細(xì)胞外囊泡在肺部疾病診斷中的應(yīng)用

楊晟楠，張 力(綜述)，石 瑜，趙 勇*(審校)

(1.天津市胸科醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，天津 300222；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，天津 300052)

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是由細(xì)胞自然分泌的磷脂雙層膜包圍并且缺乏功能性核的結(jié)構(gòu)，是多種亞型的集體術(shù)語(yǔ)，包括外泌體、微囊泡、微粒、凋亡小體和許多其他名稱[1]。外泌體是細(xì)胞膜內(nèi)陷形成的多泡體(multivesicular body，MVB)與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外空間的膜性囊泡，直徑在40～150 nm[2]。微囊泡(microvesicles,MVs)大小不一，直徑在100～1 000 nm,從細(xì)胞膜出芽脫落[3]。這些納米大小的囊泡包含蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，信使RNA(messenger RNA，mRNA)，微小RNA(microRNA)，非編碼RNA(lncRNA)和線粒體[4]。對(duì)于特定的細(xì)胞外囊泡，目前很難確定其具體的生物發(fā)生途徑，所以本篇綜述中將使用國(guó)際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)推薦的術(shù)語(yǔ)EV[5]。EVs由各種不同的細(xì)胞類型釋放，包括免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞)和結(jié)構(gòu)細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞)[6-7]。由于來(lái)源的多樣性，EVs可以在多種體液中檢測(cè)到，包括血液、尿液、唾液、母乳、羊水、胸腹水、精液、腦脊液和其他體液[3,8]。此外，在呼出氣和支氣管肺泡灌洗液中也發(fā)現(xiàn)了EV的存在[9-10]。EVs通過(guò)其攜帶的生物活性物質(zhì)向受體細(xì)胞傳遞復(fù)雜的生物信息集從而調(diào)節(jié)其行為，是細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵介質(zhì)[11]。通過(guò)這種方式，EVs參與了多種肺部疾病的病理發(fā)展和進(jìn)程，并且在疾病狀態(tài)下釋放的EVs數(shù)量、類型和攜帶物質(zhì)是不同的，這表明EVs具有作為診斷和預(yù)后的新型生物標(biāo)志物的潛力。

1 EVs的內(nèi)容物

通過(guò)各種高通量測(cè)序分析平臺(tái)，可以深入了解了EVs攜帶的分子內(nèi)容。由于這些技術(shù)需要大量的EVs，因此大多數(shù)分析研究都是基于細(xì)胞系分泌的EVs進(jìn)行的。ExoCarta(www.exocarta.org)是一個(gè)專門用于編目EVs內(nèi)容物的數(shù)據(jù)庫(kù)[12]，目前已確定了超過(guò)9 000種不同的蛋白質(zhì)，3 408種mRNA，2 838種miRNA，1 116種脂質(zhì)。與細(xì)胞RNA片段相比，EV轉(zhuǎn)運(yùn)的RNAs通常較短(通常<200個(gè)核苷酸，但可以延伸至5 kb)。它們主要是非編碼RNA(ncRNA)，包括微小RNA(miRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、以及長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)和大部分片段化的mRNA[13]。非編碼RNA(ncRNA)不編碼蛋白質(zhì)，而是在多種遺傳機(jī)制中起作用，例如調(diào)節(jié)RNA的結(jié)構(gòu)，表達(dá)和穩(wěn)定性，以及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的翻譯和功能。這些核酸分子存在于EVs中免受核糖核酸酶降解，使其成為強(qiáng)有力的循環(huán)生物標(biāo)志物。近年來(lái)，EVs中的ncRNA已成為研究的新焦點(diǎn)。

