不同修復植被類型的三峽庫區消落帶土壤細菌群落分析

李彥杰, 蔣夢蕓, 楊俊年, 劉仁華, 鐘 彥, 王 晶

(1.重慶三峽學院 生物與食品工程學院, 重慶 404100; 2.重慶三峽學院 教師教育學院, 重慶 404100)

三峽大壩建成后，因水庫調度引起的水庫水位變動，使得庫區兩岸形成了垂直落差達30 m的周期性水淹—露出交替地帶，即三峽庫區消落帶。水庫水位變化破壞了消落帶原有植被生態系統，進而引發了諸多生態環境問題，恢復和重建消落帶生態系統是消落帶治理的關鍵。

土壤細菌可促進地球養分循環，改良土壤結構，提高土壤有機質轉化，進而促進植物生長，對維持植被-土壤生態系統的穩定具有重要作用[1]。土壤細菌群落具有明顯的時空特征，受土壤pH值、養分、質地、氣候條件、人工措施、地理位置和植被類型等影響[2-3]。土壤細菌群落結構受多種非生物脅迫因子的驅動，塑造后的新群落既作用于逆境下由細菌介導的土壤養分轉化及利用過程，也通過和植物的物質交流等共同調節植物的抗逆性[4-5]，故分析重建后的細菌群落結構對揭示植物的抗逆機制具有重要意義。此外，土壤細菌群落結構多樣性及功能對植物生存環境狀況及植被-土壤系統的重建評價也具有一定的指示價值。目前，已有多個研究表明植被狀況(有植被區和無植被區等)[6-8]和水淹高程[9-10]均會影響三峽庫區消落帶土壤細菌群落多樣性，而不同類型的修復植被對土壤細菌群落的影響鮮見報道。本研究在重慶市萬州區沱口“三峽水庫消落區植被修復試驗示范基地”內，分別選擇純草地、純林地和覆草林地3種修復植被樣地土壤為研究對象，探討不同樣地對土壤細菌群落結構的影響，以期為后續研究消落帶土壤微生物如何影響植物的耐淹性提供基礎。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區塊位于重慶市萬州區百安壩沱口片區長江邊的“三峽水庫消落區植被修復試驗示范基地”(30.77°N，108.43°E)內，屬三峽庫區自然消落帶。萬州區位于四川盆地東緣，重慶市東北邊緣，地處長江中上游結合部，屬亞熱帶季風濕潤氣候，四季分明，日照充足，冬暖多霧，霜雪稀少，夏熱多伏旱，雨量充沛；多年平均氣溫17.7℃，極端最高氣溫42℃，最低氣溫零下3.7℃，平均年日照時數1 484 h，多年平均降水1 243 mm。示范基地在三峽大壩175 m蓄水前大部分為旱作緩坡耕地和梯田耕地。

1.2 試驗設計及采樣方法

示范基地為三峽庫區自然消落帶，每年隨著三峽大壩的水位變化均經歷周期性的水淹—露出的過程。示范基地有純草地、純人工林地、覆草人工林地和混交林等多種不同類型修復植被區。純草地有原生區和多年移栽區，分布于145～175 m水淹高程，優勢種均為狗牙根(Cynodondactylon)，零星可見野古草(Arundinellaanomala)、牛鞭草(Hemarthriacompressa)和蒼耳(Xanthiumsibiricum)等。純人工林地和覆草人工林地主要位于165～175 m高程，林木均為2012年來陸續種植的中山杉(Taxodium‘Zhongshanshan’)，其中覆草林地草本優勢種為狗牙根。經9個周期性水淹—露出試驗，人工林和覆草林地的中山杉成活率超過85%，2012年移栽的純草地和覆草人工林的狗牙根成活率接近100%。2020年4月選擇示范基地165～167 m水淹高程(每年經歷最大水淹深度為10～12 m，水淹時間約為200 d)地勢平緩、露出水面的純草地(A1)、純林地(A2)和覆草林地(A3)為研究對象，每個樣地設置3個重復樣帶(5 m×10 m)，各樣帶間隔10 m，3種樣地共有9個樣帶。

樣帶內采取5點取樣法，取5個樣點表層0—20 cm土壤混合后作為該樣點土樣，樹下土壤采樣在以樹體為原點的50 cm半徑范圍內完成。取樣時首先去除土壤殘枝、落葉和石礫等物，取樣后低溫保存并迅速帶回實驗室。一部分土樣-80℃保存用于微生物多樣性分析，剩余土樣風干后用于土壤理化性質測定。

