斯日古楞 程健澤 趙偉軍

結直腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤，其發病率隨著人口老齡化及人們飲食習慣的改變逐年升高[1]。結直腸癌臨床表現隱秘，多數患者確診時已為中晚期，預后較差[2]。研究顯示，結直腸癌與多基因表觀遺傳、轉錄及翻譯等多層次異常變化有關[3]，探討結直腸癌中異常表達的基因分子及其對該腫瘤發生發展的影響可為其治療提供分子靶點。長鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)是兩類小分子非編碼RNA，且lncRNA可作為競爭性內源性RNA與miRNA靶向結合，調控miRNA靶基因的表達，進而影響細胞的增殖、分化和凋亡等生命活動，與腫瘤的發生發展密切相關[4,5]。溶質載體家族16成員1的反義RNA 1(SLC16A1-AS1)是一種lncRNA，參與多種腫瘤的發展進程。例如，SLC16A1-AS1在肝細胞癌組織和細胞中的表達明顯下調，過表達SLC16A1-AS1可靶向調控的miR-301b-3p/CHD5軸抑制肝細胞癌細胞增殖、侵襲和上皮-間質轉化過程，促進細胞凋亡，增強細胞放射敏感性[6]。但目前，SLC16A1-AS1能否影響結直腸癌的發生發展還未知。LncBase v.2生物信息學軟件預測顯示，SLC16A1-AS1可能靶向調控miR-450b-5p。研究顯示，miR-450b-5p在結直腸組織中呈高表達，其高表達與腫瘤分化不良、TNM分期晚和預后不良呈正相關，過表達miR-450b-5p可靶向抑制SFRP2和SIAH1的表達并激活Wnt/β-Catenin信號傳導促進結直腸癌細胞增殖及腫瘤生長，同時抑制細胞凋亡[7]。本研究探討SLC16A1-AS1對Caco-2細胞的細胞周期、遷移、侵襲及凋亡的影響及能否靶向miR-450b-5p發揮作用，以期為結直腸癌的治療提供新的分子靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年10月至2019年3月于我院行手術治療的33例結直腸癌患者的癌組織和癌旁組織。其中，男19例，女14例；平均年齡(56.49±8.24)歲。納入標準：病理檢測診斷為結直腸癌；均為首次確診；術前未進行化療、放療等治療。排除標準：合并其他惡性腫瘤患者；合并肝臟、腎等重要臟器功能障礙者；合并自身免疫疾病。本研究經醫院病理委員會批準同意，患者家屬自愿簽署知情同意書。

1.2 細胞與試劑 結直腸癌細胞系Caco-2，中國科學院上海細胞庫；胎牛血清(FBS)，浙江天杭生物科技股份有限公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒，美國Promega公司；RPMI 1640培養基、細胞周期檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；LipofectamineTM 2000試劑盒和Trizol試劑，美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司；PCR引物、SLC16A1-AS1過表達載體(pcDNA-SLC16A1-AS1)、空載體(pcDNA-SLC16A1-AS1)、SLC16A1-AS1野生型質粒(WT-SLC16A1-AS1)、突變型質粒(MUT-SLC16A1-AS1)、miR-450b-5p 模擬物(mimcs)和模擬對照序列(miR-NC)，上海生工生物工程有限公司；兔抗人B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bax)抗體，美國Santa Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 RT-qPCR檢測SLC16A1-AS1和miR-450b-5p表達:Trizol試劑提取組織中總RNA，逆轉錄為cDNA，行PCR擴增。擴增程序：95℃ 5 min，95℃10 s，58℃ 30 s，72℃30 s，共35個循環。引物序列：SLC16A1-AS1上游5’-TGGACGATGCATATGTGGGG-3’，下游5’-CACGTTGGTTATGCGGTCAC-3’；GAPDH上游5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’；miR-450b-5p上游5’-GTAACCAGGGCGCAGCTC-3’，下游5’-CGGCGAGATGCTCGGC-3’；U6上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’，下游5’-AACGATTCACGAATTTGCGT-3’。2-△△Ct法計算SLC16A1-AS1相對于內參GAPDH、miR-450b-5p相對于內參U6的表達水平。

