circ_0092306靶向miR-411調控胃癌細胞增殖、凋亡及上皮間質轉化的機制研究

趙德貞 孔超 李印虎

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤，具有較高的發病率和致死率[1]，嚴重威脅人類的生命健康。胃癌發病隱匿，多數患者確診時已處于中晚期，錯過最佳手術治療時間[2]。探究胃癌發生發展的分子機制并尋找治療靶點尤為重要。環狀RNA(circRNA)和微小RNA(miRNA)是兩類小分子非編碼RNA，且二者可靶向結合，參與胃癌在內多種腫瘤的發展進程[3,4]。有報道稱，circ_0092306在胃癌組織和細胞中表達上調，其促進胃癌的發展進程[5]。研究顯示，miR-411在宮頸癌[6]、結腸癌[7]、腎細胞癌[8]等腫瘤中呈低表達，其作為抑癌基因參與這些腫瘤的發生發展。但目前，circ_0092306能否靶向調控miR-411影響胃癌的發生發展還未知。因此，本研究首先檢測了胃癌組織和細胞系中circ_0092306和miR-411的表達，并以胃癌細胞為研究對象，觀察了circ_0092306能否靶向調控miR-411影響胃癌細胞的增殖、凋亡和上皮間質轉化，以期了解胃癌發生發展的機制并為其靶向治療提供新靶點。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集30例2016年5月至2018年12月于本院行手術治療的胃癌患者的癌組織和癌旁組織，液氮保存。其中男21例，女9例；平均年齡(60.53±7.21)歲。依據TNM分期不同，Ⅰ期4例，Ⅱ期9例，Ⅲ期17例。納入標準：均為首發病例；術前未進行放療和化療等治療。排除標準：合并其他惡性腫瘤患者；合并肝、腎等臟器功能障礙者；合并自身免疫系統疾病患者。本研究經本院倫理委員會批準同意，患者或家屬知情同意。

1.2 細胞與試劑 正常胃上皮細胞GES-1和胃癌細胞系(N87、HGC-27、AGS)，中國科學院上海細胞庫；胎牛血清(FBS)，美國Hycolne公司；RPMI 1640培養基和細胞計數試劑盒-8(CCK-8)，北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑和LipofectamineTM 2000試劑盒，美國Invitrogen公司；PCR引物、circ_0092306小干擾RNA(si-circ_0092306)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-411 模擬物(mimcs)、模擬對照序列(miR-NC)、miR-411抑制劑(anti-miR-411)、抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)、 circ_0092306野生型質粒(WT-circ_0092306)和突變型質粒(MUT-circ_0092306)，上海生工生物工程有限公司；逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒，深圳晶美生物工程有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；兔抗人細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bax)、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)和神經型鈣黏蛋白(Vimentin)多克隆抗體，美國Santa Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養:復蘇正常胃上皮細胞GES-1和胃癌細胞系(N87、HGC-27、AGS)，均加含10%FBS的RPMI 1640培養基置于37℃、CO2體積分數5%、濕度97%的培養箱中培養。將對數生長期的GES-1、N87、HGC-27、AGS細胞均以2.5×104個/孔接種于24孔板中，培養24 h后，收集細胞，檢測細胞中circ_0092306和miR-411水平。

1.3.2 RT-qPCR檢測circ_0092306和miR-411表達水平:Trizol試劑提取組織或細胞中總RNA，逆轉錄為cDNA后行PCR擴增。擴增程序：95℃3 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環。引物序列：circ_0092306上游5’-GTACGCTCTCGAGGAGCTCCTC-3’，下游5’-CGAATAGCGTAGAGAGTCC-3’；GAPDH上游5’-CGTTAACTATATTCTCGGGCCG-3’，下游5’-GCGCGATATCTCCTGCCGAGCTC-3’；miR-411上游5’-CTCTACAGCGATAACAGAAAC-3’，下游5’-CCCGATAAGTCCGTACTA-3’；U6上游5’-CGATAGCTAGCCTATCTCGAA-3’，下游5’-CGATAAGCTGGGACCCGATGC-3’。2-△△Ct法計算circ_0092306相對于GAPDH、miR-411相對于U6的表達水平。

1.3.3 細胞分組轉染:將對數生長期的AGS細胞以1×105個/孔接種于6孔板中，采用LipofectamineTM 2000脂質體法，分別轉染si-NC(si-NC組)、si-circ_0092306(si-circ_0092306組)、miR-NC(miR-NC組)、miR-411(miR-411組)、共轉染si-circ_0092306與anti-miR-NC(si-circ_0092306+anti-miR-NC組)、si-circ_0092306與anti-miR-411(si-circ_0092306+anti-miR-411組)。轉染6 h后，更換培養基。再培養24 h，收集細胞備用。

