斑地錦RT-qPCR內參基因的篩選

宋美玲 黃勝和 陳祖杰 鄒嘉軒 劉歡勝 全文軍

摘 要：? 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）的前提條件之一是具有合適的內參基因。為篩選斑地錦（Euphorbia maculata）合適的RT-qPCR內參基因，該文利用同源克隆法克隆斑地錦GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP等基因片段，RT-qPCR檢測7個候選內參基因在斑地錦不同生長期根、莖、葉和果實中的表達情況，并用geNorm、NormFinder和BestKeeper等生物學軟件對各候選基因表達穩定性進行評價。結果表明：（1）克隆的GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP基因片段為729、808、753、422、233、656、313 bp，分別編碼242、269、250、140、77、218、103個氨基酸，與其他植物相應氨基酸序列的最高同源性均在85%以上。（2）綜合3個分析軟件分析內參基因表達穩定性得出，表達穩定性排名為UBQ>EF-1α>TUB-α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act。因此，可以選取UBQ作為斑地錦RT-qPCR分析的內參基因，用于不同生長期基因組織特異性表達研究。

關鍵詞： 斑地錦， 基因克隆， 內參基因， RT-qPCR

中圖分類號：? Q943; R286.12

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2022）02-0340-09

Screening of reference genes for RT-qPCR

in Euphorbia maculata

SONG Meiling1， HUANG Shenghe1*， CHEN Zujie2，

ZOU Jiaxuan3， LIU Huansheng3， QUAN Wenjun3

（ 1. Department of Basic Medicine， Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 344000， Jiangxi， China; 2. Jiangxi Medical College，

Nanchang University， Nanchang 330031， China; 3. Fuzhou Medical College， Nanchang University， Fuzhou 344000， Jiangxi， China ）

Abstract：? The suitable reference genes is a prerequisite for real-time quantitative PCR （RT-qPCR）. In order to find a suitable reference gene for gene expression analysis using RT-qPCR in Euphorbia maculata， GAPDH， EF-1α， act， UBQ， TUB-α， eIF-4A， and CYP gene fragments from roots， stems， leaves and fruits at different growth stages were cloned with the method of homologous cloning. Subsequently， the expression patterns of the seven candidate reference genes were obtained by RT-qPCR in E. maculata， and the expression stability was assessed by geNorm， NormFinder， and BestKeeper. The results were as follows： （1） The fragment sequences of GAPDH， EF-1α， act， UBQ， TUB-α， eIF-4A and CYP contained 729 bp （encoding 242 amino acids）， 808 bp （encoding 269 amino acids）， 753 bp （encoding 250 amino acids）， 422 bp （encoding 140 amino acids）， 233 bp （encoding 77 amino acids）， 656 bp （encoding 218 amino acids）， and 313 bp （encoding 103 amino acids）， respectively. And the seven amino acid sequences shared over 85% identity with other GAPDH， EF-1α， act， UBQ， TUB-α， eIF-4A， CYP by BlAST in GenBank. （2） The order of expression stability was UBQ>EF-1α>TUB-α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act by geNorm， NormFinder， and BestKeeper. Therefore， UBQ can be selected as a reference gene for RT-qPCR in E. maculata using for gene expression analysis in different plant tissues at different growth stages.

Key words： Euphorbia maculata， gene cloning， reference genes， RT-qPCR

地錦草藥材為大戟科大戟屬一年生草本植物地錦（Euphorbia humifusa）或斑地錦（E. maculata）的干燥全草，又名鬼見愁、血筋草、奶汁草等，分布于中國江蘇、江西、浙江、湖北、河南、河北、新疆和內蒙古等地（中國科學院中國植物志編輯委員會，1997），是中醫、維醫、蒙醫常用藥材，具有清熱解毒、涼血止血、利濕退黃等功效，主治痢疾、泄瀉、咯血、尿血、便血、崩漏、瘡癤癰腫、濕熱黃疸等（國家藥典委員會，2015），目前已開發有腸炎寧片、三七止血片、瀉痢寧片等中成藥。斑地錦主要含有黃酮類、萜類、酚酸類和生物堿類等成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、止血、免疫調節等作用（柳潤輝等，2001;安惠霞等，2008）。目前，斑地錦研究多聚焦在質量標準控制、藥理學作用、化學成分的提取及鑒定等方面（胡建新等，2018;Tian et al.， 2019），分子生物學相關研究報道較少。