1.3.2 細胞培養和轉染:復蘇Caco-2細胞，用含10% FBS的RPMI 1640培養基培養。將對數增殖期的Caco-2細胞以2.0×105個/孔接種于6孔板中，采用LipofectamineTM 200脂質體法，分別轉染pcDNA(pcDNA組)、pcDNA-SLC16A1-AS1(pcDNA-SLC16A1-AS1組)、共轉染pcDNA-SLC16A1-AS1與miR-NC(pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-NC組)、pcDNA-SLC16A1-AS1與 miR-450b-5p mimics(pcDNA-SLC16A1-AS1+ miR-450b-5p mimics組)，轉染時間為6 h。然后更換培養基，再培養24 h，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞備用。同時RT-qPCR法檢測pcDNA組、pcDNA-SLC16A1-AS1組SLC16A1-AS1和miR-450b-5p表達水平，方法同1.3.1。

1.3.3 雙熒光素酶報告基因實驗驗證SLC16A1-AS1和miR-450b-5p靶向關系:將對數增殖期的Caco-2細胞以2.0×105個/孔接種于6孔板中，采用LipofectamineTM200脂質體法，分別共轉染WT-SLC16A1-AS1與miR-450b-5p mimics或miR-NC、MUT-SLC16A1-AS1與miR-450b-5p mimics或miR-NC，轉染時間為6 h。然后更換培養基，再培養24 h，收集細胞并裂解，參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書步驟，檢測細胞熒光素酶活性。

1.3.4 流式細胞術檢測細胞周期:將4組細胞以1.0×103個/孔接種于6孔板中，培養24 h后，收集細胞。PBS清洗1次，加預冷無水乙醇，4℃固定過夜。1 000 r/min離心5 min，棄上清，加PBS清洗細胞。1 000 r/min離心5 min，棄上清，加100 μl RNase懸浮細胞，37℃水浴30 min。加400 μl PI，混合均勻后，4℃孵育30 min，上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3.5 Transwell檢測細胞遷移和侵襲:調整各組細胞(pcDNA組、pcDNA-SLC16A1-AS1組、pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-NC組、pcDNA-SLC16A1-AS1+ miR-450b-5p mimics組)的密度為5×104個/ml。遷移實驗：Transwell上室加100 μl細胞懸液，下室加入500 μl培養基。培養24 h后，4%多聚甲醛固定30 min，0.4%結晶紫染色15 min，顯微鏡觀察，隨機取5個視野，計數。侵襲實驗：預先在Transwell上室鋪Matrigel基質膠，自然晾干后，加100 μl細胞懸液，后續操作同細胞遷移實驗。

1.3.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡:將各組細胞(pcDNA組、pcDNA-SLC16A1-AS1組、pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-NC組、pcDNA-SLC16A1-AS1+ miR-450b-5p mimics組)以5.0×104個/孔接種于24孔板中，培養24 h，收集細胞，PBS清洗2次。然后參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書步驟，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.7 Western Blot法檢測Bcl-2和Bax蛋白表達:將4組細胞(pcDNA組、pcDNA-SLC16A1-AS1組、pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-NC組、pcDNA-SLC16A1-AS1+ miR-450b-5p mimics組)以5.0×104個/孔接種于24孔板中，培養24 h后，采用RIPA試劑提取細胞中總蛋白。BCA法測定蛋白含量后，行12% SDS-PAGE電泳，并將分離蛋白轉至PVDF膜，然后于5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h。分別置于Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)一抗孵育液中，4℃孵育過夜。再置于山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育液中，37℃孵育1 h。最后加顯影液避光顯影，曝光拍照。