1.3 土壤理化性質測定

土壤pH值采用水浸提電位法，按土水比為1∶2.5混勻，靜置30 min后測定；土壤有機碳(soil organic carbon，SOC)采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法(NY/T1121.6—2006)測定；土壤全氮(total nitrogen，TN)采用凱氏法(HJ717—2014)測定；土壤全磷(total phosphorus，TP)采用NaOH堿熔-鉬銻抗分光光度法(HJ632—2011)測定。

1.4 土壤DNA提取及16S rDNA測序

用MN NucleoSpin 96 Soi試劑盒(MACHEREY-NAGEL，Germany)提取土壤DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳和Synergy HTX多功能微孔板檢測儀(BioTek，USA)檢測DNA的完整性和純度。用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物擴增細菌16S rDNA的V3—V4區。50 μl擴增體系：100 ng模板DNA，1.5 μl引物(10 μmol/L)，25 μl 2×PCR buffer for KOD FX Neo(Toyobo，Japan)，1.0 μl KOD FX Neo高效PCR酶(1.0 U/μl) (Toyobo，Japan)和10 μl dNTP(2 mmol/L)。擴增條件為：95℃預變性5 min，95℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，25個循環，72℃延伸7 min。PCR產物經1.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收，送至北京百邁客生物科技有限公司用Illumina Hiseq 2500平臺測序。

1.5 數據處理

原始測序數據經過濾、拼接、嵌合體去除和長度篩選后，在97%相似性水平作OTUs聚類；基于RDP classifier比對Silva 16S rRNA基因數據庫對所有OTUs代表序列作物種注釋；基于Mothur v.1.30計算樣品的ACE指數、Chao1指數、辛普森指數和香濃指數。采用Excel 2019(Microsoftware，USA)作數據整理，統計分析采用R包，其中Kruskal-Wallis法用于評價樣本間的微生物多樣性指數的差異顯著性(α=0.05)，單因素分析和Turkey法用于評價樣本間理化因子的差異顯著性(α=0.05)，斯皮爾曼相關系數(Spearman correlation coefficient，ρ)用于評價土壤理化因子與細菌多樣性指數、優勢菌屬與土壤理化因子的相關性；采用Canoco 5.0(Microcomputer power, USA)作冗余分析(redundancy analysis, RDA)。

2 結果與分析

2.1 不同樣地土壤理化性質

由表1可知，純草地(A1)、純林地(A2)和覆草林地(A3)的土壤酸堿度均趨于中性，且三者間無顯著性差異；A1和A3的土壤有機碳(SOC)含量之間無顯著性差異，但均顯著高于A2(p<0.05)；3種樣地的全氮(TN)和全磷(TP)含量之間無顯著性差異。

表1 不同樣地土壤的理化性質

2.2 土壤細菌群落的α多樣性

對測序原始數據預處理及OTUs聚類，結果顯示，A1組共有1 296條OTUs，其中特有OTUs數目為217；A2共有1 294條OTUs，其中特有OTUs數目為12；A2共有1 222條OTUs，其中特有OTUs數目為38；三者共有OTUs數目為852。基于ACE指數、Chao1指數、辛普森指數和香濃指數評估A1，A2和A3的細菌群落豐富度和多樣性，結果顯示不同樣地之間的細菌群落豐富度和多樣性指數差異均不顯著(表2)。

表2 不同樣地土壤細菌的α多樣性指數

2.3 土壤理化因子與細菌群落多樣性

相關性分析結果顯示(表3)，土壤的SOC和TN含量均與細菌ACE豐富度指數和香濃多樣性指數顯著正相關(p<0.05)，SOC含量與Chao1指數顯著正相關(p<0.05)。

表3 土壤理化因子與細菌群落α多樣性指數的相關性

2.4 不同樣地的細菌群落組成特征

統計A1，A2和A3樣地在門水平可注釋的相對豐度排序前10的微生物優勢種群依次為變形菌門(Proteobacteria)(36.67%，28.48%，30.67%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(20.66%，23.66%，25.79%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(13.38%，5.60%，7.61%)、放線菌門(Actinobacteria)(4.27%，11.51%，6.99%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)(8.21%，8.42%，7.33%)、Rokubacteria(2.69%，6.04%，5.91%)、擬桿菌門(Bacteroidetes)(4.40%，1.07%，1.89%)、Latescibacteria(3.75%，3.00%，3.08%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)(2.47%，3.46%，3.40%)和厚壁菌門(Firmicutes)(0.95%，3.65%，2.39%)(圖1A)。3種樣地的變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、放線菌門和芽單胞菌門等種群相對豐度較高，其中變形菌門和酸桿菌門兩者約占土壤細菌豐度的52%以上。

