苦蕎FtF5H基因克隆及表達分析

段迎 楊曉琳 蔡蘇云 賀潤麗 尹桂芳 王艷青 盧文潔 孫道旺 王莉花

摘 要：? 阿魏酸-5-羥基化酶（Ferulate 5-hydroxylase）是調控S型木質素合成的關鍵酶，為研究其在苦蕎木質素生物合成途徑中的分子機制，該文從苦蕎轉錄組數據中篩選獲得一個F5H基因，命名為FtF5H（GenBank登錄號：MW455111），采用生物信息學方法對苦蕎F5H蛋白的理化性質、信號肽、跨膜結構、亞細胞定位、親疏水性、蛋白質二級結構、蛋白質三級結構、氨基酸結構、系統進化樹等進行分析和預測，并運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術分析FtF5H基因在厚果殼苦蕎與薄果殼苦蕎的葉、花、莖、果殼中的差異表達。結果表明：（1）FtF5H基因序列包含1 395 bp的完整cDNA開放閱讀框，編碼464個氨基酸。（2）FtF5H蛋白具有P450超家族結構，為親水性穩定酸性蛋白，不具有跨膜結構域，且為非分泌性蛋白。（3）FtF5H蛋白的二級結構主要由α-螺旋和無規則卷曲組成，三級結構預測顯示FtF5H蛋白與5ylw.1.A的相似度較高。（4）系統進化分析顯示FtF5H屬于CYP84A亞家族。（5）qRT-PCR顯示FtF5H基因在兩種苦蕎中的不同部位均有表達，且在厚果殼苦蕎果殼中的表達量是薄果殼的5倍，表達具有極顯著差異。該研究為進一步研究苦蕎木質素合成的分子調控機制奠定了基礎，對苦蕎新品種的培育具有重要意義。

關鍵詞： 苦蕎， RT-PCR克隆， 阿魏酸-5-羥基化酶， 生物信息學分析， 基因表達

中圖分類號：? Q943

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2022）02-0304-11

Cloning and expression analysis of FtF5H gene from

tartary buckwheat? （Fagopyrum tataricum）

DUAN Ying1， YANG Xiaolin1， CAI Suyun1， HE Runli1*， YIN Guifang2，

WANG Yanqing2， LU Wenjie2， SUN Daowang2， WANG Lihua2

（ 1.? College of Traditional Chinese Medicine and Food Engineering， Shanxi University of Chinese Medicine， Taiyuan 030619， China; 2. Yunnan

Provincial Key Laboratory of Agricultural Biotechnology/ Key Laboratory of Southwestern Crop Gene Resources and Germplasm

Innovation， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Biotechnology and Germplasm Resources Institute，

Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650201， China ）

Abstract：? Ferulate 5-hydroxylase is a key enzyme that regulates the synthesis of S-type lignin. To study the molecular mechanism of ferulate 5-hydroxylase in lignin synthesis pathway of Fagopyrum tataricum， a FtF5H（GenBank accession number： MW455111） gene identified from F. tataricum RNA-seq data was screened and analyzed by bioinformatics methods including the physicochemical properties， signal peptide， transmembrane structure， subcellular localization， hydrophilicity， protein secondary structure and tertiary structure， amino acid structure， as well as phylogenetic tree. In addition， the real-time quantitative PCR （qRT-PCR） was applied to analyze the expression pattern of FtF5H gene in leaves， flowers， stems and husks of thick husk tartary buckwheat and thin husk tartary buckwheat. The results were as follows：? （1） FtF5H gene sequence included completed open reading frame with 1 395 bp， coding for 464 amino acids. （2） The FtF5H protein was predicted to have P450 superfamily structure， and FtF5H protein， a non-secretory protein， was a hydrophilic， stable and acidic protein without transmembrane domain. （3） The FtF5H protein secondary structure was predicted to be mainly composed of α-helix and random coil， and its prediction of tertiary structure showed a high similarity with 5ylw.1.A. （4） Phylogenetic analysis showed that FtF5H belonged to the CYP84A subfamily. （5） In addition， qRT-PCR showed that the FtF5H gene was expressed in different parts of the two kinds of tartary buckwheat， and the expression level in the thick husk tartary buckwheat was four times higher than that in the thin husk，with extremely significant differences. The research establish a foundation for further study on the molecular regulation mechanism of lignin synthesis in tartary buckwheat， and has important research significance for the cultivation of new tartary buckwheat varieties.