實時熒光定量PCR是在普通PCR的基礎上引入熒光基團，通過相應的熒光信號積聚實時監測整個反應的進程，為未知序列進行定量分析的方法，其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確（張玉芳等，2014;Wang et al.， 2019），已經成為分子生物學中研究基因表達的重要工具之一，而使用合適的內參基因是獲得可信定量結果的前提（Shakeel et al.， 2018）。在實際應用中，RNA提取、cDNA合成及PCR擴增效率等因素會直接影響實驗結果，因此常用表達穩定的內參基因進行校正和標準化（Bustin， 2002），以減少樣品之間和樣品內部的誤差。最近研究結果表明，內參基因不存在絕對通用性，若不經篩選而以一種基因作為任何條件下的內參，得到的結果精確度大幅度降低，甚至錯誤（Zhu et al.， 2019）。另外，單一傳統的內參基因有時會對結果精確性產生影響，新內參基因將逐漸取代某些表達穩定性差的傳統管家基因（Nguyen et al.， 2018），或應用內參基因組合有效地減少基因表達誤差（袁偉等，2012），以獲得更準確的分析結果。同時，基于基因芯片技術和基因表達數據庫的篩選（Liang et al.， 2018），也將有助于獲得更可靠的內參基因。因此，在分析目標基因表達之前，有必要對候選內參基因進行篩選與評估，而評價內參基因表達穩定性的軟件較多，其中geNorm、NormFinder和BestKeeper應用較為廣泛（Kiarash et al.， 2018;Zhong et al.， 2019）。目前，常用的內參基因有act（actin）、GAPDH（glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase）、EF-1α（elongation factor-1 alpha）、UBQ（ubiquitin）、TUB-α（tubulin alpha）、eIF-4A（eukaryotic translation initiation factor 4A）、CYP（cyclophilin）、18S rRNA（18S ribosomal RNA）等（Haller et al.， 2004;Kozera & Rapacz， 2013）。為篩選斑地錦合適的RT-qPCR內參基因，本研究同源克隆斑地錦GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP等7個候選內參基因片段，RT-qPCR檢測在斑地錦不同生長期（苗期、花期、果期）根、莖、葉和果實中的表達情況，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper等軟件對各候選基因表達穩定性進行評價，為斑地錦不同生長期基因組織特異性表達研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

斑地錦種子由江西天施康生態中藥種植有限公司惠贈，種植于南昌大學撫州醫學院實驗田，經江西中醫藥高等專科學校藥學系中藥教研室鑒定為斑地錦。分別采集種植70 d后的苗期（未開花）、花期（開3朵以上的花且未結果）的根、莖、葉，以及果期（結3個以上的果）的根、莖、葉、果，每個樣品皆為3株以上的混合樣品，采集后立即置于-80 ℃冰箱備用。

1.2 主要試劑與儀器

植物總RNA提取試劑盒（Spin Column Plant Total RNA Purification Kit）、膠回收試劑盒（SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit）、引物合成、測序等，生工生物工程（上海）股份有限公司;反轉錄試劑盒（PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser）、熒光定量PCR試劑（PrimeScriptTM RT Master Mix）等，購于寶生物工程（大連）有限公司;Pfu酶（TransStart FastPfu DNA Polymerase）、Taq酶、T-載體（pEASY-Blunt Simple Cloning Kit），購于北京全式金生物技術有限公司。

