戰骨黃酮碳苷類化合物的大孔樹脂富集工藝研究

黨驕陽 陳月圓 顏小捷 盧鳳來 李霞 李典鵬

摘 要：? 黃酮碳苷，作為戰骨植物中的有效成分之一，具有抗骨關節炎的功效。為優化植物戰骨莖中總黃酮碳苷的富集純化工藝，該研究以戰骨中5個黃酮碳苷為考察指標，通過對13種大孔樹脂的靜態吸附與解吸實驗，優選出合適的大孔樹脂，利用高效液相色譜對結果進行檢測，然后利用正交工藝優化富集純化條件。結果表明：（1）XAD-16N型大孔樹脂對植物戰骨莖中黃酮碳苷具有較好的吸附和解吸效果，通過單因素篩選及正交工藝優化，最終確定其最佳富集純化工藝為上樣濃度為原提取液稀釋2倍、上樣流速2 BV·h-1、洗脫液濃度60%乙醇。（2）總黃酮碳苷的含量由1.73%（原植物中含量）提高到14.50%，提高了7.38倍。以上結果表明，優化的提取工藝穩定可行，篩選的大孔樹脂富集純化效果良好，為植物戰骨莖的藥物開發提供數據參考。

關鍵詞： 戰骨， 黃酮碳苷， 大孔樹脂， 正交試驗

中圖分類號：? Q946

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2022）02-0333-07

Purification technology of total flavonoid-C-glycosides

of Premna fulva by macroporous resin

DANG Jiaoyang1，2， CHEN Yueyuan2， YAN Xiaojie2， LU Fenglai2， LI Xia1， LI Dianpeng2*

（ 1. College of Chemistry and Bioengineering， Guilin University of Technology， Guilin 541006， Guangxi， China;? 2. Guangxi Key Laboratory of

Functional Phytochemicals Research and Utilization， Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China ）

Abstract：? Flavonoid-C-glycosides， as one kind of the effective components in Premna fulva， have the effect of antigen-induced arthritis. In order to optimize the enrichment and purification process of? P. fulva stems， through static adsorption and desorption experiments on 13 kinds of macroporous resins with five flavonoid-C-glycosides in P. fulva stems as the index， a suitable macroporous resin was selected， and the results were tested by the HPLC， and then the orthogonal process was used to optimize the enrichment and purification conditions. The results were as follows： （1） XAD-16N macroporous resin has good adsorption and desorption effects on the five flavonoid -C-glycosides in P. fulva stems. Through single factor screening and orthogonal process optimization， the best enrichment and purification process was finally determined as that the loading concentration was two times the original extract diluted， the loading flow rate was 2 BV·h-1， and the eluent concentration was 60% ethanol. （2） The contents of five flavonoid-C-glycosides increased from 1.73% （in the original plant） to 14.50%， an increase of 7.38 times. All the results indicate that the selected extraction process is stable and feasible， and the selected macroporous resin has good separation and purification effects， which provides a reference for the drug development of P. fulva stems.

Key words： Premna fulva， flavonoid-C-glycosides， macroporous resin， orthogonal test

戰骨又名黃毛豆腐柴（Premna fulva），馬鞭草科豆腐柴屬植物，其根、莖、葉均可以入藥。分布于廣西南寧、龍州平果等地（戴春燕等，2007;史艷財等，2010）。具有祛風止痛等功效，民間常用于治療腰腿疼痛、跌打扭傷、風濕性和類風濕性關節炎等，是廣西的地道藥材（蔣才武等，2004）。戰骨作為廣西道地藥材，藥用歷史悠久。文獻調研發現對戰骨的研究主要集中在化學成分（潘洪平，2002;吳雪莉等，2016）、藥理（葉勇等，2018）及相關制劑的藥效、臨床研究（陳蒼海，2018）等方面。方剛（2018）明確戰骨的主要成分為柚皮素等黃酮類化合物，并對黃酮類成分研究進行了提取工藝研究（李小燕等，2005）。最新研究發現，以戰骨為原料的單方制劑產品健骨注射液的抗骨關節炎的功效成分主要為5個黃酮碳苷（Chen et al.，2019）。且梁玉婷等（2018）報道基于UFLC-Triple TOF-MS/MS技術，從戰骨植物中指認出18個黃酮碳苷類化合物異構體，說明戰骨植物中含有豐富的碳苷黃酮。戰骨中黃酮碳苷的提取采用天然低共熔溶劑（NADESs）可高效提取黃酮碳苷（陳月圓等，2020），總黃酮碳苷實際得率為17.37 mg·g-1，顯著高于現有傳統有機溶劑提取工藝（13.70 mg·g-1），但是，該黃酮碳苷類提取物中仍普遍含有萜類、多糖、蛋白質、木脂素等多種雜質，嚴重制約了黃酮碳苷類化合物的實際應用。因此，非常有必要開發出一種有效的方法用以生產高純度的戰骨黃酮碳苷類化合物。本文建立了富集戰骨中黃酮碳苷類化合物的純化方法，黃酮碳苷類化合物作為戰骨植物中的主要功效成分，為了進一步開發和利用戰骨中的黃酮碳苷類化合物，及現有產品制劑（如健骨注射液）的二次開發和利用。

