小立碗蘚WRKY基因家族生物信息學分析

喬剛 李莉 姜山

摘 要：? WRKY作為最先在植物中發現的轉錄因子，在植物生長發育等過程中發揮重要作用。為了更好地研究小立碗蘚WRKY蛋白的結構與功能，該文以Pfam數據庫中WRKY基因家族數據（登錄號為PF03106）為材料，分析了小立碗蘚（Physcomitrella patens）WRKY基因家族成員的理化性質、蛋白質的二級結構預測、染色體定位、內外顯子分布及系統進化關系。結果表明：（1）小立碗蘚WRKY基因家族成員共有38個基因，根據WRKY保守結構域個數和鋅指結構類型分成Ⅰ、Ⅱ兩大類，不含第Ⅲ類（鋅指結構為C2HC型），其中部分基因WRKY保守結構域發生變異。（2）WRKY蛋白氨基酸長度在216～775 aa之間、相對分子質量在 24.5～82.8 kDa之間，亞細胞定位顯示WRKY家族成員蛋白質定位于細胞核中。（3）WRKY蛋白的二級結構以α-螺旋、延伸鏈、β-轉角、無規卷曲四種構成元件構成，除PpWRKY11（α-螺旋為主）外，其余無規卷曲占比高達70%。（4）與擬南芥的系統進化關系表明，植物在進化過程中WRKY家族成員的數目與進化方式發生改變，WRKY基因家族成員外顯子的個數為3～7個。（5）小立碗蘚WRKY基因家族成員無規則分散于21條染色體上，并未形成基因簇。該研究通過分析WRKY基因家族的基本結構與性質，能為后續深入研究WRKY轉錄因子的功能奠定基礎。

關鍵詞： 小立碗蘚， WRKY轉錄因子， 基因家族分析， 生物信息

中圖分類號：? Q943

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2022）02-0267-10

Bioinformatics analysis of WRKY gene

family in Physcomitrella patens

QIAO Gang1， LI Li2， JIANG Shan2*

（ 1. School of Life Sciences， Guizhou Normal University， Guiyang 550001， China; 2. School of

International Education， Guizhou Normal University， Guiyang 550001， China ）

Abstract：? As a transcription factor first found in plants， WRKY plays an important role in plant growth and development. However， it has not been studied in Physcomitrella patens. By using the WRKY gene family data （accession number is PF03106） in Pfam database， this paper studied the basic information of WRKY in P. patens， which included physicochemical properties， protein secondary structure prediction， chromosome localization， exon and intron distribution and phylogenetic relationship. The results were as follows： （1） The WRKY gene family in P. patens consisted of 38 members which were divided into two major categories ─Ⅰ and Ⅱ， and the conserved domains of some WRKY genes had mutated. （2） The amino acid length of WRKY protein was 216-775 aa and the relative molecular mass was 24.5-82.8 kDa; Subcellular location showed that the proteins of WRKY gene family were distributed in the nucleus. （3） The secondary structure of WRKY protein was composed of four constituent elements： α-helix， extended strand， β-turn， and random coil; Except for PpWRKY11 （α-helix dominated）， the proportion of random coil was up to 70%. （4） The phylogenetic relationship with Arabidopsis showed that the number of the WRKY family members and the way of their revolution had changed in the process of plants’ evolution， the number of exons of WRKY gene family members were 3-7. （5）The members of WRKY gene were randomly dispersed on 21 chromosomes without forming a gene cluster. This study analyzed the basic structure and properties of the WRKY gene family， and it was found that the WRKY gene family of Physcomitrella patens has evolutionary diversity and unique variability in conserved domains， laying the foundation for subsequent research.

