小白菊內脂通過wnt/β-catenin影響胃癌細胞侵襲、遷移、凋亡的機制研究

張榮 姚春和

胃癌是全球常見的消化道腫瘤，對其早期診斷、治療、預測腫瘤復發轉移和評估預后有重大意義[1]。Wnt/β-catenin信號通路的異常活化與人類多種癌癥的發病相關，可調控細胞的增殖、遷移、黏附和凋亡等，β-catenin是Wnt/β-catenin信號傳導途徑的關鍵調控因子，β-catenin水平低時，Wnt通路關閉，反之，Wnt通路開啟[2]。研究發現胃癌轉移患者組織中Wnt1 mRNA水平明顯上調，β-catenin蛋白的水平也明顯增加，提示其與胃癌的進展有關[3]。研究發現中醫藥在一定程度上可以防治胃癌的侵襲和轉移[4]。小白菊內脂(parthenolide，PTL)是從中草藥小白菊中提取的一種倍半萜內脂類化合物，其具有免疫調節功能，且還能抑制腫瘤細胞生長，誘導腫瘤細胞凋亡[5]。PTL能通過抑制PI3K/Akt信號通路誘導非小細胞性肺癌H1975細胞發生凋亡，抑制其侵襲和遷移[6]。PTL還能有效抑制結腸癌細胞及移植瘤的生長[7]。PTL還具有抑制胃癌細胞增殖和誘導其凋亡的作用[8]。但PTL對胃癌細胞侵襲遷移的影響及其作用機制還尚未可知，本實驗旨在研究PTL是否調控Wnt/β-catenin信號通路影響胃癌細胞侵襲、遷移和凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料 胃癌細胞SGC-7901、SNU-1(貨號：YS265C、YS1368C，上海雅吉生物科技有限公司)；胎牛血清(貨號：10437-028，美國Gibco公司)；RPMI-1640培養基(貨號：R1145)、胰蛋白酶(貨號：T7409)購自美國Sigma公司；MTT試劑盒(貨號：8028，美國Sciencell公司)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(貨號：AD10-2，日本同仁研究所)；BCA試劑盒(貨號：23227，美國PIERCE公司)；RIPA蛋白裂解液(貨號：BB-3201，貝博生物技術公司)；SDS-PAGE試劑盒(貨號：PN1200-25T，金克隆(北京)生物技術有限公司)；Wnt激活劑CHIR99021(貨號：S2924，美國Selleck公司)；Transwell小室(貨號：354480)、Matrigel(貨號：356234)(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組:將胃癌細胞SGC-7901、SNU-1接種于含10 %胎牛血清的滅菌的RPMI-1640培養液中進行培養，取對數生長期細胞SGC-7901、SNU-1，將其用不同濃度的小白菊內酯(0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L)處理SGC-7901、SNU-1細胞，記為對照組、10 μmol/L組、20 μmol/L組、40 μmol/L組、60 μmol/L組；用20 μmoL/L的小白菊內酯作用于SGC-7901、SNU-1細胞培養12 h后再加入5 μmol/L的CHIR99021培養6 h，記為CHIR99021+PTL組。

1.2.2 MTT檢測細胞增殖:收集以上各組培養12 h、24 h、48 h的細胞，按試劑盒說明操作，酶標儀檢測490 nm處吸光度(A)值。細胞增殖抑制率(%)=1-(A實驗組值/A空白對照組值)×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡:收集以上各組細胞，按試劑盒說明書操作，上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達:提取總蛋白，BCA試劑盒定量；然后分別進行SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉；然后加入一抗和二抗孵育，最后在暗室中曝光顯影，定影，檢測蛋白條帶吸光度，以β-actin為內參計算蛋白表達水平。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲:收集以上各組細胞，制成細胞懸液。細胞遷移實驗：Transwell小室上室接種細胞懸液，下室中添加細胞培養液，培養24 h，PBS洗滌細胞，加入4%多聚甲醛固定，再用結晶紫染色，顯微鏡下拍照并計數。細胞侵襲實驗：用Matrigel覆蓋Transwell小室的上室，其余按照細胞遷移實驗步驟操作。

