不同發(fā)育階段、不同質(zhì)量囊胚冷凍復蘇移植周期妊娠結(jié)局分析

李澎濤，殷晨星，王 娜，邢 鵬，孟娜娜，郭戰(zhàn)坤

(河北省保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學科，河北 保定 071000)

隨著囊胚培養(yǎng)及玻璃化冷凍技術(shù)的出現(xiàn)及發(fā)展，明顯提高了患者凍融胚胎移植周期妊娠率及胚胎著床率[1]，因此囊胚凍融移植在很多生殖中心得到廣泛應用。那么如何在凍融周期選擇更具有發(fā)育潛能的囊胚進行移植是一個目前有待解決的問題。依據(jù)Gardner囊胚分級法[2]囊胚擴張程度及孵出程度分期為1～6期，依據(jù)內(nèi)細胞團(inner cell mass,ICM)、滋養(yǎng)層(trophoderm,TM)細胞數(shù)多少及緊密程度分級為A、B、C三級。大多生殖中心對3期以上，ICM或TM評級不同時為C的囊胚進行冷凍或移植，而就選擇哪一時期，什么質(zhì)量的囊胚移植能夠獲得更好的妊娠結(jié)局目前具有爭議。有的研究認為孵出囊胚缺乏透明帶的保護，在移植過程中容易造成滋養(yǎng)層連接斷裂致使囊胚腔液外流，導致妊娠率、著床率的降低[3]，也有研究認為孵出囊胚更易著床[4]。高質(zhì)量囊胚能夠獲得更高的妊娠率、著床率[5-7]，然而就ICM及TM哪一個對胚胎的著床更重要，亦沒有定論。本研究回顧分析了2015年1月—2019年10月在保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學科接受單囊胚FET周期的患者資料，比較相同質(zhì)量不同發(fā)育階段、相同發(fā)育階段不同質(zhì)量囊胚FET周期妊娠結(jié)局差異，探討囊胚的發(fā)育階段、囊胚質(zhì)量對單囊胚FET周期的著床率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率等指標的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2015年1月—2019年10月在保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學科接受單囊胚FET周期的患者資料。納入標準：①單囊胚FET周期；②女方年齡20～35歲；③女方體重指數(shù)(body imass index,BMI)18～25；④雙方均無遺傳性疾病；⑤采用自然周期或人工周期內(nèi)膜準備方案。排除標準：①子宮畸形患者；②子宮內(nèi)膜異位癥患者。

1.2囊胚選擇及凍融移植 依據(jù)Gardner囊胚分級法[2]對囊胚進行評價，選擇3期以上且滋養(yǎng)層或內(nèi)細胞團評級不同時為C的囊胚冷凍保存。

優(yōu)質(zhì)囊胚：根據(jù)Gardner評分標準，3期及3期以上且內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層評分不含C的囊胚；非優(yōu)質(zhì)囊胚：3期及3期以上內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層中含有一個C級評分的囊胚。

囊胚的冷凍及解凍試劑為日本Kitazato公司的冷凍/解凍套裝，冷凍載體為日本加藤冷凍載桿Cryotop。冷凍前對囊胚進行激光打孔皺縮，在37 ℃、6%CO2培養(yǎng)箱放置5～10 min，待囊胚進一步皺縮后，按照冷凍/解凍套裝說明書操作步驟對囊胚進行冷凍及解凍。復蘇后對3/4期囊胚進行激光輔助孵化，在37 ℃、6%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 h，觀察囊胚擴張情況，部分或完全擴張為存活胚胎。

使用PICC移植管一段式裝管后超聲引導下將復蘇囊胚移植至子宮腔中后部。移植后35 d腹部超聲下見孕囊及胎心為臨床妊娠。

1.3內(nèi)膜準備 采用人工周期、自然周期進行內(nèi)膜準備。人工周期,在周期第2～4天開始口服17β雌二醇或戊酸雌二醇4 mg，至第7天開始陰道超聲監(jiān)測子宮內(nèi)膜發(fā)育。當子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm，且雌激素最少應用14 d，開始加用孕酮，第1天和第2天黃體酮針20 mg、地屈孕酮20 mg，第3天起一直應用黃體酮40 mg、黃體酮膠囊400 mg、地屈孕酮20 mg。如內(nèi)膜準備好后開始進行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，應用孕激素內(nèi)膜轉(zhuǎn)化后第6天解凍移植囊胚期胚胎移植。自然周期,在自然周期第8～10天開始超聲監(jiān)測卵泡發(fā)育。卵泡直徑<10 mm，隔2日超聲監(jiān)測一次，卵泡直徑10～14 mm時，隔日監(jiān)測一次，優(yōu)勢卵泡直徑>14 mm，每日監(jiān)測一次，并同時檢測血LH、E2、P及尿LH。連續(xù)血激素、尿LH檢測提示LH峰出現(xiàn)后24～36 h為排卵時間，超聲監(jiān)測至排卵，于排卵后4 d解凍囊胚期胚胎移植。