Key words： tartary buckwheat， RT-PCR cloning， ferulate 5-hydroxylase， bioinformatics analysis， gene expression

苦蕎（Fagopyrum tataricum）為藥食兩用作物，性味苦、平、寒，具益氣力、續精神、利耳目、降氣、寬腸健胃等作用，被譽為“五谷之王” “三降食品”（朱云輝和郭元新，2014）。栽培苦蕎通常果殼較厚，殼比率為20%～30%，果殼堅韌，脫殼率從2%到6%不等（Song et al.，2019），難以脫殼生產整粒苦蕎米，不易制得高蘆丁含量麩皮層全營養苦蕎米，一定程度上降低了苦蕎的活性物質與營養功效（陳慶富等，2015）;在苦蕎種子直接磨粉加工中會有少量殼粉混入，導致適口性下降，也限制了苦蕎產品的精深加工，嚴重影響苦蕎產業的發展。‘小米蕎’是我國云南、貴州等地的一種易脫殼地方品種，脫殼率最高達93%（Song et al.，2019），作為一種特殊資源，‘小米蕎’對研究苦蕎薄果殼特性的遺傳規律、功能基因、品種培育及加工生產等方面均具有重要的理論和現實意義。

F5H屬于細胞色素P450的單氧化物酶（Meyer et al.，1998），Meyer等人于1996年第一次從香楓中分離得到，是CYP84家族成員，具有重要的生物學功能，該基因能催化阿魏酸、松柏醇、松柏醛生成5-羥基阿魏酸、5-羥基松柏醇和5-羥基松柏醛，是調控S型木質素合成的關鍵酶（Humphreys & Chapple，2002）。目前，已經從擬南芥（Arabidopsis thaliana）（Franke et al.，2000）、當歸（Angelica sinensis）（溫隨超，2015）、毛白楊（Populus tomentosa）（陳雪等，2015）、亞麻（Linum usitatissimum）（王進，2009）、油菜（Brassica campestris）（李揚等，2013）等植物中克隆到F5H基因，但尚未發現F5H基因在苦蕎中被克隆的相關報道。

吳朝昕（2020）對厚果殼和薄果殼苦蕎的果殼成分研究發現，不同品種厚果殼苦蕎的果殼木質素平均含量均高于薄果殼苦蕎。課題組前期在‘云蕎1號’和‘小米蕎’雜交F2代群體中，對厚果殼和薄果殼進行轉錄組測序比較分析（數據未發表），發現木質素生物合成途徑大部分基因在苦蕎厚果殼的表達量高于薄果殼，推測苦蕎果殼厚可能由于積累了較多的木質素。轉錄組測序表明F5H基因在厚果殼的表達量顯著高于薄果殼。為研究F5H基因在苦蕎木質素合成中的作用，本研究采用RT-PCR法克隆‘云蕎1號’和‘小米蕎’的FtF5H基因，對其進行生物信息學分析、實時熒光定量PCR驗證，為進一步研究該基因功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

苦蕎厚果殼材料‘云蕎1號’為云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所選育品種，薄果殼材料‘小米蕎’為云南省地方品種。剝離‘云蕎1號’和‘小米蕎’不同發育期的果殼，將剝離的果殼分別混合在一起作為基因克隆的材料;實時熒光定量PCR分析用‘云蕎1號’、‘小米蕎’不同組織部位材料（結實期的葉、花、莖、果殼）。

1.2 RNA提取與cDNA第一鏈合成

根據Trizol提取試劑盒說明進行總RNA提取，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測所有樣品RNA的完整性。cDNA第一鏈合成：在0.2 mL PCR管中加入5 μL總RNA、1 μL 隨機引物、1 μL ddH2O，70 ℃溫浴5 min，冰浴2 min，離心加入2.0 μL 5 × First-Strand Buffer、0.5 μL 10 mmol·L-1 dNTP、0.25 μL Rnase inhibitor、0.25 μL Reverse Transcriptase，總體系10.0 μL，42 ℃溫浴60 min，72 ℃溫浴10 min。

1.3 FtF5H基因克隆

根據轉錄組測序獲得的阿魏酸-5-羥基化酶（FtF5H）基因的核苷酸序列設計4條特異引物（表1）。RT-PCR反應體系如下：cDNA模板1 μL、dNTPs（10 mmol·L-1）0.2 μL、2×GC BufferⅠ12.5 μL、 TaqDNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL、ddH2O 10.1 μL、F（10 μmol·L-1） 0.5 μL、R （10 μmol·L-1） 0.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共循環33次;72 ℃修復延伸7 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，把目的條帶切膠回收，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4 克隆基因的生物信息學分析