Key words： Physcomitrella patens， WRKY transcription factor， gene family analysis， bioinformatics

目前，在植物中發現60多個轉錄因子家族（Kaplan-Levy et al.，2012;Qin et al.，2014），其中研究較多的有MYB、NAC、WRKY、SBP、GARS等。WRKY（transcription factor）作為最先在植物中發現的轉錄因子（Wang et al.， 2015），它由N-端的WRKY保守結構域（WRKYGQK）和C-端的鋅指結構組成（Wang et al.， 2018）。根據保守結構域的個數和鋅指結構的類型，可將WRKY轉錄因子分成三類：Ⅰ類，含有2個WRKY結構域、鋅指結構為C2H2型;Ⅱ類，含有單個結構域，鋅指結構為C2H2（CX4-5-C-X22-23-H-X1-H），由此將其分為五個亞型（Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe）;Ⅲ類，單個保守結構域、鋅指為C2HC（C-X7-C-X23-HX）型（Song et al.， 2015; Jia et al.， 2018）。但是，在低等植物中不含有第Ⅲ類類型的WRKY轉錄因子（蘇琦等， 2007）。

小立碗蘚（Physcomitrella patens）作為高等植物中的低等類群，它的優勢主要體現在以下幾點：（1）小立碗蘚基因組測序結果已知（http：//www.cosmoss.org/）（Rensing et al.，2008）， 大小為511 Mb，染色體共有27條（Rensing et al.， 2002）;（2）同源重組率高;（3）生長周期短、易于擴繁（Xu et al.， 2009）;（4）細胞結構簡單，表型能直接觀察。因此，小立碗蘚已成為研究植物基因結構與功能的一種理想植物（藍雨純等， 2020）。

隨著生物技術的發展，WRKY轉錄因子不斷被發現。目前，已經鑒定出綠藻中有3個WRKY轉錄因子（Rinerson et al.， 2015）、卷柏19個（Li et al.， 2016）、山松83個（Liu et al.， 2009）、擬南芥74個（Ulker et al.， 2004）、水稻97個（Xu et al.， 2016）。同時，WRKY作為轉錄因子已經被證明調控植物多重生理功能（Eulgem et al.， 2000）。有研究發現，WRKY轉錄因子參與植物對干旱、高溫、低溫等非生物脅迫的應答反應（Chen et al.， 2012）以及植物對病原菌的抗性（Sham et al.， 2017），如水稻OsWRKY13參與抵抗水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的感染（Schluttenhofer & Yuan， 2014），AtWRKY8在鹽脅迫下表達出現增加，進而增強植株對鹽脅迫的抗性（Chen et al.， 2013）;WRKY轉錄因子與植物的生長發育（Chen et al.， 2019）和代謝產物生物的合成（Zhang et al.， 2018;Liu et al.， 2019）密切相關，但在小立碗蘚中，WRKY是否參與防御反應及其作用機制卻鮮有報道。隨著生物技術、計算機技術與大數據的迅猛發展 （Pearson， 2001），人們對于未知領域的研究也不斷加強。生物信息學技術作為一門新興的時尚學科，結合計算機數據收集與分析，不斷探索未知基因的結構與功能，使得預測結果逐漸具有說服力，為科學研究做出了很大貢獻，這一技術廣泛應用于蛋白分析、基因結構預測等眾多領域。因此，本文通過生物信息學分析研究WRKY基因家族成員的基本信息、保守結構域分析、染色體定位、內外顯子分布等信息，旨在為后續研究小立碗蘚WRKY蛋白的結構與功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Bio-linux操作系統;虛擬機virtual Box;各種數據庫，即Pfam（http：//pfam.xfam.org/）、Ensembl Plants （Bolseret al.， 2017）（http：//plants.ensembl.org/index.html）、phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）;在線構圖工具及可視化軟件，即Adobe illustrator、TBtools等。

1.2 小立碗蘚WRKY基因家族的確定

在Pfam數據庫下載WRKY蛋白保守結構域（*.hmm）文件，在Ensembl Plants數據庫中下載小立碗蘚基因組的cds、cdna、pep、gff3等序列作為備用文件。