1.4研究分組 由于3期囊胚移植周期數(shù)據(jù)少，本研究僅對4～6期囊胚進行了分組研究。依據(jù)囊胚擴張/孵出狀態(tài)及質(zhì)量將囊胚分為A1組(4期優(yōu)質(zhì)囊胚組)、A2(4期非優(yōu)質(zhì)囊胚組)、B1組(5期優(yōu)質(zhì)囊胚組)、B2組(5期非優(yōu)質(zhì)囊胚組)、C1組(6期優(yōu)質(zhì)囊胚)、C2組(6期非優(yōu)質(zhì)囊胚)。

1.5觀察指標及判定標準 臨床妊娠率=超聲下能檢測到孕囊的妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；著床率=超聲下檢測到的孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%，活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

1.6統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用單因素方差分析，若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗進行比較。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1不同發(fā)育階段優(yōu)質(zhì)囊胚FET周期妊娠結(jié)局比較 依據(jù)囊胚擴張狀態(tài)不同，比較4～6期各階段優(yōu)質(zhì)囊胚324個FET周期妊娠結(jié)局的情況，其中A1組148周期、B1組66周期、C1組110周期。各組間患者年齡、不孕年限、BMI、既往周期數(shù)、FET內(nèi)膜準備方案和移植日子宮內(nèi)膜厚度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。臨床結(jié)局，優(yōu)質(zhì)胚胎組，A1組FET周期的妊娠率、著床率顯著高于B1組(P<0.05)，A1與C1組FET周期的妊娠率、著床率差異無統(tǒng)計學意義，但C1組的妊娠率、著床率有下降趨勢； A1、B1、C1 3組FET周期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、男/女比例、孕周及新生兒體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 優(yōu)質(zhì)囊胚FET周期各組患者基本情況比較Table 1 Comparison of basic condition of patients in each group with high quality blastocysts during FET cycle of

表2 優(yōu)質(zhì)囊胚FET周期患者妊娠結(jié)局情況比較Table 2 Comparison of pregnancy outcome in patients with high quality blastocysts during FET cycle

2.2不同發(fā)育階段非優(yōu)質(zhì)囊胚FET周期妊娠結(jié)局比較 依據(jù)囊胚擴張狀態(tài)不同，比較4～6期各階段非優(yōu)質(zhì)囊胚組255個FET周期妊娠結(jié)局的情況，其中A2組141周期、B2組52周期、C2組62周期。各組間患者年齡、不孕年限、BMI、既往周期數(shù)、FET內(nèi)膜準備方案和移植日子宮內(nèi)膜厚度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。臨床結(jié)局，A2、B2、C2三組FET周期妊娠率、著床率，流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、男/女比例、孕周及新生兒體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

表3 非優(yōu)質(zhì)囊胚FET周期各組患者基本情況比較Table 3 Comparison of basic conditions of patients with non-high-quality blastocysts in each group during FET cycle

表4 非優(yōu)質(zhì)囊胚FET周期患者妊娠結(jié)局情況比較Table 4 Comparison of pregnancy outcome in patients with non-high-quality blastocyst during FET cycle

2.3相同發(fā)育階段不同質(zhì)量囊胚FET周期妊娠結(jié)局比較 依據(jù)囊胚內(nèi)細胞團及滋養(yǎng)層質(zhì)量的不同，比較4～6期相同發(fā)育階段優(yōu)質(zhì)囊胚與非優(yōu)質(zhì)囊胚臨床結(jié)局的差異。患者基本情況，各組間患者年齡、不孕年限、BMI、既往周期數(shù)、FET內(nèi)膜準備方案和移植日子宮內(nèi)膜厚度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5。臨床結(jié)局，A1組FET的臨床妊娠率、著床率、活產(chǎn)率高于A2組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而流產(chǎn)率、孕周數(shù)及新生兒體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。B1組與B2組、C1組與C2組FET的臨床妊娠率、著床率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、男/女比例、孕周數(shù)、新生兒出生體重差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表6。