大孔樹脂作為一種有機高聚物吸附劑，具有吸附性好、選擇性強、吸附速度快、可重復利用的特點，已廣泛應用于黃酮類成分的分離純化以及化學醫藥等領域（汪洪武和劉艷清，2005;劉丹等，2016）。戰骨黃酮碳苷的NADESs提取液能否運用大孔樹脂富集純化研究未見報道，故本文采用大孔樹脂法對戰骨植物中的5個黃酮碳苷的NADESs提取液進行富集純化研究。通過比較13種大孔樹脂對戰骨植物中5個總黃酮碳苷的吸附效率，篩選出了一種對戰骨具有高吸附分離效率的樹脂，通過單因素實驗及正交試驗對該樹脂的工藝條件進行了優化。

1 材料與方法

1.1 材料和實驗儀器

戰骨購于廣西玉林藥材市場，經廣西植物研究所唐輝研究員鑒定為馬鞭草科豆腐柴屬植物黃毛豆腐柴（Premna fulva）的根莖。憑證樣品保存于廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室。

5個黃酮碳苷對照品（芹菜素-6，8-二-C-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-β-D-半乳糖苷、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷和芹菜素-6-C-β-D-半乳糖-8-C-β-D-木糖苷），實驗室自制，純度大于95%;大孔樹脂HPD-750、HPD-BJQH、HPD-100、D296、LSA-700B、LX-T5、NKA、XAD-16N，賽普銳斯（北京）科技有限公司;FPA53，北京慧德易科技有限公司;LX-38、LX-T28、LX-60，西安藍曉科技新材料股份有限公司;D101，滄州寶恩吸附材料科技有限公司;氯化膽堿，鄭州超凡化工有限公司;1，3-丙二醇，山東綠健生物技術有限公司;甲醇為色譜純，安徽天地高純溶劑有限公司;娃哈哈飲用純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司。

島津LC-2030C型液相色譜儀，島津企業管理（中國）有限公司;JP-040型數控超聲波清洗器，深圳市潔盟清洗設備有限公司;LQ-A10002型電子天平，瑞安市安特稱重設備有限公司;N-1300旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品的制備 將戰骨的莖磨成粉末，用40%乙醇浸泡兩周，將提取液濃縮后，經大孔樹脂、C18、MCI等柱材料分離劃段，得到富含5個黃酮碳苷的部位，最后按照Chen等（2019）的方法，采用循環高速逆流色譜法成功得到5個黃酮碳苷對照品。

1.2.2 戰骨NADESs提取液的制備 根據課題組前期優化的戰骨綠色提取溶劑天然深共晶溶劑（NADESs）的提取工藝（陳月圓等，2020），取干燥的戰骨粉末適量過篩（80目），按照專利的方法提取戰骨莖總黃酮碳苷，收集上清液，備用。

1.2.3 色譜條件及對照品溶液的配制 色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）;柱溫為30 ℃;流動相0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）;梯度洗脫程序為0～20 min、10%～30%B，20～45 min、30%～40%B;流速為1.0 mL·min-1;檢測波長為280 nm;進樣量為20 μL。

