織化學SP法檢測錯配修復蛋白（m i sma t c h r e p a i r p r o t e i n ，MMR）MLH1，PMS2，MSH2，MSH6表達。腫瘤旁正常組織為正常內陽性對照。MMR蛋白缺失表現為腫瘤組織核表達陰性，而腫瘤旁正常結腸黏膜上皮及淋巴細胞核陽性。當任何1 個蛋白表達缺失即定義為錯配修復蛋白功能缺陷（MMR defi c i ent，dMMR）。均陽性則為錯配修復蛋白功能正常（ M M R proficient，pMMR）（表1）。

免疫組織化學SP法檢測EGFR蛋白表達。EGFR定位在細胞質和細胞膜。計算EGFR時均根據染色強度以及陽性細胞數，判斷依據則可以將其得分作為參照。陽性細胞數評分標準： 1 分（ ≤25%） ;2 分（ 26% ～ 50%） ; 3 分（ 51% ～ 74%） ; 4 分（ ≥75%） 。染色強度評分標準： 1 分（ 淡棕色） ; 2 分（ 棕黃色） ; 3 分（ 棕褐色） 。綜合評分標準： 0 ～ 1 分（ - ） ; 2 ～3 分（ + ） ; 4 ～ 5 分（ + + ） ; 6 ～ 7 分（ + + + ） ，其中+～ + + + 為陽性（表2）。

免疫組織化學SP法檢測P53蛋白表達。p53蛋白表達于細胞核，腫瘤組織75%以上核彌漫強陽性或<5%染色或全陰性，則為p53突變型，5%～75%強弱不等陽性表達為p53蛋白野生型（表3）。

所有免疫組化結果均由兩名主治級別以上醫師分別進行判讀，后采用平均數。以上所有免疫組化抗體及試劑均購自河南賽諾特生物技術有限公司，并嚴格按照試劑盒要求步驟進行檢測。

結果：

在大腸癌腫瘤組織中MMR、EGFR、P53蛋白的表達結果顯示，dMMR16例，占比17.8%，EGFR陽性49例，占比54.4%，P53陽性59例，占比65.6%。

大腸癌臨床病理特征與MMR、EGFR、P53蛋白表達的關系。腺癌伴粘液腺癌成的腫瘤以及腫瘤部位與dMMR有明顯關系，年齡以及腫瘤大小與EGFR蛋白表達有明顯關系，腫瘤轉移情況與P53蛋白表達有明顯關系。具體情況見表1。

MMR基因檢測結果顯示，微衛星不穩定6例，占比6.7%。其中體系與胚系均突變者1例，占比1.1%，根據臨床病史，其父親也為大腸癌患者，可以明確診斷為林奇綜合征。

討論：

河北省廊坊市三河市、香河縣和大廠回族自治區地理位置緊鄰北京市，位于北京市東側，俗稱北三縣。由于經濟發展，近10年來，北三縣外來人口增多，導致本地人口占比不足十分之一。往來北京市通勤的人口大約有30萬左右。隨著人口遷徙，生活習慣的改變，目前當地大腸癌的發病是否受到影響，目前尚未有人研究。

有的研究表明，在大腸癌的標本中，EGFR的表達占比達61%，本研究EGFR的表達占比54.4%，無明顯差異。EGFR的過表達參與腫瘤細胞的轉移，本研究顯示在部分大腸癌患者中，隨著年齡的增長，EGFR的過表達率升高，說明年齡是腫瘤轉移的高風險因素。腫瘤直徑越小，EGFR的過表達率越高，說明腫瘤在發生的早期階段，轉移性和侵襲性會增高。

有研究表明，在大腸癌的標本中，dMMR占比約為16%。本研究顯示dMMR占比17.8%，無明顯差異。在腺癌伴粘液腺癌的大腸癌標本及右半結腸癌中，dMMR的表達率明顯增高。免疫組化表達出的dMMR，比基因檢測出的dMMR比例高，說明有些基因未出現突變，但蛋白質表達被沉默了。其對大腸癌的發病影響是否一致，對靶向治療是否有影響，有待進一步研究。

本研究顯示P53的突變率為65.6%，接近70%，無淋巴結轉移的突變率增高，說明P53不僅在癌癥的發生發展中起到關鍵作用，有可能在癌癥的轉移中也起到某些作用，有待進一步研究。

總之，MLH1，PMS2，MSH2，MSH6，EGFR 及P53蛋白的表達與大腸癌的轉移、生長、侵襲都有著較大關聯，因此，微衛星不穩定四項蛋白質，EGFR及P53三者的聯合篩查可以為靶向治療提供用藥指導，有利于高危患者的早期判斷，有利于患者預后的判斷。

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