表5 相同發(fā)育階段不同質(zhì)量囊胚FET周期患者基本情況比較Table 5 Comparison of basic conditions of patients with blastocysts of different quality and at the same developmental stage during FET cycle

表6 相同發(fā)育階段不同質(zhì)量囊胚FET周期患者妊娠結(jié)局情況比較Table 6 Comparison of pregnancy outcomes of patients with blastocysts of different quality and at the same developmental stage during FET cycles

3 討 論

目前囊胚的冷凍大多數(shù)中心采用玻璃化冷凍，但胚胎的冷凍過程會造成透明帶的硬化，導致囊胚的孵化障礙，影響胚胎的著床。輔助孵化技術(shù)的應用使凍融周期移植前的70%囊胚處于正在孵出或已經(jīng)孵出狀態(tài)[4]，能夠顯著改善凍融胚胎移植后的妊娠率及著床率[8]，尤其對于質(zhì)量差、發(fā)育速度慢的囊胚，輔助孵化能夠顯著提高胚胎移植后的著床率[9]。薛林濤等[10]利用Time-lapse系統(tǒng)觀察比較輔助孵化和未輔助孵化凍融囊胚發(fā)現(xiàn)進行了輔助孵化的囊胚的囊胚孵出率、完全孵出率及 U 型孵出率均顯著高于未輔助孵化的囊胚，同時后者8字型孵出率顯著升高。目前用于冷凍的囊胚多為3～6期，至于哪個階段凍融后能夠獲得更好的妊娠結(jié)局，仍存在一定的爭議。筆者回顧分析了2015—2019年間在我院接受FET治療579周期患者資料，通過比較相同質(zhì)量不同發(fā)育階段囊胚FET周期妊娠結(jié)局差異及相同發(fā)育階段不同質(zhì)量囊胚FET周期妊娠結(jié)局的差異，分別探討囊胚的發(fā)育階段及質(zhì)量對囊胚FET周期妊娠結(jié)局的影響。

Zhao等[9]通過將IVF-ET及FET周期單囊胚移植妊娠患者與未妊娠患者對比發(fā)現(xiàn)，妊娠組的囊胚擴張程度顯著高于未妊娠組囊胚擴張程度，因此研究認為囊胚的擴張程度是預測單囊胚移植妊娠結(jié)局的一項重要指標尤其在FET周期。秦祖興等[11]比較新鮮單囊胚移植周期4～6期囊胚組與3期囊胚組的妊娠結(jié)局差異，發(fā)現(xiàn)前者的臨床妊娠率及著床率顯著高于后者，這與Marren等[12]的結(jié)果一致，此研究認為擴張期囊胚的臨床結(jié)局顯著優(yōu)于早期囊胚，同樣Du等[13]的研究亦證實相較于3囊胚，4/5期囊胚具有更強的著床潛能。但郭娜等[14]通過分析2 593例新鮮周期及復蘇周期的單囊胚移植妊娠結(jié)局的分析，發(fā)現(xiàn)3～6期各階段囊胚的臨床妊娠率、著床率、早期流產(chǎn)率及活產(chǎn)率各項參數(shù)之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這與朱序理等[15]的的結(jié)果相近，此研究通過回顧分析囊胚的擴張程度、滋養(yǎng)層及內(nèi)細胞團質(zhì)量對凍融周期妊娠結(jié)局的影響，建立優(yōu)選單囊胚順序的方案發(fā)現(xiàn)囊胚擴張程度與臨床妊娠率沒有相關(guān)性。在本研究中非優(yōu)質(zhì)囊胚組不同擴張程度囊胚間的妊娠結(jié)局各項指標均無顯著性差異，但優(yōu)質(zhì)囊胚組4期囊胚的妊娠率、著床率顯著高于其余各組囊胚的妊娠率、著床率，分析原因可能是由于孵出囊胚缺乏透明帶保護導致囊胚在凍融過程中易受到損傷，因此建議囊胚培養(yǎng)過程中增加囊胚的觀察次數(shù)，減少孵出囊胚的冷凍。