普通PCR儀（T100TM Thermal Cycler）、熒光定量PCR儀（CFX96 Real-Time）等，美國Bio-Rad公司;超微量分光光度計（NanoDrop One），美國Thermo Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA的提取和cDNA的合成 斑地錦不同生長期根、莖、葉、果實總RNA的提取和cDNA的合成皆參照試劑盒說明書操作。總RNA提取后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量，并用超微量分光光度計測定RNA濃度，以保證后續實驗的進行。

1.3.2 引物設計 在GenBank中查詢相關序列，尤其是同科植物蓖麻（Ricinus communis）、麻瘋樹（Jatropha curcas）和橡膠樹（Hevea brasiliensis）等的GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP的基因序列，比對找出高度保守區段，分別設計克隆斑地錦相關基因的簡并引物。后續根據測序結果，利用Primer Premier 5.0 軟件分別設計RT-qPCR引物。本實驗所用引物見表1。

1.3.3 候選內參基因片段的克隆與分析 PCR反應體系（25 μL）：5×GC Buffer 5 μL，dNTPs（各2.5 mmol·L-1）2.5 μL，簡并引物F（10 μmol·L-1）、R（10 μmol·L-1）各1 μL，cDNA模板1 μL，Pfu酶（5 U·μL-1）0.3 μL，滅菌ddH2O 14.2 μL。擴增條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，相應退火溫度30 s，72 ℃ 60 s，30個循環;72 ℃ 5 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，目的片段的回收純化按照試劑盒操作說明進行。將回收的DNA片段連接T-載體后轉化大腸桿菌DH5α，菌液PCR鑒定陽性克隆，送測序。所得序列在GenBank中進行BLAST比對。

1.3.4 RT-qPCR引物檢測與熔解曲線分析 為檢驗引物特異性，排除引物二聚體及非特異性擴增產物對結果的影響，用相應引物qF、qR進行普通PCR，然后進行RT-qPCR，再加熱RT-qPCR產物從65 ℃到95 ℃，每隔0.5 ℃停留5 s檢測1次熒光強度以獲取熔解曲線。RT-qPCR反應體系（20 μL）：2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，引物qF（10 μmol·L-1）、qR（10 μmol·L-1）各0.4 μL，cDNA模板2 μL，滅菌ddH2O 7.2 μL;擴增條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，相應退火溫度30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。

1.3.5 候選內參基因的篩選 分別將樣品總RNA的反轉錄產物cDNA作為模板，進行RT-qPCR擴增，geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件對3個候選內參基因表達穩定性進行評估。將Ct值轉化為相對表達量（吳建陽等，2017），按照公式Q=2（Ct min- Ct sample）進行轉化，用于geNorm和NormFinder軟件分析，于BestKeeper軟件中直接輸入Ct值進行分析，最后進行綜合排名，得出最適合斑地錦不同生長期基因組織特異性表達研究的內參基因。

2 結果與分析

2.1 候選內參基因片段的克隆與分析

以總RNA反轉錄所得到的cDNA為模板，相應簡并引物F、R為引物進行PCR擴增，擴增產物大小符合預期（圖1）。對其測序后顯示，克隆的GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP基因片段分別為729、808、753、422、233、656、313 bp，分別編碼242、269、250、140、77、218、103個氨基酸。將氨基酸序列在GenBank中進行BLAST比對后，GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP分別與萵苣GAPDH（XP023733724）、蓖麻EF-1α（XP002518073）、荔枝act（ADV17460）、山梨獼猴桃UBQ（GFZ13847.1）、大麥TUB-α（CAB76917.1）、玉米eIF-4A（U17979.1）、油桐CYP（ARV78452.1）的同源性為95%、99%、100%、99%、99%、87%、86%。將相應核苷酸序列登錄到GenBank，獲得登錄號EmGAPDH（MT044466）、EmEF-1α（MT044465）、Emactin（MT044464）、EmUBQ（MW815120）、EmeIF-4A（MW815119）、EmTUB-α（MW815118）、EmCYP（MW815117）。