在小立碗蘚蛋白質數據庫檢索含有WRKY（PF03106）基因家族結構域的蛋白質序列（李昊陽等，2014），通過E值初篩，再用SMART 網站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進行手動篩選，最終結果用于后續研究。

1.3 小立碗蘚WRKY基因家族成員的理化性質分析與亞細胞定位

由ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/protparam-doc.html）網站預測家族成員的等電點（PI）、相對分子質量、氨基酸長度、蛋白質疏水性等性質;通過PLOC（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）、Plant-mPLOC（植物細胞定位）預測家族成員在細胞中的位置分布。

1.4 小立碗蘚WRKY基因家族成員蛋白的二級結構分析

將確定的小立碗蘚WRKY基因家族蛋白質的氨基酸序列通過在線網站HNN Secondary Structure Prediction（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預測其二級結構各構型的占比。

1.5 小立碗蘚WRKY基因家族成員系統發育樹的構建

利用MEGA 7.0軟件進行進化樹構建，程序選用最大似然法，Bootstrap值設定為 1 000，其他設定參數以系統默認值為準。

1.6 小立碗蘚WRKY基因家族成員內外顯子及保守結構域分析

由MEME在線網（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/），預測蛋白質的保守結構域的motif模型信息。通過http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/網站繪制小立碗蘚WRKY基因家族成員的內外顯子分布圖，由AI軟件合并繪圖。

1.7 小立碗蘚WRKY基因家族成員的染色體定位圖

將WRKY蛋白所對應的氨基酸序列及成員在小立碗蘚基因組中對應的名稱文件、小立碗蘚27條染色體的長度信息;由http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/在線網站繪制染色體定位圖，通過TBtools工具進行可視化修飾。

2 結果與分析

2.1 小立碗蘚WRKY基因家族成員的確定

通過對38個WRKY家族成員的保守結構域序列比對將WRKY家族成員主要分為以下幾類：Ⅰ類（3個基因）、Ⅱa（5個基因）、Ⅱb（6個基因）、Ⅱc（5個基因）、Ⅱd（13個基因）、Ⅱe（6個基因）、不含第三類（C2HC型），其中部分基因的保守結構域序列發生變異（表1）。

2.2 小立碗蘚WRKY基因家族成員理化性質分析及亞細胞定位

由表2可知，整個家族成員的氨基酸序列長度在216～775 aa之間，PpWRKY25最小，PpWRKY10最大。WRKY蛋白氨基酸的理論等電點PI值在5.10～9.79之間，蛋白質的相對分子質量在24.5～82.8 kDa之間，與氨基酸數量成正比。另外，通過蛋白質疏水性數值可以得到PpWRKY25、PpWRKY30、PpWRKY36既具有疏水性又有親水性，其數值在-0.5～+0.5之間。負值越大說明親水性越強，其他氨基酸都為親水氨基酸。PLOC亞細胞定位結果表明小立碗蘚WRKY蛋白全部分布在細胞核中。

2.3 小立碗蘚WRKY基因家族成員二級結構預測

由表3可知，小立碗蘚WRKY基因家族成員

的蛋白質由四種結構元件構成（α-螺旋、延伸鏈、β-轉角、無規卷曲），其中以無規卷曲為主要構成元件，最高為PpWRKY19，占比達73.83%，其次是α-螺旋;而PpWRKY11結果與家族成員不同，以 α-螺旋為主，占比高達42.34%，無規卷曲為39.74%。另外兩種構成元件占比均較小，比較穩定。

2.4 小立碗蘚WRKY基因家族成員系統進化關系分析

從圖1小立碗蘚WRKY基因家族成員的進化樹分析可以看出，WRKY基因家族成員在進化的過程中已經發生了改變，38個基因分布在不同的五個分支上（分別含有Ⅰ型基因3個、Ⅱa型基因5個、Ⅱb型基因6個、Ⅱc型基因5個、Ⅱd型基因13個、Ⅱe型6個）。從進化樹還可以看出，小立碗蘚與擬南芥在進化上具有一定的差異性，其中的Ⅱa、Ⅱd并未聚集在同一分支，說明植物由低等向高等進化的過程中基因的進化方式發生了改變，出現了分化。