那么囊胚的發(fā)育階段是否為預測囊胚發(fā)育潛能獨立因素呢？在Zhao等[9]的研究中FET周期妊娠組囊胚擴張程度高于未妊娠組，而囊胚的滋養(yǎng)層及內(nèi)細胞團等級2組間差異無統(tǒng)計學意義，此研究認為囊胚的擴張程度是預測臨床妊娠結(jié)局的一項重要參數(shù)，而且囊胚的擴張程度在一定程度上反映了細胞數(shù)的多少，擴張程度越大細胞數(shù)也越多，因此在FET周期胚胎選擇時應優(yōu)先考慮囊胚的擴張狀態(tài)。但在張建瑞等[16]的最新研究中無論是在新鮮移植周期還是復蘇移植周期，優(yōu)質(zhì)囊胚的妊娠率、著床率均顯著高于非優(yōu)質(zhì)囊胚的妊娠率及著床率，而囊胚的質(zhì)量對妊娠后不良產(chǎn)科及圍產(chǎn)期結(jié)局沒有影響。有研究[17]表明非優(yōu)質(zhì)囊胚的非整倍體率顯著高于優(yōu)質(zhì)囊胚，孫慶云等[18]認為囊胚的非整倍體率與囊胚的發(fā)育天數(shù)及擴張程度顯著相關(guān)，而與內(nèi)細胞團及滋養(yǎng)層的評級無顯著相關(guān)性，但亦有報道[19]不同質(zhì)量外滋養(yǎng)層囊胚的整倍體率間無顯著差異，而囊胚的分期和內(nèi)細胞團評級是囊胚整倍體率影響因素。Stephenson等[20]對285對復發(fā)性流產(chǎn)夫婦的420份標本進行核型分析發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)率與胚胎的非整倍體率密切相關(guān)。Subira等[21]的報道顯示C級內(nèi)細胞團囊胚移植活產(chǎn)率比A級內(nèi)細胞團囊胚移植活產(chǎn)率下降了55%，而且C級囊胚內(nèi)細胞團囊胚移植的流產(chǎn)率顯著高于A/B級內(nèi)細胞團囊胚移植的流產(chǎn)率，而滋養(yǎng)層的質(zhì)量對妊娠結(jié)局沒有影響。但亦有報道[22-24]認為滋養(yǎng)層在胚胎著床的過程中更重要，Chen等[22]分析了263個單囊胚移植復蘇周期的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)A/B級滋養(yǎng)層囊胚的妊娠率、著床率及活產(chǎn)率顯著高于C級滋養(yǎng)層囊胚的妊娠率、著床率及活產(chǎn)率，而不同質(zhì)量內(nèi)細胞團的囊胚間并無這些差異。本研究中就相同發(fā)育階段優(yōu)質(zhì)囊胚與非優(yōu)質(zhì)囊胚移植的妊娠結(jié)局進行比較，以排除囊胚的擴張及孵出狀態(tài)對結(jié)局造成的影響，結(jié)果顯示4期優(yōu)質(zhì)單囊胚移植的妊娠率、著床率顯著高于4期非優(yōu)質(zhì)單囊胚移植的妊娠率、著床率、活產(chǎn)率，但兩者在流產(chǎn)率、孕周及新生兒體重等參數(shù)間差異無統(tǒng)計學意義，5、6期優(yōu)質(zhì)與非優(yōu)質(zhì)囊胚間的妊娠率、著床率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、孕周及新生兒體重等參數(shù)間差異無統(tǒng)計學意義，這與倪曉蓓等[25]的研究結(jié)果相似。由于目前的囊胚評級主要依據(jù)囊胚的形態(tài)學特征進行判斷，具有很強的主觀性，造成在滋養(yǎng)層及內(nèi)細胞團評級上可能存在一定的差異，對妊娠結(jié)局的影響也有所不同。

綜上所述，囊胚的發(fā)育階段及滋養(yǎng)層/內(nèi)細胞團質(zhì)量均都對復蘇周期單囊胚移植的妊娠結(jié)局有一定的影響，本研究中4期優(yōu)質(zhì)囊胚復蘇周期妊娠率、著床率顯著高于其余各組，因此在復蘇胚胎選擇時應予以優(yōu)先考慮，從而提高移植效率，使患者利益最大化。但由于本研究數(shù)據(jù)量偏少，因此結(jié)論存在一定的局限性，有待更多數(shù)據(jù)的研究。