1.3.4 CCK-8法檢測細胞增殖:轉染后的各組細胞以0.5×104個/孔接種于96孔板中，培養24 h，加10 μl的CCK-8試劑。再孵育2 h，酶標儀450 nm測光密度(OD)值。

1.3.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡:轉染后的各組細胞以2.5×104個/孔接種于24孔板中，培養24 h，收集細胞。PBS清洗細胞2次，參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.6 Western Blot法檢測蛋白表達:轉染后的各組細胞以2.5×104個/孔接種于24孔板中，培養24 h，收集細胞。PBS清洗細胞2次，RIPA試劑提取細胞中總蛋白。BCA法測定蛋白濃度后，行SDS-PAGE電泳，并將分離蛋白轉至PVDF膜，且于5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h。然后分別置于CyclinD1(1∶500)、P21(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、E-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗孵育液中，4℃孵育過夜。再置于山羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育液中，37℃孵育1 h。最后加顯影液避光顯影，凝膠成像系統曝光拍照。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因實驗:將對數生長期的AGS細胞以1×105個/孔接種于6孔板中，采用LipofectamineTM 2000脂質體法，分別轉染WT-circ_0092306與miR-411 mimics或miR-NC、MUT-circ_0092306與miR-411 mimics或miR-NC，轉染6 h后，更換培養基。再培養24 h，收集細胞，參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書，檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 circ_0092306和在胃癌組織和細胞中的表達 與癌旁組織比較，胃癌組織中circ_0092306表達升高(P<0.05)，miR-411表達降低(P<0.05)。與GES細胞比較，胃癌細胞系N87、HGC-27和AGS中circ_0092306表達升高(P<0.05)，miR-411表達降低(P<0.05)。見表1、2。

表1 circ_0092306和miR-411在胃癌組織中的表達

表2 circ_0092306在胃癌細胞中的表達

2.2 下調circ_0092306對AGS細胞增殖的影響 與si-NC組比較，si-circ_0092306組AGS細胞中circ_0092306表達降低(P<0.05)，細胞OD值、CyclinD1蛋白表達降低(P<0.05)，P21蛋白表達升高(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 下調circ_0092306對AGS細胞增殖的影響

圖1 增殖相關蛋白表達

2.3 下調circ_0092306對AGS細胞凋亡的影響 與si-NC組比較，si-circ_0092306組AGS細胞凋亡率、Bax蛋白表達升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)。見表4，圖2。

表4 下調circ_0092306對AGS細胞凋亡的影響

2.4 下調circ_0092306對AGS細胞EMT的影響 與si-NC組比較，si-circ_0092306組AGS細胞中E-cadherin蛋白表達升高(P<0.05)，Vimentin蛋白表達降低(P<0.05)。見圖3，表5。

表5 下調circ_0092306對AGS細胞EMT的影響

2.5 circ_0092306靶向調控miR-411的表達 與共轉染WT-circ_0092306與miR-NC的細胞比較，共轉染WT-circ_0092306與miR-411 mimics的細胞熒光素酶活性降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與共轉染MUT-circ_0092306與miR-NC的細胞比較，共轉染MUT-circ_0092306與miR-411 mimics的細胞熒光素酶活性無顯著變化，差異有統計學意義(P>0.05)。si-circ_0092306組AGS細胞中miR-411表達高于si-NC組(3.85±0.30比1.01±0.03，t=28.259，P<0.05)。見圖4，表6。

2.6 上調miR-411對AGS細胞增殖、凋亡和EMT的影響 與miR-NC組比較，miR-411組AGS細胞中miR-411表達升高(P<0.05)，細胞OD值及CyclinD1、Bcl-2、Vimentin蛋白表達降低(P<0.05)，凋亡率及P21、Bax、E-cadherin蛋白表達升高(P<0.05)。見圖5，表7、8。

圖4 circ_0092306的序列中含有與miR-411互補的核苷酸序列

表6 雙熒光素酶報告實驗

圖5 上調miR-411對AGS細胞增殖和凋亡的影響；A：增殖、凋亡相關蛋白表達；B：細胞凋亡流式圖

表7 上調miR-411對AGS細胞增殖和凋亡的影響

表8 上調miR-411對AGS細胞增殖、凋亡和EMT相關蛋白表達的影響

2.7 下調miR-411逆轉下調circ_0092306對AGS細胞增殖、凋亡和EMT的作用 與si-circ_0092306+anti-miR-NC組比較，si-circ_0092306+anti-miR-411組AGS細胞中miR-411表達降低(P<0.05)，細胞OD值及CyclinD1、Bcl-2、Vimentin蛋白表達升高(P<0.05)，凋亡率及P21、Bax、E-cadherin蛋白表達降低(P<0.05)。見圖6，表9。