2.5 小立碗蘚WRKY基因家族成員內外顯子分布及結構域分析

小立碗蘚WRKY家族成員主要分布在幾個不同的分支，在進化上既具有差異性又具有相似性。由圖2：B可知，小立碗蘚WRKY基因家族成員內外顯子分布圖，外顯子的個數為3～7個。其中，Ⅰ型有4～6個外顯子、Ⅱa與Ⅱe型外顯子4個、Ⅱb型含外顯子3～7個、Ⅱc型外顯子3個、大多數Ⅱd型含有外顯子3個。內含子的長度可以通過圖下比例尺推斷得到。由圖2：C可知，不同WRKY基因所對應的蛋白結構域共有10個motif，不同基因對應的motif也有所不同。由表4可知，每個motif的寬度、E-value值、對應motif的Logo圖;氨基酸寬度最大為50，最低僅有21。這38個家族成員中約有50%具有兩個保守結構域，最多含有四個;而Ⅱa（PpWRKY7、PpWRKY8、PpWRKY14、PpWRKY35）都只含有一個motif 5的保守結構域，并未形成穩定的motif 1-motif 3的穩定結構。

2.6 小立碗蘚WRKY基因家族成員的染色體分布

由圖3可知，通過分析最終將38個WRKY基因定位在小立碗蘚27條染色體中的21條，Ⅰ型（PpWRKY3、PpWRKY5、PpWRKY19）分布于第8、第3、第2號染色體;Ⅱa型（PpWRKY35、PpWRKY31、PpWRKY8、PpWRKY7、PpWRKY14）分布于第14、第4、第27、第6、第5號染色體;Ⅱb型（PpWRKY36、PpWRKY30、PpWRKY2、PpWRKY6、PpWRKY37、PpWRKY26）分布于第11、第7、第13、第3、第12、第4號染色體;Ⅱc型（PpWRKY34、PpWRKY9、PpWRKY33、PpWRKY24、PpWRKY28）分布于第20、第24、第23、第3、第13號染色體;Ⅱd型（PpWRKY29、PpWRKY22、PpWRKY25、PpWRKY38、PpWRKY16、 PpWRKY10、 PpWRKY23、 PpWRKY21、PpWRKY27、PpWRKY13、PpWRKY18、PpWRKY20、PpWRKY12）分布于第2、第11、第11、第26、第3、第8、第3、第19、第22、第21、第2、第7、第11號染色體;Ⅱe（PpWRKY15、PpWRKY4、PpWRKY17、PpWRKY1、PpWRKY11、PpWRKY32）分布于第2、第1、第17、第14、第7、第2號染色體。同一類型Ⅱd中PpWRKY29與PpWRKY18、PpWRKY22與PpWRKY25分別分布同一染色體上;Ⅱe中PpWRKY15與PpWRKY32分布于同一染色體上，其他基因在染色體上呈現出明顯的非均勻分布，所有基因在染色體上并未形成基因簇（Bai et al.， 2002）。