2 結果

2.1 SLC16A1-AS1和miR-450b-5p在結直腸癌中的表達 與癌旁組織比較，結直腸癌組織中SLC16A1-AS1的表達降低(P<0.05)，而miR-450b-5p的表達升高(P<0.05)。見表1。

2.2 SLC16A1-AS1過表達載體轉染效果及對miR-450b-5p表達的影響 與pcDNA組比較，pcDNA-SLC16A1-AS1組Caco-2細胞中SLC16A1-AS1的表達升高(P<0.05)，表明pcDNA-SLC16A1-AS1轉染成功，過表達SLC16A1-AS1的Caco-2細胞構建成功。與pcDNA組比較，pcDNA-SLC16A1-AS1組Caco-2細胞中miR-450b-5p的表達降低(P<0.05)。見表2。

表1 結直腸癌中SLC16A1-AS1和miR-450b-5p的表達

表2 SLC16A1-AS1和miR-450b-5p的表達

2.3 SLC16A1-AS1靶向結合miR-450b-5p 與共轉染WT-SLC16A1-AS1與miR-NC的細胞比較，共轉染WT-SLC16A1-AS1與miR-450b-5p mimics的細胞熒光素酶活性顯著降低(0.14±0.01 0.98±0.04，t=35.287，P<0.05)；而與共轉染MUT-SLC16A1-AS1與miR-NC的細胞比較，共轉染MUT-SLC16A1-AS1與miR-450b-5p mimics的細胞熒光素酶活性無顯著變化(0.97±0.06比0.99±0.05，t=0.444，P=0.680)，說明SLC16A1-AS1可靶向結合miR-450b-5p。見圖1。

圖1 SLC16A1-AS1靶向miR-450b-5p

2.4 4組Caco-2細胞的細胞周期分布 與pcDNA組比較，pcDNA-SLC16A1-AS1組Caco-2細胞的細胞周期G0-G1期延長(P<0.05)，S期縮短(P<0.05)，而G2-M期無顯著變化(P>0.05)。與pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-NC組比較，pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-450b-5p mimic組Caco-2細胞的細胞周期G0-G1期縮短(P<0.05)，S期延長(P<0.05)，而G2-M期無顯著變化(P>0.05)。見表3。

2.5 4組Caco-2細胞遷移和侵襲數比較 與pcDNA組比較，pcDNA-SLC16A1-AS1組Caco-2細胞遷移和侵襲數降低(P<0.05)。與pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-NC組比較，pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-450b-5p mimic組Caco-2細胞遷移和侵襲數升高(P<0.05)。見表4。

表3 4組Caco-2細胞的細胞周期分布

表4 4組Caco-2細胞遷移和侵襲數比較 n=3,個,

2.6 4組Caco-2細胞凋亡率及凋亡蛋白表達水平比較 與pcDNA組比較，pcDNA-SLC16A1-AS1組Caco-2細胞凋亡率和Bax蛋白表達升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)。與pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-NC組比較，pcDNA-SLC16A1-AS1+miR-450b-5p mimic組Caco-2細胞凋亡率和Bax蛋白表達降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05)。見表5，圖2、3。

表5 4組Caco-2細胞凋亡率及中Bax和Bcl-2蛋白表達水平

圖2 流式細胞術檢測4組Caco-2細胞凋亡

3 討論

lncRNA是真核生物中存在的一類長度>200個核苷酸的小分子非編碼RNA，參與調控細胞增殖和凋亡等生命活動，在人類腫瘤的發生發展起重要作用[8]。研究已表明，多種lncRNA在結直腸癌中異常表達，可作為結直腸癌治療的潛在分子靶點。Cheng等[9]研究顯示，lncRNA NEAT1在結直腸癌組織和細胞中的表達上調，下調NEAT1表達通過靶向miR-195-5p并抑制CEP55的表達減弱結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，同時誘導細胞凋亡。Zhou等[10]研究顯示，lncRNA PGM5-AS1在人結直腸癌細胞中低表達，上調其表達可靶向抑制miR-100-5p并促進SMAD4的表達降低結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。Tang等[11]研究顯示，lncRNA ADIPOQ在人結直腸癌組織和Caco-2細胞中的表達下調，上調ADIPOQ表達可通過負調控miR-219c-3p抑制Caco-2細胞增殖，遷移和侵襲。