2 EVs在肺部疾病診斷中的應(yīng)用

2.1急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respira-tory distress syndrome，ARDS) ALI/ARDS是一種由肺內(nèi)或肺外原因?qū)е碌膹?fù)雜的臨床異質(zhì)性綜合征。ALI/ARDS病理生理學(xué)特征為不受控制的肺泡炎癥反應(yīng)，肺泡-毛細(xì)血管屏障功能嚴(yán)重受損，有效通氣肺組織減少及肺順應(yīng)性下降[14]。目前能夠達(dá)成共識(shí)的有效治療策略僅限于保護(hù)性肺通氣，而藥物治療并沒(méi)有明顯降低ARDS的病死率(ARDS的病死率介于34.9%～46.1%之間)[15]。所以當(dāng)前迫切需要鑒定出一種或幾種生物標(biāo)志物用來(lái)監(jiān)測(cè)疾病的活動(dòng)狀態(tài)，以便指導(dǎo)臨床治療。Letsiou等[16]研究表明，在ALI的小鼠模型中，內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的微囊泡水平升高。蛋白組學(xué)分析顯示，血漿和支氣管肺泡灌洗液中CD62E陽(yáng)性的微囊泡較對(duì)照組升高。這些內(nèi)皮細(xì)胞微囊泡可能作為ALI的診斷型生物標(biāo)志物。另一項(xiàng)臨床前研究表明，在鹽酸誘導(dǎo)的ALI小鼠模型的支氣管肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid,BALF)中，可以檢測(cè)到大量上皮細(xì)胞來(lái)源的微囊泡。通過(guò)q-PCR技術(shù)證實(shí)在這些微囊泡中miR-17和miR-221水平升高。miR-17/miR-221促進(jìn)了β1整合蛋白的再循環(huán)并通過(guò)RAB11介導(dǎo)的途徑來(lái)促進(jìn)巨噬細(xì)胞募集，最終導(dǎo)致肺部損傷[17]。在高濃度氧誘導(dǎo)的ALI小鼠模型的BALF中，同樣可以檢測(cè)到大量上皮細(xì)胞來(lái)源的微囊泡，通過(guò)q-PCR技術(shù)證實(shí)在這些微囊泡中miR-320a和miR-221水平升高[18]。故BALF中上皮細(xì)胞來(lái)源的微囊泡miRNA可以作為ALI早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。在臨床方面，一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究表明，危重患者血漿中微囊泡水平的升高與ARDS風(fēng)險(xiǎn)的降低獨(dú)立相關(guān)[19]。在另一項(xiàng)臨床研究中，共納入158例ARDS患者，結(jié)果顯示患者肺泡間隙中存在大量外泌體，BALF中外泌體的水平與患者的氧合指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，感染性病因引起ARDS的外泌體水平高于非感染性ARDS患者。但是ARDS患者中外泌體增加的原因尚不清楚，目前尚無(wú)法區(qū)分是與治療相關(guān)的高氧或本身缺氧所致，并且需要進(jìn)一步的研究來(lái)鑒定外泌體的組成[20]。

2.2特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF) IPF是一種慢性進(jìn)行性間質(zhì)性肺疾病，其肺組織學(xué)和胸部高分辨率CT特征表現(xiàn)為普通型間質(zhì)性肺炎[21]。IPF病因尚不明確，發(fā)病機(jī)制也未完全闡明，目前認(rèn)為肺泡上皮細(xì)胞損傷和異常修復(fù)是導(dǎo)致肺纖維化的主要機(jī)制[22]。該病預(yù)后差，在65歲以上患者中，確診后的平均生存期僅為3.8年[23]。由于發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)制不明，目前的治療手段以減輕癥狀、改善患者病情為主，并且在疾病的早期診斷，評(píng)估病情進(jìn)展及判斷預(yù)后等方面，缺乏有價(jià)值的生物標(biāo)志物。Martin-Medina等[24]研究發(fā)現(xiàn)，IPF患者支氣管肺泡灌洗液中EVs較非IPF的間質(zhì)性肺病以及非間質(zhì)性肺病患者明顯增加,增加的EV在IPF中充當(dāng)信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)(如WNT5A)的載體，促進(jìn)了疾病的發(fā)生發(fā)展。Makiguchi等[25]通過(guò)microRNA PCR陣列的方法檢測(cè)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型發(fā)現(xiàn)，血清EV中miR-21-5p在急性炎癥期和慢性纖維化期均升高。在同步進(jìn)行的臨床研究中發(fā)現(xiàn)IPF患者的血清EV miR-21-5p明顯高于健康對(duì)照組。該研究還發(fā)現(xiàn)，血清EV miR-21-5p水平與6個(gè)月肺活量下降速率相關(guān)，并且與隨后30個(gè)月的病死率獨(dú)立相關(guān)。這些結(jié)果表明miR-21-5p有可能成為IPF早期診斷及用來(lái)判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物。另外，Njock等[26]研究發(fā)現(xiàn)IPF患者與健康對(duì)照組相比，痰液中外泌體miRNA含量存在差異，并確定miR-142-3P、miR-33a-5p和Let-7d-5p具有臨床意義。這其中miR-142-3P與肺彌散功能呈負(fù)相關(guān)，從而為IPF的診斷和病情評(píng)估提供了新的候選生物標(biāo)志物。目前關(guān)于外泌體在IPF中的研究還非常有限，需要更多的研究來(lái)鑒定出用于早期診斷和評(píng)價(jià)預(yù)后的生物標(biāo)志物。