2.2 RT-qPCR引物檢測與熔解曲線分析

用相應引物qF、qR進行普通PCR擴增，產物長度與預期一致（圖2）。將熒光定量RT-PCR 產物進行熔解曲線分析，各基因引物的熔解曲線均顯示為單峰（圖3）。以上結果表明，本實驗所設計定量引物無引物二聚體及非特異性擴增，可用于后續的RT-qPCR分析。

2.3 候選內參基因的Ct值分析

對斑地錦不同生長期各組織（根、莖、葉和果）的cDNA樣品進行RT-qPCR擴增，運用Ct值評估各內參基因的表達量，Ct值與其表達量成反比，即Ct值越小，表達量越高。內參基因的表達值排序為EF-1α>TUB-α>eIF-4A>UBQ>CYP>GAPDH>act，Ct值分別為17.04～19.55、18.52～21.81、18.58～22.04、20.19～22.90、20.63～24.99、21.85～24.95、24.44～29.26（圖4）。3次重復之間各內參基因的表達量變動較小，且表達量都有所變化。

2.4 候選內參基因表達穩定性分析

2.4.1 geNorm軟件分析 geNorm軟件通過計算穩定系數M來分析基因表達穩定性，M值越小，穩定性越好。除act外，6個候選內參基因在不同組織中表達的M值都小于1.5，穩定性排名為UBQ>TUB-α>EF-1α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act（表2）。

2.4.2 NormFinder軟件分析 與geNorm類似，NormFinder軟件也是通過各候選內參基因的M值評估其表達穩定性。經NormFinder軟件分析，7個內參基因在各組織中的表達穩定程度存在差異，按M 值大小排序為UBQ>TUB-α>EF-1α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act（表3）。UBQ的M值最低，總體穩定性最好。

2.4.3 BestKeeper軟件分析 BestKeeper直接根據各基因的Ct值，計算標準偏差（standard deviation，SD）和變異系數（coefficient of variation，CV）來評估各內參基因的穩定性。一般來說，穩定的內參基因具有較小的SD值和CV值。BestKeeper分析的基因表達穩定性排名為EF-1α>UBQ>eIF-4A>GAPDH>TUB-α>CYP>act（表4）。其中，EF-1α、UBQ、eIF-4A的SD值和CV值比較相近，表達都相對穩定。

2.4.4 綜合分析 由于各內參基因在3個軟件中的排序略有差異，故運用幾何平均值算法進行各候選內參基因的綜合排名，內參基因幾何平均值越低，則其穩定性越好。各內參基因在斑地錦不同生長期的不同組織中表達穩定性綜合排名為UBQ>EF-1α>TUB-α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act（表5）。

3 討論與結論

地錦草是中醫、維醫、蒙醫常用藥材，主要含有黃酮類、萜類、酚酸類和生物堿類等，其中槲皮素含量作為其質量標準，目前，斑地錦的分子生物學相關報道較少。本研究首次克隆了斑地錦GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP等常用的傳統內參基因片段，并作為候選內參基因進行RT-qPCR，分別用geNorm、NormFinder和BestKeeper評價在各生長期（苗期、花期、果期）根、莖、葉和果實中的表達穩定性。本實驗中，各候選內參基因在不同生長期各組織中的表達豐度除act外都較高，Ct值皆在25以下，符合要求。由于3個評估軟件采用不同統計學算法，分析結果通常存在差異，需要綜合分析得到最適合的內參基因（Kiarash et al.， 2018;Zhong et al.， 2019），其中geNorm和NormFinder的分析結果較為一致，UBQ、TUB-α、EF-1α、eIF-4A、GAPDH的M值都小于1，比較穩定，最佳內參基因為UBQ，而BestKeeper評價結果與前二者略有差異，EF-1α、UBQ、eIF-4A、GAPDH的SD值小于1，該軟件篩選的最優內參基因為EF-1α，而UBQ和eIF-4A表達也比較穩定，與EF-1α并無明顯差異。UBQ是泛素蛋白，與蛋白質調節系統有關，參與細胞代謝過程，UBQ是常用的內參基因，在許多植物中得到應用，例如分析芍藥花瓣不同發育時期和不同組織的基因表達時可選用UBQ作為內參基因（李健，2017）。EF-1α是轉錄延伸因子α亞基基因， 在真核生物中參與轉錄控制、凋亡以及信號轉導等一系列重要的生命活動過程，也是較為常用的內參基因，在朱頂紅不同組織中表達較穩定（劉曉婷等，2018）。GAPDH、act、TUB-α、eIF-4A、CYP等不是斑地錦各生長期不同組織RT-qPCR的合適內參基因，但在其他一些植物中可能穩定表達，這也證明在不同植物或不同實驗條件下進行RT-qPCR有必要對內參基因進行篩選與評估（Kozera & Rapacz， 2013）。因此，若研究斑地錦不同生長期基因組織特異性表達時，可以選取UBQ作為內參基因，如果選擇內參基因組合，則UBQ和EF-1α較為合適。此結果為后續斑地錦分子生物學相關研究提供了便利條件。當然，隨著斑地錦基因發掘和表達研究的深入，不排除會出現更穩定的內參基因。