2 結果

2.1 PTL對SGC-7901、SNU-1細胞的增殖抑制作用 不同濃度小白菊內酯后胃癌細胞SGC-7901、SNU-1的增殖抑制率均顯著高于對照組(P<0.05)。可見，小白菊內酯抑制胃癌細胞SGC-7901、SNU-1的增殖。見表1。

表1 MTT法檢測不同濃度PTL對SGC-7901、SNU-1細胞增殖的影響

2.2 PTL對SGC-7901、SNU-1細胞凋亡的影響 與對照組相比，不同濃度PTL組胃癌細胞SGC-7901、SNU-1的凋亡率升高(P<0.05)，胃癌細胞SGC-7901、SNU-1中Bax表達水平升高，Bcl-2表達水平降低(P<0.05)。可見，小白菊內酯促進胃癌細胞SGC-7901、SNU-1凋亡。見表2。

表2 不同濃度PTL對SGC-7901、SNU-1細胞凋亡影響

2.3 PTL對SGC-7901、SNU-1細胞侵襲和遷移的影響 與對照組相比，不同濃度PTL組胃癌細胞SGC-7901、SNU-1中Vimentin的表達水平降低(P<0.05)，snail的表達水平降低(P<0.05)，E-cadherin的表達水平升高(P<0.05)，細胞SGC-7901、SNU-1遷移和侵襲數量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。小白菊內酯抑制胃癌細胞SGC-7901、SNU-1的遷移和侵襲。見表3，圖1。

表3 不同濃度PTL對SGC-7901、SNU-1細胞侵襲和遷移的影響

圖1 Transwell assay 檢測不同濃度PTL對SGC-7901、SNU-1細胞侵襲和遷移的影響(結晶紫染色×200)

2.4 PTL處理SGC-7901、SNU-1 細胞，wnt-1、β-catenin 蛋白表達情況研究 與對照組相比，不同濃度PTL處理組胃癌細胞SGC-7901、SNU-1中wnt-1、β-catenin的表達水平降低(P<0.05)。見表4。

表4 不同濃度PTL處理SGC-7901、SNU-1細胞，wnt-1、β-catenin 蛋白表達情況

2.5 PTL和Wnt激活劑(CHIR99021)+PTL對SGC-7901、SNU-1細胞凋亡、侵襲、遷移的影響 與PTL組相比，CHIR99021+PTL組胃癌細胞SGC-7901、SNU-1中wnt-1、β-catenin、Bcl-2、Vimentin、snail的表達水平顯著升高，Bax、E-cadherin的表達水平顯著降低(P<0.05)，胃癌細胞SGC-7901、SNU-1的凋亡率顯著降低(P<0.05)，胃癌細胞SGC-7901、SNU-1遷移和侵襲數量顯著升高(P<0.05)。見表5～7，圖2。

表5 PTL和Wnt激活劑(CHIR99021)+PTL對SGC-7901、SNU-1細胞凋亡、侵襲、遷移的影響

表6 Western blot檢測SGC-7901細胞中wnt-1、β-catenin 、Bax、Bcl-2、E-cadherin、Vimentin、snail的蛋白表達

表7 Western blot檢測SNU-1 細胞中wnt-1、β-catenin 、Bax、Bcl-2、E-cadherin、Vimentin、snail的蛋白表達

圖2 用Transwell assay 檢測不同濃度PTL對SGC-7901、SNU-1細胞侵襲和遷移的影響(結晶紫染色×200)