如圖1B所示，A1，A2和A3樣地在綱水平上的主要優勢種群依次為γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)(16.53%，12.62%，15.52%)、Subgroup_6(12.28%，6.87%，11.57%)、α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)(10.61%，9.13%，7.83%)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)(9.53%，6.73%，7.32%)、芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes)(7.55%，8.30%，7.04%)、NC10(2.69%，6.04%，5.91%)、酸桿菌綱(Acidobacteriia)(2.47%，6.84%，4.47%)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)(8.58%，1.69%，2.83%)、擬桿菌綱(Bacteroidia)(3.98%，0.89%，1.82%)和芽孢桿菌綱(Bacilli)(0.79%，3.20%，1.89%)。3種樣地的γ-變形菌綱、α-變形桿菌綱、δ-變形菌綱和芽單胞菌綱等種群占比較高，其中變形菌門的3種變形菌綱種群占比為30%左右。

2.5 屬水平細菌優勢種群與土壤理化因子的相關性

在屬水平，A1，A2和A3的群落中平均相對豐度大于1%的可注釋優勢種群有uncultured_bacterium_c_Subgroup_6(12.20%，6.87%，11.56%)，uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae(7.25%，7.79%，6.54%)，uncultured_bacterium_o_Rokubacteriales(2.56%，6.01%，5.83%)，RB41(0.58%，5.36%，4.44%)，uncultured_bacterium_p_Latescibacteria(3.40%，2.99%，3.02%)，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)(3.60%，2.19%，2.31%)，MND1(1.88%，2.34%，3.61%)，硫桿菌屬(Thiobacillus)(3.40%，0.33%，1.14%)，uncultured_bacterium_f_Anaerolineaceae(3.30%，0.54%，1.02%)，芽胞桿菌屬(Bacillus)(0.41%，2.44%，1.00%)。屬水平的細菌優勢種群(相對豐度大于1%)與土壤理化因子的相關性分析結果顯示(表4)，uncultured_bacterium_c_Subgroup_6，硫桿菌屬(Thiobacillus)和uncultured_bacterium_f_Anaerolineaceae等種群的相對豐度均與土壤SOC和TN含量顯著正相關(p<0.05)，RB41和芽胞桿菌屬(Bacillus)等種群的相對豐度均與土壤SOC和TN含量顯著負相關(p<0.05)，uncultured_bacterium_o_Rokubacteriales種群的相對豐度與土壤SOC含量顯著負相關(p<0.05)。

圖1 不同樣地細菌群落結構

表4 屬水平細菌優勢種群與理化因子的相關性

進一步采取RDA對土壤理化性質和目水平細菌群落優勢種群(相對豐度Top 10)進行限制性排序分析(圖2)，RDA1可解釋總方差的71.85%，RDA2可解釋總方差的5.16%，兩者累積可解釋總方差的77.01%。SOC，TN，pH值和TP均與RDA1負相關。條件效應分析結果顯示，SOC是模型的顯著性因子(pseudo-F=10.8，校正p=0.032)，其解釋率為60.7%，即SOC是影響三峽庫區消落帶土壤細菌群落結構的主要顯著性因子(p<0.05)。

3 討 論

3.1 消落帶不同修復植被的土壤理化因子特征

與一般的陸生及水生系統不同的是，消落帶土壤長期處于周期性的淹水—露出環境中，其土壤理化性質不但受土壤植被的影響，也受水文特征及人類活動等影響[11-12]。已有研究表明，長期水淹生境下，消落帶酸性或堿性土壤的pH值均逐漸趨于中性，本研究中消落帶不同修復植被的土壤pH值間無顯著性差異，且均接近中性，其形成可能與消落帶土壤被江水長期浸泡，以及露出時受雨水沖刷導致的有機質流失有關[13-14]。土壤SOC儲量不僅受氣候、地形和土壤理化性質等自然因素和管理措施、土地利用方式等人為因素的影響，也受植被狀況及其生物凋落物的影響[15-16]。由于純草地(A1)和覆草林地(A3)能提供更多植物凋落物，進而導致土壤SOC增加，故這兩種樣地的SOC含量均顯著高于純林地(A2)(p<0.05)，這與已有研究結果類似[17-18]。土壤TN和TP含量與土母質、風化淋溶程度、氣候、人為活動和植物凋落物等有關[19-20]。本研究中，3種不同植被樣地的TN和TP含量均較高，且無明顯差別，這與部分研究結果不符[21]。取樣區域在三峽水庫蓄水完成前為旱作梯田耕地，且蓄水后在175 m高程以上仍有成片坡菜地，這可能與人工添加的N和P元素遷移有關。