標準溶液的配置：分別精確稱取一定質量的5個對照品7.6、5.1、7.2、5.7、2.8 mg，用無水乙醇在10 mL的容量瓶中定容，制成濃度為0.760、0.516、0.726、0.576、0.286 mg·mL-1的貯備液，分別將5個貯備液稀釋一定的倍數，取5、10、15、20 μL進行液相分析。

1.2.4 標準曲線的建立 采用外標法定量，以色譜峰面積（Y）為縱坐標，對照品濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標，進行線性回歸分析，得到標準曲線回歸方程。將最低濃度標準工作溶液重復進樣 10 次，計算標準偏差，分別以3倍和10倍標準偏差為方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結果見表1。可以看出，方法的線性良好，且靈敏度較高。

1.2.5 大孔樹脂的選擇

1.2.5.1 大孔樹脂的預處理 分別稱取一定量HPD-750、HPD-BJQ、HPD-100、D296、LSA-700B、LX-T5、NKA、XAD-16N、FPA53、LX-38、LX-T28、LX-60和D101共13種大孔樹脂，用乙醇浸泡24 h，用蒸餾水反復清洗至無味，備用。

1.2.5.2 靜態吸附性能 選擇上述預處理好的大孔樹脂各50 g，分別置于500 mL錐形瓶中，各加入250 mL的提取液，25 ℃下恒溫恒速振蕩吸附24 h，抽濾，每組做3個平行實驗，取濾液測定5個黃酮碳苷的總質量。然后用去離子水清洗3次樹脂，用濾紙將樹脂表面的水分吸干，轉入500 mL錐形瓶中，加入80%的乙醇250 mL，于25 ℃下恒溫恒速振蕩解吸12 h，取上清液測定5個總黃酮的總質量，按照下列公式計算吸附率與解吸率，比較靜態吸附性能，從13種樹脂中篩出吸附性能最佳的樹脂。

吸附率（%）=（原液中5個黃酮碳苷總質量-吸附后濾液中5個黃酮碳苷總質量）/原液5個黃酮碳苷總質量×100;

解吸率（%）=解吸后溶液中5個黃酮碳苷的總質量/樹脂吸附的5個黃酮碳苷總質量×100。

1.2.6 泄露曲線的繪制 根據1.2.5.2的篩選結果，將大孔樹脂預處理好后，濕法裝樣，取提取液原液上柱，每份60 mL，以固定的流速進行動態吸附，分別接出每一份流出液，測出流出液中5個黃酮碳苷的含量，繪制泄露曲線。

1.2.7 單因素實驗及正交優化試驗 按照1.2.2提取液的制備方法，制備提取液。以吸附率和解吸率作為綜合考查的指標，在其他因素相同的情況下，分別考查提取液上樣濃度[原提取液稀釋1倍、稀釋2倍、原液（0倍）]、上樣流速（1、2、3 BV·h-1）、洗脫液濃度（50%、60%、70%乙醇）、洗脫液用量（1、2、3 BV）對吸附率和解吸率的影響。

根據單因素實驗的篩選結果，從提取液上樣濃度、上樣速度、洗脫液濃度、洗脫液用量中篩選出上樣濃度、上樣流速、洗脫液濃度3個影響較大的因素為自變量，考察戰骨中5個主要活性黃酮碳苷在樹脂中的總解吸率及在洗脫液中的含量為指標，設計L9組（34）正交試驗，正交試驗因素與水平見表2。總解吸率及含量按照下式計算。

解吸率（%）=洗脫液中5個活性黃酮碳苷的總質量/原液中5個黃酮碳苷總質量在樹脂中的總吸附質量×100;