2.3肺癌 肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[27]。由于缺乏有效的早期診斷方法，絕大多數(shù)患者在確診時(shí)已處于晚期，5年存活率僅為16%～18%[28]。因此需要尋找一種安全易行且準(zhǔn)確率高的檢測(cè)方法來(lái)進(jìn)行早期診斷。近年來(lái)，液體活檢由于其侵襲性最小、試劑消耗低和易于使用，已被廣泛研究并日益流行[29]，彌補(bǔ)了組織活檢的不足，成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的診斷技術(shù)之一[30]。一項(xiàng)回顧性分析表明，血漿外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，與良性肺結(jié)節(jié)組相比，惡性肺結(jié)節(jié)組的纖維蛋白原β鏈(fibrinogen beta chain,FGB)和纖維蛋白原γ鏈(fibrinogen gamma chain,FGG)的表達(dá)明顯升高，并且FGB結(jié)合FGG檢測(cè)確定肺結(jié)節(jié)性質(zhì)的靈敏度優(yōu)于單FGB或FGG檢測(cè)，上述結(jié)果表明FGB和FGG可成為新型的生物標(biāo)志物用來(lái)區(qū)分良、惡性肺結(jié)節(jié)[31]。Zhang等[32]比較了健康受試者和非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell carcinoma,NSCLC)患者的血清外泌體lncRNA水平，發(fā)現(xiàn)外泌體lncRNA MALAT-1在NSCLC患者中高表達(dá)，并且MALAT-1的水平與腫瘤的分期及預(yù)后呈正相關(guān)。該研究進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)肺癌細(xì)胞Annexin/V的表達(dá)，證實(shí)了lncRNA MALAT-1可以防止腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。該研究結(jié)果表明，外泌體中的lncRNA MALAT-1可以作為一種非侵襲性的基于血清的腫瘤生物標(biāo)志物用于NSCLC的診斷和預(yù)后。Jin等[33]比較了I期NSCLC患者和健康對(duì)照者的血漿外泌體miR譜，發(fā)現(xiàn)miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p在腺癌中特異性表達(dá)，而miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b在鱗狀細(xì)胞癌中特異性表達(dá)，這表明腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體miR可以作為肺癌早期診斷的生物標(biāo)志物。在另一項(xiàng)臨床研究中發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，在NSCLC患者的血漿外泌體中有6種差異表達(dá)的miR，分別為：miR-17-5p、miR-18a-5p、miR-19a-3p、miR-19b-1-5p、miR-20a-5p、miR-92a-1-5p。將這6種差異表達(dá)的miR與三種腫瘤標(biāo)志物(癌胚抗原CEA、細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1、鱗狀細(xì)胞癌抗原SCCA)在兩個(gè)獨(dú)立的隊(duì)列(訓(xùn)練集：100例NSCLC和90例健康對(duì)照者；驗(yàn)證集：72例NSCLC和47例健康對(duì)照者)中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果表明miR-17-5p與CEA、CYFRA21-1、SCCA組成的體外診斷小組，在訓(xùn)練集中ROC曲線下面積為0.860，95%CI：0.802～0.906，敏感度63.0%，特異度93.3%；在驗(yàn)證集中ROC曲線下面積為0.844，95%CI：0.766～0.904，敏感性76.4%，特異性76.6%。這表明miR-17-5p與CEA、CYFRA21-1、SCCA組成的診斷小組對(duì)NSCLC的診斷具有重要的臨床意義[34]。

2.4肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH) PAH是由肺小動(dòng)脈原發(fā)病變或其他原發(fā)疾病導(dǎo)致的肺動(dòng)脈壓力升高，以肺動(dòng)脈重構(gòu)和肺血管阻力升高為特征，最終可導(dǎo)致右心功能衰竭甚至死亡[35]。PAH診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是右心導(dǎo)管檢查，這項(xiàng)侵襲性檢查對(duì)患者來(lái)說(shuō)具有很大的風(fēng)險(xiǎn)，所以研究人員一直致力于尋找循環(huán)中易于獲取的生物標(biāo)志物。雖然心房鈉尿肽(BNP或NT-pro BNP)作為評(píng)價(jià)心室病理生理學(xué)變化的指標(biāo)被廣泛應(yīng)用，但是直到后期損傷發(fā)生之前該標(biāo)志物的變化并不明顯。因此需要借助新的生物標(biāo)志物進(jìn)行疾病的早期診斷。在一項(xiàng)早期研究中，Amabile等[36]發(fā)現(xiàn)PAH患者外周血中外泌體含量明顯高于健康對(duì)照組。在隨后進(jìn)行的另一項(xiàng)臨床研究中，將慢性血栓栓塞性PAH患者與健康對(duì)照組相比較，同樣發(fā)現(xiàn)血漿中外泌體的水平明顯升高[37]。但仍需進(jìn)一步研究以明確這些外泌體中特征性表達(dá)的蛋白或核酸。最近的一項(xiàng)研究表明，翻譯控制的腫瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)是一種促增殖和抗凋亡的調(diào)節(jié)因子，在PAH大鼠模型的肺和血漿外泌體中TCTP明顯升高。與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，與健康對(duì)照組相比，特發(fā)性PAH患者BOECs(blood outgrowth endothelial cells)釋放的外泌體中腫瘤蛋白明顯升高，該研究提示外泌體中的TCTP有可能成為PAH的潛在診斷性生物標(biāo)志物[38]。在評(píng)價(jià)疾病進(jìn)展和判斷預(yù)后等方面，Lipps等[39]研究顯示，將慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者與健康對(duì)照組比較，通過(guò)下一代測(cè)序和q-PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)血清外泌體中小分子非編碼RNA(sncRNA)的差異表達(dá)，共鑒定出10種miR和21種piRNA。通過(guò)進(jìn)一步生信分析證實(shí)，piRNA DQ593039的表達(dá)水平與平均肺動(dòng)脈壓、肺血管阻力、右心室收縮壓和NT-pro BNP具有相關(guān)性。因此外泌體衍生的piRNA DQ593039可以作為評(píng)價(jià)PAH病情進(jìn)展和判斷預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。