3 討論與結論

本研究通過生物信息學分析鑒定小立碗蘚WRKY基因家族共包含38個基因，與擬南芥比較可以發現，在植物從早期水生到陸生、低等到高等進化過程中，WRKY基因是不斷擴張豐富的，也意味著該家族有新功能的引入。根據WRKY結構域和鋅指結構將小立碗蘚WRKY家族分成兩大類（Ⅰ型3個、Ⅱa型5個、Ⅱb型6個、Ⅱc型5個、Ⅱd型13個、Ⅱe型6個， 不含Ⅲ型）;而在高等模式植物擬南芥中含Ⅲ型基因14個（Ulker et al.， 2004）、秈稻含有47個（Ross et al.， 2007），且在高等植物中幾乎所有的Ⅲ類WRKY因子都參與生物脅迫反應，而低等植物不含第Ⅲ類WRKY因子（蘇琦等， 2007）。本實驗室前期轉錄組數據顯示，小立碗蘚在接種灰霉菌的過程中PpWRKY10出現表達量的上調，說明WRKY轉錄因子參與了植物對灰霉菌的防御反應（實驗數據未發表），但關于具體的防御機制仍有待深入研究。進化分析表明Ⅰ型被認為是Ⅱ型與Ⅲ型的原始祖先，Ⅱ型與Ⅲ型是通過Ⅰ型C末端或N末端 WRKY結構域的變化或缺失演變而來（Zhang et al.， 2005），說明植物由低等向高等進化的過程中對環境的適應能力不同最終可能導致進化的類型不同，高等植物WRKY家族中的Ⅲ型可能由Ⅰ型在應對環境壓力過程中產生，表明WRKY基因家族在進化過程中具有多樣性，基因功能不斷進化。

通過結構分析發現，小立碗蘚部分Ⅱ型WRKY基因保守結構域發生變異， 主要涉及WKKYGNK、WRKYGHK、WRKYGQN三種變異類型。張凡等（2018）研究表明，WRKY 家族保守結構域大都是‘Q’突變為‘E’‘K’或‘S’，這些變異會導致WRKY蛋白與DNA結合的活性減弱，并且不同變異類型對植株的功能影響也不相同。水稻OSWRKY45中‘Q’變異為‘K’后，其表達量在植株不同部位均出現了上調表達，并且在干旱脅迫下轉基因的植株表現出更好的恢復力，過表達OSWRKY45植株的抗病與抗旱能力顯著提高（Qiu & Yu， 2009）。但是，在小立碗蘚中出現了由‘Q’突變為‘H’的不同變異類型，結合實驗室前期數據植株在接種灰霉菌后突變基因并未上調表達，可能突變基因并未參與生物脅迫反應，是否參與非生物脅迫目前尚未見有報道。本研究結果為后續深入研究其基因功能提供了方向。對WRKY家族保守結構域的motif模型分析發現，家族成員中出現motif的缺失，并未全部形成motif 1-motif 3的穩定結構，解釋了由單個保守結構域構成的Ⅱa型WRKY保守結構域部分發生突變的原因，表明物種可能在變異中不斷獲得進化。蛋白質的二級結構除PpWRKY11以α-螺旋為主要構成元件外，其他基因均以無規卷曲（占比達70%）為主要構成元件，且蛋白全分布于細胞核中。染色體定位顯示，38個基因分散分布于小立碗蘚的21條染色體上，呈現明顯的不規則分布;毛果楊中86個WRKY家族基因在染色體上也呈現不規則分布（He et al.， 2012）。

從進化關系圖來看，WRKY家族的聚類與分析一致，結構上WRKY蛋白保守程度較高，但也存在變異的情況，說明小立碗蘚WRKY轉錄因子在進化過程中具有多樣性。其中，結構域突變基因除了Ppwrky25沒聚在一起外，其他均聚合在同一分支上，說明這些轉錄因子可能具有相似的功能，此現象同樣出現在土豆WRKY轉錄因子中（Liu et al.， 2017）。

WRKY基因在植物生長發育及抗逆境脅迫中具有重要意義，一直是研究的熱點問題，但在小立碗蘚中WRKY基因的研究較少。本文在基因水平上對WRKY基因展開研究，為后續深入研究WRKY蛋白的結構與功能奠定了基礎。

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（責任編輯 蔣巧媛）

收稿日期：? 2020-11-28

基金項目：? 國家自然科學基金（31260426，31560508） [Supported by? National Natural Science Foundation of China（31260426， 31560508）]。

第一作者： 喬剛（1992-），碩士研究生，主要從事植物分子生物學研究，（E-mail）2335603452@qq.com。

*通信作者：? 姜山，博士，教授，研究方向為植物病理學，（E-mail）kyosan200312@hotmail.com。

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