含量（%）=洗脫液中總黃酮碳苷的質量洗脫液總質量×100。

2 結果與分析

2.1 樹脂靜態吸附性能比較

靜態吸附結果（圖1）表明：戰骨5個黃酮碳苷的靜態吸附率較優的樹脂為XAD-16N（86.65%）、LX-60（83.51%）、LX-T28（81.92%），樹脂間差異性不顯著（P>0.05）。D296和LSA-700B對戰骨5個黃酮碳苷的靜態吸附率也較好（81.71%，82.00%），但是兩者的解吸率只有1.44%、1.03%，其原因是這兩類樹脂為脫色型樹脂，其吸附量用酸和堿均無法將其洗脫。而LX-T5、FPA53兩個樹脂吸附性能和解吸性能相對都比較差，吸附率和解吸率都比較低。尤為重要的是，與現有戰骨制劑健骨注射液工業處理的樹脂D101相比（王靜宇和杜日建，2014），XAD-16N、LX-60、LX-T28三種樹脂吸附率均顯著優于D101（74.30%），而4種樹脂在靜態解吸率上均無顯著差異。故又采用動態吸附和解吸考察此4種樹脂的泄露曲線。

2.2 吸附泄露曲線

分別繪制XAD-16N、LX-T28、LX-60、D101大孔樹脂的泄露曲線，由圖2可知，隨著上樣量的增加，5個黃酮碳苷的泄漏量逐漸增加，當份數增大到動態飽和吸附時，泄露量增加的趨勢明顯上升，即大孔樹脂達到動態飽和吸附。不同樹脂對戰骨植物5個黃酮碳苷的吸附量有所差異，泄漏量也有所不同。其中，XAD-16N的泄漏量最少吸附量最多，其次是D101，接著是LX-T28，而LX-60樹脂的吸附量最低，因此選用XAD-16N做動態吸附實驗。

2.3 戰骨黃酮碳苷優化工藝

2.3.1 提取液上樣濃度 上柱液濃度分別為原提取液稀釋1倍、稀釋2倍、原液（0倍），每份100 mL，分別以2 BV·h-1（每小時2倍柱體積）的流速通過XAD-16N型大孔樹脂，用純水洗脫至流出液為無色，收集過柱液，用70%乙醇洗脫3 BV，收集洗脫液。每組實驗做3個平行，按2.2方法測定5個黃酮碳苷的總含量，計算5個黃酮碳苷的總吸附率和總解吸率。從表3可以看出，原液稀釋1倍與原液稀釋2倍兩者的吸附率都是100%，但使用原液上樣時，吸附率卻只有67.32%;而解吸率原液和原液稀釋1倍差異性并不顯著，原液稀釋2倍最小，綜上考慮，故確定上樣濃度為原液稀釋1倍。

2.3.2 上樣速度 根據2.3.1的篩選結果，固定上柱液濃度（原液稀釋1倍），如表4所示，不同的上樣流速對戰骨植物總黃酮在XAD-16N型大孔樹脂中吸附率和解吸率存在影響，上樣流速為1、2 BV·h-1時吸附率一樣，3 BV·h-1時吸附率顯著下降，而解吸率隨著上樣流速的增大逐漸變小，綜合考慮確定上樣流速為1 BV·h-1。

2.3.3 洗脫液濃度 取濃度為原液稀釋1倍上柱液的4份，每份100 mL，以1 BV·h-1的流速通過XAD-16N型大孔樹脂，用純水洗脫至流出液為無色，收集過柱液，分別用50%、60%、70%、80%的乙醇洗脫3 BV，收集洗脫液，測定洗脫液中總黃酮的含量。從表5可以看出4個濃度下的吸附率都一樣，但解吸率隨著濃度的增加逐漸增大，當洗脫液濃度為70%與80%時，解吸率差異并不顯著。因此，從節約溶劑的角度考慮，最終確定洗脫液的濃度為70%。

2.3.4 洗脫液用量 按照經單因素考察后2.3.3的方法，飽和吸附后，用純水洗脫至流出液為無色，分別用70%的乙醇溶液洗脫1、2、3、4 BV，收集洗脫液。每組實驗做3個平行，按1.2.7測定和計算5個黃酮碳苷的總含量，并計算5個黃酮碳苷的總吸附率和總解吸率。從表6可以看出，洗脫液用量為1 BV的時候解吸率最小，只有81.24%;隨著洗脫液體積的增大，解吸率逐漸增大，當洗脫液用量為4 BV時，解吸率達到最大，為98.61%。這說明少體積洗脫液并不能將黃酮碳苷全部洗脫，而洗脫液用量為3 BV時解吸率為95.92%，與4 BV相差不大，從節約溶劑的角度考慮，最終確定洗脫液用量為3 BV。