參考文獻：

AN HX， LI ZJ， GULINA D， et al.， 2008. Research advance of the uighur medicine Dijincao [J]. Lishizhen Med Mat Med Res， 19（12）： 2866-2868.? [安惠霞， 李治建， 古麗娜·達吾提， 等， 2008. 地錦草的研究進展 [J]. 時珍國醫國藥， 19（12）： 2866-2868.]

BUSTIN S， 2002. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR RT-PCR： trends and problems [J]. J Mol Endocrinol， 29（1）： 23-29.

Chinese Pharmacopoeia Commission， 2015. The Pharmacopoeia of the People’s Republic of China （Vol. I）? [M]. Beijing： China Medical Science Press：127.? [國家藥典委員會， 2015. 中華人民共和國藥典（一部） [M]. 北京： 中國醫藥科技出版社： 127.]

Delectis Florae Reipublicae Popularis Sinicae Agendae Academiae Sinicae Edita， 1997. Flora Reipublicae Popularis Sinicae （Vol. 3）? [M]. Beijing： Science Press， 44： 49-50.? [中國科學院中國植物志編輯委員會， 1997. 中國植物志（第三分冊）? [M]. 北京： 科學出版社， 44： 49-50.]

HALLER F， KULLE B， SCHWAGER S， et al.， 2004. Equivalence test in quantitative reverse transcription polymerase suitable for normalization chain reaction： Confirmation of reference genes [J]. Anal Biochem， 335（1）： 1-9.

HU JX， XI XT， WANG XM， et al.， 2018. Mechanism of Humifuse euphorbia in regulating tumor angiogenesis by NF-κB/VEGF signal pathway [J]. Chin J Exp Trad Med Form， 24（20）： 167-172.? [胡建新， 席曉甜， 王曉敏， 等， 2018. 地錦草調控NF-κB/VEGF信號通路抑制腫瘤血管生成的機制 [J]. 中國實驗方劑學雜志， 24（20）： 167-172.]

KIARASH JG， WILDE HD， AMIRMAHANI F， et al.， 2018. Selection and validation of reference genes for normalization of RT-qPCR gene expression in wheat （Triticum durum L.） under drought and salt stresses [J]. J Genet， 97（5）： 1433-1444.

KOZERA B， RAPACZ M， 2013. Reference genes in real-time PCR [J]. J Appl Genet， 54（4）： 391-406.

LI J， 2017. Selection and validation of reference genes for quantitative real-time PCR in herbaceous peony [J]. Mol Plant Breed， 15（7）： 2544-2549.? [李健， 2017. 芍藥實時定量PCR內參基因的篩選和驗證 [J]. 分子植物育種， 15（7）： 2544-2549.]

LIANG WX， ZOU XX， CARBALLAR-LEJARAZU R， et al.， 2018. Selection and evaluation of reference genes for RT-qPCR analysis in Euscaphiskonishii Hayata based on transcriptome data [J]. Plant Methods， 14（1）： 42.