2.5肺結(jié)核 據(jù)世衛(wèi)組織報(bào)道結(jié)核病已經(jīng)超過(guò)艾滋病成為全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的傳染病[40]，造成這種局面的主要原因在于難以對(duì)結(jié)核病患者進(jìn)行早期診斷，這也使得尋找結(jié)核病相關(guān)的診斷標(biāo)志物顯得尤為重要。Lyu等[41]研究顯示，與健康者相比，結(jié)核病患者存在差異表達(dá)的血清外泌體miR譜，并且其中一些miR被進(jìn)一步證實(shí)可以在潛伏性結(jié)核病感染(latent TB infection,LTBI)中特異性表達(dá)，為結(jié)核病的早期診斷提供了新的視角。另一項(xiàng)臨床研究顯示，結(jié)核病患者血清外泌體中miR-484、miR-425和miR-96的表達(dá)明顯升高，并與結(jié)核感染程度相關(guān)，證實(shí)了外泌體中的miR可以作為評(píng)價(jià)病情的潛在指標(biāo)[42]。Wang等[43]報(bào)告了三種EVs攜帶的miRNAs，包括miR-148a-3p、miR-451a和miR-150-5p在結(jié)核病胸腔積液和良性病變胸腔積液間的差異表達(dá)。全球結(jié)核病的疫情急需快速簡(jiǎn)便、高敏感性和特異性的新診斷方法，因此將EVs應(yīng)用于診斷生物標(biāo)志物的開發(fā)是有希望的。

2.6其他 結(jié)節(jié)病是一種多系統(tǒng)疾病，在表現(xiàn)和預(yù)后方面存在異質(zhì)性。Martinez-Bravo等[44]利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)結(jié)節(jié)病患者BALF中EVs進(jìn)行了蛋白組學(xué)分析，鑒定出690多種蛋白質(zhì)，包括幾種上調(diào)的炎癥相關(guān)蛋白質(zhì)，為疾病診斷提供了新穎的方法。另一項(xiàng)獨(dú)立的研究表明，結(jié)節(jié)病患者的BALF中的EV數(shù)量增加，并且差異表達(dá)miR-146a和miR-150，其表達(dá)與肺功能指數(shù)呈負(fù)相關(guān)[45]。

3 小結(jié)與展望

EVs作為細(xì)胞間傳遞信息的載體，其在呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用已有初步研究。作為納米級(jí)的生物膜結(jié)構(gòu)，EVs能夠很好的保護(hù)內(nèi)容物的完整性和生物活性，這些優(yōu)勢(shì)極大的提升了EVs在呼吸系統(tǒng)疾病診斷方面應(yīng)用的可行性。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的提出，越來(lái)越多的人開始關(guān)注如何做到疾病的精確診斷和治療。循環(huán)EVs的數(shù)量和類型根據(jù)肺部疾病的狀態(tài)而變化，EVs攜帶的物質(zhì)，如miRNA、lncRNA等也會(huì)隨疾病狀態(tài)而改變，其有望成為肺部疾病的診斷性生物標(biāo)志物。EVs中含有多種生物活性物質(zhì)，目前研究多集中于非編碼RNA，對(duì)于EVs的蛋白組學(xué)和脂類研究較少，這些內(nèi)含物對(duì)機(jī)體的作用有待進(jìn)一步研究證實(shí)。未來(lái)還需進(jìn)一步優(yōu)化EVs的分離和純化技術(shù)，以便為后續(xù)的鑒定和功能研究提供良好的基礎(chǔ)。