圖3 4組Caco-2細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達

作為一種lncRNA，SLC16A1-AS1參與調控多種腫瘤的發展進程。研究顯示，SLC16A1-AS1在非小細胞肺癌(NSCLC)組織和細胞系中呈低表達，過表達SLC16A1-AS1可抑制NSCLC細胞的活力和增殖，阻斷細胞周期進程并促進細胞凋亡，可作為NSCLC的潛在治療靶點[12]。而SLC16A1-AS1在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)組織中呈高表達，沉默其表達明顯降低OSCC細胞系CAL27和SCC25的增殖速率及集落形成能力，SLC16A1-AS1在OSCC中發揮促癌基因作用[13]。說明SLC16A1-AS1在不同腫瘤中發揮的作用不同。

本研究顯示，結直腸癌組織中SLC16A1-AS1的表達明顯高于癌旁組織，過表達SLC16A1-AS1阻滯了Caco-2細胞的細胞周期進程，降低了Caco-2細胞的遷移和侵襲能力，且誘導了Caco-2細胞凋亡，提示SLC16A1-AS1在結直腸癌中發揮抑癌基因作用，通過靶向上調其表達可抑制結直腸癌的發展進程。細胞凋亡是一種程序性死亡過程，受多種基因的調控。腫瘤細胞凋亡受阻，誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的途徑。Bax和Bcl-2參與調控細胞凋亡。Bax表達增加可增強線粒體膜的通透性，使細胞色素C進入細胞質激活Casoase-3，誘導細胞凋亡[14]。Bcl-2可與Bax結合形成異源二聚體，抑制Bax的促凋亡作用。本研究顯示，過表達SLC16A1-AS1抑制了Caco-2細胞中Bcl-2蛋白的表達，而促進了Bax蛋白的表達，從側面說明過表達SLC16A1-AS1可誘導Caco-2細胞凋亡，SLC16A1-AS1可作為結直腸癌治療的分子靶點。

生物信息學軟件預測顯示，SLC16A1-AS1可能靶向結合miR-450b-5p。本研究首先利用雙熒光素酶報告基因實驗證實了SLC16A1-AS1可靶向結合miR-450b-5p；同時，過表達SLC16A1-AS1抑制了Caco-2細胞中miR-450b-5p的表達，說明SLC16A1-AS1在Caco-2細胞中靶向負調控miR-450b-5p表達。miR-450b-5p參與多種腫瘤的發展進程，且在不同腫瘤中的作用不同。研究顯示，miR-450b-5p在膠質母細胞瘤中表達升高，抑制其表達可降低細胞的增殖和侵襲性[15]。而miR-450b-5p在宮頸癌[16]、肺腺癌[17]和肝細胞癌[18]等腫瘤中則表達降低，其作為抑癌基因參與這些腫瘤的發展進程。本研究顯示，miR-450b-5p在結直腸癌組織中呈高表達，與吳萍[19]的報道一致，提示miR-450b-5p可能作為促癌基因促進結直腸癌的發生發展；過表達miR-450b-5p逆轉了過表達SLC16A1-AS1對Caco-2細胞的細胞周期、遷移和侵襲的抑制作用及凋亡促進作用，提示過表達SLC16A1-AS1通過靶向抑制miR-450b-5p的表達來阻滯Caco-2的細胞周期，降低細胞的遷移和侵襲能力及誘導細胞凋亡。

綜上所述，SLC16A1-AS1在結直腸癌組織中表達呈低表達，過表達SLC16A1-AS1可靶向負調控miR-450b-5p抑制結直腸癌Caco-2細胞的細胞周期進程、遷移和侵襲，并促進Caco-2細胞凋亡，SLC16A1-AS1/miR-450b-5p軸可能為結直腸癌的治療提供了新的分子靶點。