利用NCBI ORF finder在線程序及Conserved domains數據庫對測序獲得的cDNA序列進行開放閱讀框及保守功能結構域分析;通過ProtParam對蛋白理化性質進行分析;利用ProtScale對蛋白親疏水性進行分析;采用TMHMM Server v.2.0 分析編碼氨基酸的跨膜結構域;利用SignalP 5.0 Server 預測信號肽;利用NetPhos 3.1 Server進行磷酸化位點預測;利用Psort分析亞細胞定位情況;通過SOPMA及SWISS-MODEL預測蛋白的二級和三級結構;編碼蛋白多重序列比對采用DNAMAN軟件;Neighbor-joining系統進化樹用MEGA 6.0構建（陳媞穎等，2017）。

1.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

采用Trizol總RNA抽提試劑盒分別提取‘云蕎1號’和‘小米蕎’葉、花、莖、果殼8個組織的總RNA，反轉錄得到第一鏈cDNA，以其為模板進行qRT-PCR分析，每個樣品設3次技術重復。實時熒光定量PCR反應體系：10 μL 2 × SG Fast qPCR Master Mix、2 μL cDNA模板、上下引物各0.4 μL、ddH2O 7.2 μL。擴增程序：95 ℃ 3 min ，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環45次。以苦蕎H3（JF769134.1）為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算FtF5H的相對表達量，反應所用引物見表1。

2 結果與分析

2.1 苦蕎總RNA提取與FtF5H基因克隆

提取的總RNA經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射光下觀察RNA條帶清晰可見，亮度比在1∶1～2∶1之間，表明RNA基本未降解，可用于后續基因克隆。利用RT-PCR分別克隆獲得‘云蕎1號’和‘小米蕎’的F5H基因，產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳結果見圖1。對qRT-PCR產物進行測序拼接，結果發現‘云蕎1號’和‘小米蕎’的F5H基因核酸序列完全一致，且與轉錄組測序序列相同。ORF finder分析結果表明，2條基因序列均含有一個完整的長度為1 395 bp的開放閱讀框，編碼464個氨基酸，將該基因命名為FtF5H（GenBank登錄號：MW455111）。利用DNAMAN將核苷酸序列翻譯成氨基酸，如圖2所示。

2.2 FtF5H基因編碼蛋白的生物信息學分析

2.2.1 理化性質分析 利用ProtParam軟件對FtF5H蛋白理化性質進行預測，發現FtF5H蛋白分子式為C2346H3677N637O680S28，理論分子量52 583.54 Da，親水性平均系數（GRAVY）為-0.234，不穩定系數（Ⅱ）為36.57，為穩定蛋白，脂溶指數為82.65，負電荷殘基（Asp+Glu）63個，正電荷殘基（Arg+Lys）56個，理論等電點5.76，偏酸性，推測該蛋白為親水性穩定酸性蛋白。通過Conserved domains數據庫對FtF5H保守結構域進行分析，發現該蛋白有一個P450保守域，屬于P450超家族（圖3）。

通過ProtScale在線軟件，以Hphob./Kyte & Dodittle為標度，對苦蕎FtF5H蛋白質進行了分析，以氨基酸序列為橫坐標，氨基酸標度為縱坐標，親水性越強，則分值越小。FtF5H最高分值1.967出現在多肽鏈中的第256位氨基酸，該位點的氨基酸疏水性最強;最低分值-2.856出現在362位氨基酸，證明該位點的氨基酸親水性最強。NetPhos 3.1 Server預測顯示，FtF5H整條多肽鏈中分值在閾值0.5以上的氨基酸位點共有36個，其中絲氨酸（Ser）22個，蘇氨酸（Thr）13個，酪氨酸（Tyr）1個。這些位點可能發生磷酸化反應，從而對蛋白的活性與功能產生調控作用。