3 討論

胃癌的發病率及死亡率近年來不斷上升，目前主要采用以手術為主的綜合治療，但轉移復發率高，而在不同階段中醫藥可以發揮預防癌前病變、促進術后康復、減輕放化療毒性，提高生活晚期患者質量，延長生存期等作用[9]。PTL是一種天然產物，對腫瘤細胞有較好的殺傷作用，PTL不僅能促進細胞凋亡，并抑制SW620細胞的遷移和侵襲[10]。PTL還能夠抑制宮頸癌Hela細胞株生長與遷移能力[11]。PTL通過下調GSK3β磷酸化抑制SNAIL蛋白入核，從而促進了E-cadherin蛋白的表達進而抑制膠質瘤細胞的遷移、侵襲[12]。PTL降低了乳腺癌細胞分泌的MMP-9，VEGF和IL-8的水平，抑制人臍靜脈內皮細胞的增殖，遷移[13]。以上研究表明PTL具有抑制多種癌癥進展的作用。為研究PTL是否對胃癌具有抑癌作用，本實驗用不同濃度的PTL處理SGC-7901、SNU-1細胞，結果顯示，細胞增殖抑制率升高，凋亡率升高，胃癌細胞SGC-7901、SNU-1中Bax表達水平升高，Bcl-2表達水平降低，遷移、侵襲細胞數降低；表明PTL可抑制胃癌細胞SGC-7901、SNU-1增殖、遷移、侵襲，并可促進細胞凋亡。

上皮間質轉化是腫瘤發生轉移的重要機制之一，上皮性E-鈣粘蛋白(E-cadherin)是上皮間質轉化(EMT)相關的蛋白，不僅可調節細胞之間的粘附性，還可以調節基質金屬蛋白酶(MMP)的表達影響胃癌的侵襲轉移[14]。波形蛋白(Vimentin)是EMT相關的骨架蛋白，其高表達時腫瘤的遷移侵襲能力強[15]。Snail是一種鋅指蛋白轉錄因子，可以通過抑制E-cadherin影響EMT，抑制其表達可以抑制胃癌細胞體外遷移和侵襲能力[16]。以上研究表明EMT過程與癌細胞的遷移和侵襲能力密切相關。本研究結果顯示，PTL處理的胃癌細胞SGC-7901、SNU-1中Vimentin、snail蛋白下調表達，而E-cadherin上調表達表達；表明PTL可抑制胃癌細胞的EMT過程，推測PTL對胃癌細胞SGC-7901、SNU-1遷移、侵襲的抑制作用可能與抑制EMT過程有關。

Wnt信號傳導通路同腫瘤轉移早期的EMT現象密切相關，可直接或間接影響EMT相關蛋白和EMT的誘發因素，如β-catenin可使E-cadherin保持粘附功能。研究發現Wnt/β-catenin信號參與胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移，是介導胃組織癌變的關鍵信號；靶向抑制Wnt/β-catenin能夠抑制胃癌的生長、侵襲轉移[17]。研究報道下調胃癌中的Wnt /β-catenin通路能抑制細胞侵襲和遷移[18]。漢黃芩素可抑制Wnt/β-catenin通路進而抑制胃癌細胞增殖、侵襲和遷移，并誘導凋亡[19]。沉默YAP通過抑制Wnt/β-catenin信號通路激活誘導胃癌BGC823細胞的凋亡[20]。表明抑制Wnt/β-catenin通路可抑制胃癌細胞的惡性生物學行為，且藥物可影響Wnt/β-catenin通路激活與否。本實驗用不同濃度PTL處理胃癌細胞后，wnt-1、β-catenin蛋白表達水平降低，表明PTL可能抑制了Wnt信號通路的激活。此外,濃度為20 μmol/L的PTL對wnt-1、β-catenin蛋白表達的抑制率接近50%，因此選用此濃度與Wnt激活劑共同作用胃癌細胞，檢測其對胃癌細胞凋亡、侵襲、遷移的影響；結果顯示，激活Wnt信號通路可以逆轉PTL對胃癌細胞的侵襲、遷移抑制和凋亡促進的作用。提示，PTL對胃癌細胞侵襲、遷移的抑制作用和Wnt/β-catenin信號通路有關。

綜上所述，小白菊內酯可抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移，促進其凋亡，其機制可能與調控Wnt /β-catenin信號通路及相關蛋白有關，將可為胃癌的治療提供新思路和新靶點。