2.3.5 正交試驗 根據單因素實驗的結果，按照表2的正交試驗設計，試驗結果見表7。由極差分析結果可知，樹脂XAD-16N影響純化戰骨植物中5個黃酮碳苷的工藝因素依次為B > C >A， 即上樣流速>洗脫液濃度 >上樣濃度。由表8的方差分析結果可知，因素A、B、C均無顯著影響（P>0.05）。戰骨植物中5個黃酮碳苷提取理論最優水平為A2、B2、C2，即上樣濃度為原液稀釋2倍、上樣流速2 BV·h-1、洗脫液濃度60%乙醇。

2.4 驗證試驗

采用2.3.5最優工藝進行3次驗證試驗，結果見表9。由表9可知，5個總黃酮碳苷的含量為14.50%，而由原植物提取液中5個總黃酮碳苷的含量為1.73%，實驗結果確證篩選得到的大孔樹脂XAD-16N富集純化效果良好。

3 討論與結論

大孔樹脂具有高交聯度和多永久性孔隙的特性，廣被用于黃酮類化合物的分離和提純。大孔樹脂能從植物提取物中分離黃酮類化合物的優勢是由于黃酮類化合物本身的特性，因為它們的苷元上有苯環和幾個氫基，有助于具有適當的平均孔徑、極性和表面積的大孔吸附樹脂吸附這些化合物。結果表明，XAD-16N作為理想樹脂用于戰骨中黃酮碳苷提取液（天然深共晶溶劑作為提取媒介）的富集純化的吸附和解吸能力最強，說明大孔樹脂的大孔徑（560～710 μm）、大比表面積（800 m2·g-1）和苯乙烯系基質最適合于戰骨提取物中黃酮碳苷的吸附和釋放。故戰骨提取物大極性的黃酮碳苷與大極性樹脂之間的極性匹配主要歸因于氫鍵和范德華相互作用。

乙醇是一種有機溶劑，具有可回收、價格低廉、毒性低且對人類無安全威脅等優點。因此，本研究選擇它作為脫附劑。實驗結果表明，黃酮碳苷類化合物的解吸率與乙醇濃度成正比，這意味著隨著解吸率的增加，乙醇濃度也會增加。達到峰值后，解吸率隨乙醇濃度的進一步增加而趨于平緩。吸附在樹脂上的分子間作用力與溶解在溶劑中的分子間相互作用對黃酮碳苷類化合物從樹脂上的解吸具有重要作用。而且，XAD-16N成功地富集了戰骨中存在的黃酮碳苷類化合物，并能選擇性地吸附黃酮碳苷類化合物。與傳統的純化工藝（D101）相比，樹脂XAD-16N的吸附率（86.65%）和解吸率（86.54%），均顯著優于D101（吸附率74.30%，解吸率77.21%）。本研究通過單因素篩選及正交工藝優化，最終確定其最佳富集純化工藝為上樣濃度為原提取液稀釋2倍、上樣流速2 BV·h-1、洗脫液為60%乙醇。總黃酮碳苷的含量由1.73%（原植物中含量）提高到14.50%，提高了7.38倍。因此，本研究開發了一種簡單有效的從戰骨植物中提取黃酮碳苷的方法。該方法操作簡單，回收率高，工藝穩定可行，可為今后戰骨工業大批量生產提供一定的參考價值。

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（責任編輯 李 莉）

收稿日期：? 2020-12-02

基金項目：? 廣西創新驅動發展專項（桂科AA18118015）;廣西自然科學基金（2018GXNSFAA294031）;中央引導地方科技發展專項（桂科ZY20111010） [Supported by Innovation-Driven Development Special Project of Guangxi（AA18118015）; Natural Science Foundation of Guangxi（2018GXNSFAA294031）; Special Project of Local Science and Technology Development Guided by the Central Government （ZY20111010）]。

第一作者： 黨驕陽（1996-），碩士研究生，研究方向為藥物研發與轉化，（E-mail）545121289@qq.com。

*通信作者：? 李典鵬，博士，研究員，主要從事植物化學研究，（E-mail）ldp@gxib.cn。

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