圖2 目水平土壤細菌優勢種群與理化因子的RDA分析

3.2 消落帶不同修復植被的土壤細菌群落特征

土壤細菌群落結構與植被類型、植物多樣性關系密切。植物根系分泌物及凋落物為土壤細菌的生長提供了氨基酸和碳水化合物等重要營養和能源，同時植物通過根系呼吸作用影響土壤的氣體組分、pH值和氧化還原電位進而改善土壤微環境，共同促進土壤細菌生長及驅動細菌群落的演替。有研究顯示針葉林、常綠闊葉林、針-闊混交林和竹林4種不同森林植被的土壤細菌群落顯著不同，不同植被區土壤均有其特定優勢種群[22]。土壤理化性質也可單獨或和植被等共同影響特定土壤環境下的細菌群落結構。研究表明，在亞熱帶森林生態系統早期演替過程中，土壤理化因子、植被類型及多樣性可分別解釋細菌群落總變異的28%，12%，即兩者共同影響土壤細菌群落結構[23]。水淹作為一種非生物脅迫因子，其缺氧和低光環境可直接影響細菌的群落結構。此外，水淹環境影響植被生長，進而影響土壤有機碳等營養組分循環和累積，也間接影響土壤細菌群落結構。有研究顯示，水淹環境影響三峽庫區消落帶土壤細菌群落結構和多樣性，其中水位變化是驅動消落帶土壤細菌群落結構演替的重要因素[24]。本研究選擇相近水淹高程的消落帶研究樣地，其多年水位變化基本一致，結果顯示3種修復植物樣地的細菌群落豐富度和多樣性無明顯差異。SOC顯著影響屬水平的細菌Top10優勢種群(p<0.05)，結合表1的土壤理化性質，推測相近高程下消落帶的不同修復植被通過可提供給土壤的有機碳數量影響土壤細菌群落結構。

3種樣地的優勢菌門均為變形菌門(Proteobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)，且其門、綱水平的Top10優勢種群及相對豐度與多個相近環境中土壤細菌群落組成類似[25]。已有研究表明，變形菌門主要由γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)等組成，相對豐度約占土壤細菌的30%，其可參與土壤的有機物降解及N元素等養分循環過程[26]。本研究中，變形菌門(Proteobacteria)γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)的平均相對豐度在純草地(A1)和覆草林地(A3)土壤較高，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)的平均相對豐度在3種樣地基本一致，顯示不同修復植被對消落帶土壤的固氮種群無明顯影響。酸桿菌門(Acidobacteria)具有嗜酸和寡營養等特點，其通過參與纖維素降解和金屬元素循環等在土壤生態過程中起重要作用。從A1，A2到A3樣地，土壤的pH值呈下降趨勢，酸桿菌門的相對豐度呈上升趨勢，這與多個研究發現的土壤中酸桿菌的相對豐度與土壤pH值負相關的結論相符[27]。綠彎菌門(Chloroflexi)厭氧繩菌綱(Anaerolineae)廣泛分布于水生及濕地土壤中，其功能主要與土壤有機碳的降解有關[28-29]。純草地(A1)和覆草林地(A3)比純林地(A2)可提供更多植物殘體，可促進與有機質降解的細菌種群增殖，故這兩種樣地的厭氧繩菌綱(Anaerolineae)相對豐度較高。

4 結 論

(1) 相近水淹高程下，三峽庫區消落帶不同修復植被類型樣地土壤pH值、TN和TP含量無明顯差別，其中經長期淹沒—露出周期后不同樣地土壤的pH值均接近中性。

(2) 相近水淹高程下，三峽庫區消落帶不同修復植被類型樣地土壤的細菌群落豐富度和多樣性無明顯差異。3種樣地土壤的細菌群落優勢種群基本一致，其中變形菌門和酸桿菌門約占門水平土壤細菌豐度的52%以上，γ-變形菌綱、α-變形桿菌綱、δ-變形菌綱和芽單胞菌綱等約占綱水平土壤細菌豐度的30%左右。

(3) 消落帶土壤細菌在屬水平的多個優勢種群與土壤SOC和TN顯著相關(p<0.05)，其中SOC是三峽庫區消落帶土壤細菌群落的主要影響因子(p<0.05)，這可能與不同修復植被類型可提供的有機質數量有關。