LIU RH， WANG HB， KONG LY， 2001. Studies on chemical constituents of Euphorbia humifusa [J]. Chin Trad Herb Drugs， 32（2）： 107-108.? [柳潤輝， 王漢波， 孔令義， 2001. 地錦草化學成分的研究 [J]. 中草藥， 32（2）： 107-108.]

LIU XT， WANG SL， XUE JQ， et al.， 2018. Selection of reference genes for quantitative real-Time PCR in different tissue and organ of barbadoslily [J]. Acta Hortic Sin， 45（5）： 919-930.? [劉曉婷， 王順利， 薛璟祺， 等， 2018. 朱頂紅實時熒光定量PCR中不同組織器官內參基因的篩選 [J]. 園藝學報， 45（5）： 919-930.]

NGUYEN N， SUOKAS M， KARPPINEN K， et al.， 2018. Recognition of candidate transcription factors related to bilberry fruit ripening by de novo transcriptome and RT-qPCR analyses [J]. Sci Rep， 8（1）： 1-12.

SHAKEEL M， RODRIGUEZ A， TAHIR UB， et al.， 2018. Gene expression studies of reference genes for quantitative real-time PCR： an overview in insects [J]. Biotechnol Lett， 40（2）： 227-236.

TIAN S， WEN E， MI N， et al.， 2019. Determination of three active components in Euphorbia humifusa Will. U dsing high-performance liquid chromatography with diode-array detection and autophagy and apoptosis analysis of normal rat kidney and HeLa cells [J]. Pharmacogn Mag， 15（61）： 348.

WANG YZ， DAI MS， CAI DY， et al.， 2019. Screening for quantitative real-time PCR reference genes with high stable expression using the mRNA-sequencing data for pear [J]. Tree Genet Genom， 15（4）： 54.

WU JY， HE B， DU YJ， et al.， 2017. Analysis method of systematically evaluating stability of reference genes using geNorm，NormFinder and BestKeeper [J]. Mod Agric Sci Technol， （5）： 278-281.? [吳建陽， 何冰， 杜玉潔， 等， 2017. 利用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件進行內參基因穩定性分析的方法 [J]. 現代農業科技， （5）： 278-281.]

YUAN W， WAN HJ， YANG YJ， 2012. Characterization and selection of reference genes for real-time quantitative RT-PCR of plants [J]. Chin Bull Bot， 47（4）： 427-436.? [袁偉， 萬紅建， 楊悅儉， 2012. 植物實時熒光定量PCR內參基因的特點及選擇 [J]. 植物學報， 47（4）： 427-436.]

ZHANG YF， ZHAO LJ， ZENG YL， 2014. Selection and application of reference genes for gene expression studies [J]. Plant Physiol J， 50（8）： 1119-1125.? [張玉芳， 趙麗娟， 曾幼玲， 2014. 基因表達研究中內參基因的選擇與應用 [J]. 植物生理學報， 50（8）： 1119-1125.]

ZHONG SL， ZHOU SY， YANG SJ， et al.， 2019. Identification of internal control genes for circular RNAs [J]. Biotechnol Lett， 41（10）： 1111-1119.

ZHU LF， YANG CQ， YOU YH， et al.， 2019. Validation of reference genes for RT-qPCR analysis in peel and flesh of six apple cultivars （Malus domestica） at diverse stages of fruit development [J]. Sci Hortic， 244： 165-171.

（責任編輯 李 莉）

收稿日期：? 2021-04-19

基金項目：? 江西省教育廳科學技術研究項目（GJJ191230） [Supported by Scientific and Technological Research Program of Jiangxi Education Department （GJJ191230）]。

第一作者： 宋美玲（1989-），碩士，講師，主要從事藥用植物生物技術研究，（E-mail）sml0703@163.com。

*通信作者：? 黃勝和，博士，副教授，主要從事藥用植物生物技術研究，（E-mail）hsh712@163.com。

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