通過SignalP 5.0 Server在線軟件對苦蕎、芭蕾蘋果（XP 008372753.2）、白梨（AGR44939.1）、喜樹（AAT39511.1）、稻（BAF43423.1）、桃（XP 007203643.1）、柳枝稷（AFH89638.1）、歐洲甜櫻桃（XP 021802881.1）、藜麥（XP 021718110.1）及大葉藻（KMZ63113.1）10種植物的F5H基因的蛋白質信號肽進行預測比對，結果均不存在信號肽，為非分泌性蛋白（表2）。因此，推測F5H基因可能在游離核糖體上合成后不經蛋白轉運，直接在細胞質基質的特定部位中行使催化功能（張太奎等，2013）。利用Psort對該10種植物F5H蛋白進行亞細胞定位預測，發現除柳枝稷定位在細胞骨架外，其余均在葉綠體。基于F5H基因編碼蛋白的信號肽和亞細胞定位進行SPSS聚類分析，結果見圖4，雙子葉陸生植物桃、歐洲甜櫻桃、芭蕾蘋果、白梨、苦蕎、喜樹、藜麥聚為一支，稻、大葉藻聚為一支，柳枝稷單獨為一支，推測與F5H的作用機制有關。

TMHMM軟件預測顯示，苦蕎、柳枝稷、大葉藻不具有跨膜結構域。芭蕾蘋果、白梨、喜樹、稻、桃、歐洲甜櫻桃、藜麥均各含有1個跨膜結構域，說明植物種類不同，其F5H基因編碼蛋白質的跨膜區域存在情況不同。

2.2.2 FtF5H的結構預測 通過SOPMA對蛋白質的二級結構進行在線預測，發現FtF5H含有豐富的二級結構，無規則卷曲占36.21%，α-螺旋占46.12%，延伸鏈占12.28%，β-轉角占5.39%（圖5）。利用SWISS-MODEL對蛋白質的三級結構進行預測，結果見圖6：A。FtF5H蛋白第5位～455位氨基酸與數據庫目標蛋白5ylw.1.A的序列相似度為33.49%。QMEAN值是-2.83。GMQE（global model quality estimation，全球性模型質量估測）值為0.71，GMQE值在0～1之間，越接近1，建模質量越好，表明建模可信度高。結合芭蕾蘋果（XP 008372753.2）、白梨（AGR44939.1）、新疆梨（QHS84908.1）、喜樹（AAT39511.1）、葡萄（XP 002272644.1）、桃（XP 007203643.1）、扁桃（BBH07995.1）、紫苜蓿（ABB02161.1）、歐洲甜櫻桃（XP 021802881.1）的蛋白質三維結構骨架進行分析，發現該基因編碼的蛋白質具有典型的結構域，即含鐵原卟啉功能域（圖6：B）和錳離子功能域（圖6：C）（張太奎等，2015）。

2.2.3 氨基酸結構分析及系統進化樹構建 采用NCBI的BlastP在線程序，查找FtF5H的同源氨基酸序列，比對結果表明FtF5H氨基酸序列與GenBank中相關序列同源性在73.12%～77.42%之間。利用DNAMAN進行多重序列比對， 發現苦蕎FtF5H與參與比對植物的F5H氨基酸序列的相似性高達84.79%，含有血紅素結合結構域FxxGxxxCxG（圖7），其中保守的半胱氨酸充當血紅素鐵的第五個配體（Chapple，1998），證明FtF5H屬于P450家族。

運用MEGA 6.0軟件并采用鄰接法構建系統進化樹，結果顯示苦蕎FtF5H與藜麥的CYP84A1聚為一小簇，說明其同源性最高，相關研究報道擬南芥阿魏酸-5-羥化酶AtCYP84A1的表達與木質素生物合成的定量以及發育調控有關（Ruegger et al.，1999），本研究克隆得到的苦蕎FtF5H與擬南芥及其他植物的CYP84A1聚在一支（圖8），說明其可能與苦蕎木質素合成及調控有關（Zhang et al.，2019）。

2.2.4 FtF5H基因相對定量分析 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析FtF5H基因在厚果殼與薄果殼苦蕎不同器官的表達水平，結果發現FtF5H

基因在苦蕎不同器官的表達量不同， 在厚果殼‘云蕎1號’中的相對表達量由小到大依次為葉、花、莖、果殼，而在薄果殼‘小米蕎’中則是莖、果殼、花、葉。同一器官相比，除葉外，FtF5H在厚果殼‘云蕎1號’各個部位的表達量均高于薄果殼‘小米蕎’，且差異極顯著（圖9）。FtF5H在苦蕎厚果殼中的表達量是薄果殼的5倍，與前期轉錄組實驗結果基本一致。