3 討論

circRNA呈閉合環狀結構，其結構穩定，且高度保守，參與調控細胞增殖、凋亡等生命活動，與腫瘤的發生發展密切相關[9]。研究已表明，多種circRNA在胃癌中異常表達，參與胃癌的發展進程。例如，Zhang等[10]研究顯示，circDUSP16在胃癌組織中的表達水平明顯升高，是胃癌患者生存不良的獨立預后因素，敲除circDUSP16可抑制胃癌細胞活力、集落形成和侵襲，其作用機制與靶向結合miR-145-5p有關。Cai等[11]研究顯示，circ_0000267在胃癌組織和細胞系中表達升高，且其高表達與腫瘤直徑增加和局部淋巴結轉移密切相關，上調circ_0000267可靶向結合miR-503-5p并上調HMGA2的表達加速了胃癌細胞的增殖、轉移和EMT進程，促進了胃癌的發展進程。Xu等[12]研究顯示，circ MTHFD2在耐培美曲塞(MTA)的胃癌細胞中表達升高，過表達circ MTHFD2可靶向結合miR-124誘導MDR-1的表達增強胃癌細胞耐藥性。

圖6 下調miR-411逆轉下調circ_0092306對AGS細胞增殖、凋亡和EMT的作用；A 增殖、凋亡和EMT相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表9 下調miR-411逆轉下調circ_0092306對AGS細胞增殖、凋亡和EMT的作用

作為一種circRNA，目前對circ_0092306在腫瘤中發揮作用的研究較為少見。本研究顯示，胃癌組織和細胞系中circ_0092306表達升高，下調circ_0092306降低胃癌細胞AGS的增殖能力及上皮間質轉化過程，其促進AGS細胞凋亡，與Chen等[5]報道的結果一致。細胞增殖和凋亡受多種基因的調控。CyclinD1參與調控細胞周期，其表達增加加速細胞周期進程，促進細胞增殖。P21是目前公認的腫瘤抑制因子，其表達增加抑制細胞增殖。Bcl-2和Bax是細胞凋亡的重要調控分子，二者作用相反，Bcl-2表達升高抑制細胞凋亡，而Bax表達升高則加劇細胞凋亡[13]。本研究顯示，下調circ_0092306抑制了AGS細胞中CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達，促進了P21和Bax蛋白的表達，進一步說明下調circ_0092306抑制了胃癌細胞的增殖，且促進了細胞凋亡，circ_0092306可作為胃癌治療的潛在分子靶點。

上皮間質轉化(EMT)是上皮細胞失去極性獲得間質細胞特性的過程，導致細胞骨架改變、細胞間黏附減弱、細胞的遷移能力增強。在EMT過程中，上皮標志物如E-cadherin表達降低，而Vimentin等間質標志物表達升高[14]。腫瘤細胞通過EMT獲得由原位向周圍侵襲的能力，最終進入血液和淋巴途徑轉移至遠處形成新的病灶[15]。本研究顯示，下調circ_0092306表達促進了胃癌細胞AGS中E-cadherin蛋白的表達，而抑制了Vimentin蛋白的表達，說明下調circ_0092306表達抑制了AGS細胞的上皮間質轉化過程，降低細胞遷移和侵襲的可能，對延緩胃癌發展進程具有重要意義。

為了探究circ_0092306影響胃癌細胞增殖、凋亡及上皮間質轉化的分子機制，本研究利用雙熒光素酶報告基因實驗證實了circ_0092306可與miR-411靶向結合。同時上調circ_0092306表達抑制了AGS細胞中miR-411的表達，而下調circ_0092306表達則促進了miR-411表達，進一步說明了circ_0092306負調控miR-411表達。研究顯示，miR-411在宮頸癌[16]、腎細胞癌[17]和卵巢癌[18]等腫瘤中表達下調，上調其表達可減弱腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等惡性生物學行為，抑制腫瘤的發展進程；而miR-411在骨肉瘤[19]、非小細胞肺癌[20]等腫瘤中表達上調，促進這些腫瘤的發展進程。本研究顯示，miR-411在胃癌組織和細胞系中表達下調，上調其表達降低了胃癌細胞AGS的增殖能力及上皮間質轉化過程，且促進了AGS細胞凋亡，與Bai等[21]報道的miR-411在胃癌細胞系中表達下調，過表達miR-411抑制胃癌細胞增殖、集落形成及遷移的結果一致，說明miR-411在胃癌中也發揮腫瘤抑制作用。本研究還顯示，下調miR-411表達逆轉了下調circ_0092306對AGS細胞增殖、凋亡及上皮間質轉化的影響，提示circ_0092306通過靶向負調控miR-411來影響胃癌細胞的惡性生物學行為。

綜上，circ_0092306在胃癌組織和細胞系中表達升高，而miR-411表達降低；下調circ_0092306表達可靶向負調控miR-411來抑制胃癌細胞增殖及上皮間質轉化，且誘導了胃癌細胞凋亡，circ_0092306/miR-411軸可能為胃癌的治療提供了新的分子靶點。本研究接下來將進一步探究miR-411下游靶基因及信號通路對胃癌發生發展的影響，并通過裸鼠移植瘤實驗驗證circ_0092306/miR-411軸胃癌體內腫瘤生長的影響。