3 討論與結論

苦蕎作為自然界中少見的藥食兩用作物，具有極高的藥用價值及營養功效。如何將薄果殼性狀轉入栽培品種，育成既易脫殼又高產優質的苦蕎新品種成為研究熱點。Song等（2019）對厚殼苦蕎和薄殼苦蕎纖維素和木質素含量變化與脫皮效率之間關系進行研究，結果表明隨著脫殼效率的降低（厚殼），木質素含量減少，纖維素含量增加;吳朝昕（2020）發現薄殼苦蕎果殼纖維素和木質素含量顯著低于厚殼苦蕎，二者研究結果不同。本課題組通過轉錄組測序發現木質素生物合成途徑大部分基因在苦蕎薄果殼表達量低于厚果殼。為了進一步探究苦蕎薄果殼形成的分子機制，本研究克隆了薄果殼和厚果殼的F5H基因，序列比對發現二者序列完全一致，且與轉錄組測序結果一致。

F5H是調控植物木質素合成的關鍵酶基因，在木質素形成過程中起重要作用，通過生物信息學分析，發現克隆的苦蕎F5H蛋白有一個P450保守域，屬于P450超家族，與石榴（馮立娟等，2018）、尾葉桉（肖玉菲等，2018）、毛白楊（王軼男等，2014）中的研究結果一致。苦蕎F5H蛋白有數量不同的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸3個磷酸化位點，與石榴（馮立娟等，2018）中的研究結果一致。F5H磷酸化后可以改變蛋白質活性，從而調節苦蕎的生長發育過程。多重序列比對發現苦蕎FtF5H與其他植物F5H氨基酸序列的相似性高達84.79%，證明該基因比較保守。系統進化分析結果表明，苦蕎FtF5H基因與藜麥親緣關系最近，且與其他雙子葉植物的F5H基因親緣較近，而與單子葉植物水稻、柳枝稷、稷、黃藤的親緣關系較遠，表明該基因在雙子葉及單子葉植物綱之間同源性差異較大。

Shafrin等（2015）下調黃麻的F5H基因，發現與非轉基因植物相比，整個莖中酸不溶性木質素含量降低約25%，纖維木質素降低12%～15%。肖玉菲等（2018）在對尾葉桉的研究中發現，EuF5H在半木質化莖中表達量最高，在嫩莖中最低。甘藍型油菜植株根、根莖和莖中木質素含量高低與抗倒能力成正相關，且F5H基因在抗倒伏油菜薹期根部、莖部以及開花期根部表達量明顯高于易倒伏材料（李堯臣和戚存扣，2011）。本研究FtF5H基因在厚果殼‘云蕎1號’莖、花、果殼的表達量均高于薄果殼‘小米蕎’，各器官之間的表達有極顯著差異，且FtF5H在厚果殼中的表達量是薄果殼的5倍，推測FtF5H基因在薄果殼苦蕎低表達與薄果殼的木質素合成和積累少有關。

Takeda等（2017）對水稻的研究發現，OsF5H1表達是控制水稻細胞壁中S/G木質素組成的主要因素。徐超等（2015）對碭山酥梨果實F5H基因的研究發現PbF5H參與調控梨果實S木質素單體的合成，影響木質素G/S比值。Tetreault等（2020）的研究發現，高粱F5H（SbF5H）的過表達增加了S-木質素含量。木質素合成有著復雜的代謝網絡，多個基因共同調控它的代謝。F5H基因作為一個多基因家族，并非所有F5H基因均在G/S的轉化中發揮作用。因此，本研究獲得的FtF5H基因在薄果殼苦蕎木質素生物合成途徑的功能仍需進一步研究。

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（責任編輯 蔣巧媛）

收稿日期：? 2021-03-11

基金項目：? 國家自然科學基金地區科學基金（31460379）;國家燕麥蕎麥產業技術體系“蕎麥病蟲害防控”項目（CARS-07-C-2）;山西省重點研發計劃項目（201803D221012-6）;陽泉市中藥材產業專項（SZY-YQZX-2019005） [Supported by? National Natural Science Foundation of China （31460379）;? National Technical System of Oat and Buckwheat “Plant Diseases and Insect Pests Control of Buckwheat”（CARS-07-C-2）; Key Research and Development Project of Shanxi （201803D221012-6）; Special Project of Traditional Chinese Medicine Industry in Yangquan City （SZY-YQZX-2019005）]。

第一作者： 段迎（1996-），碩士研究生，主要研究方向為中藥資源開發與利用，（E-mail）18434376630@163.com。

*通信作者：? 賀潤麗，博士，教授，主要研究方向為中藥資源開發與利用，（E-mail）herunli666@163.com。

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