垃圾中轉站春、夏季空氣細菌群落多樣性分析

許麗娟，吳民熙*，雷建華，王 震，劉 標，喻孟元，杜東霞

（1.湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009；2.湖南省嘉禾縣農業農村局，湖南 嘉禾 424500）

0 引言

隨著我國城鎮化進程的加快，城市生活垃圾的產生量也在不斷增加。據統計，2019年我國城市生活垃圾產生量達到了3.43億t［1］。垃圾在堆放過程中不斷被腐化分解，不僅散發出氨氣、硫化氫、甲硫醇等惡臭氣體［2］，而且垃圾中還存有大量對人和動物有害的細菌、真菌、病毒和寄生蟲,這些有害代謝產物和有害微生物會隨著垃圾的收集、清理、轉運接收等作業活動而擴散、傳播到周圍的大氣環境中，形成微生物氣溶膠或有毒氣體，再通過呼吸道、消化道和皮膚等通道侵入人類的肌體，嚴重危害作業人員和周圍居民的身體健康［3］。微生物氣溶膠作為大氣氣溶膠的重要組成部分，不僅會影響公眾的身體健康，還可以作為云凝結核(cloud condensation，CCN)［4］和冰核(ice nuclei，IN)［5］對當地和全球范圍內的生態和氣候產生重大影響，因此，研究微生物氣溶膠對了解人類的健康狀況和氣候變化是很有必要的［6-7］，當今微生物氣溶膠也成為了科學家們研究的焦點。

分布在城市角落里的垃圾中轉站是生活垃圾堆放與轉運的主要場所。但是迄今利用高通量測序技術分析垃圾中轉站空氣中可培養細菌群落基因組DNA、群落結構、基因多樣性等的研究較少。鑒于此，筆者采用第3代基因組測序技術分析了垃圾中轉站及周圍空氣中細菌群落結構和多樣性，探討了環境溫度、相對濕度等氣象因子對細菌氣溶膠的影響，同時對垃圾站內空氣中的優勢細菌菌株進行了分離和鑒定，以期為評價垃圾中轉站空氣質量提供基礎數據，并為城市生活垃圾中轉站微生物氣溶膠的綜合治理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 采樣地點的選取及取樣點的設置

選取小型壓縮垃圾轉運站作為研究對象，轉運站面積為20 m2左右，處于半封閉狀態，其配置1臺臥式垃圾壓縮機，額定裝載垃圾量為10 t；垃圾清運頻率均為1次/d，垃圾收運量約為10 t/d。在垃圾站的北面是公路，距離垃圾站20 m；在垃圾站的南面是居民區，距離垃圾站50 m。圖1中的數字1、2、3為取樣地點代號，分別為公路邊、垃圾站、居民區。

圖1 采樣點示意圖

1.2 空氣微生物的采集和培養

樣品采集在春季和夏季（4—8月）這5個月進行，每個月取樣1 d，取樣時間為9：00～11：00，每個采樣點每次采集2組平行樣品。2個Andersen-6級撞擊式空氣微生物采樣器（由中國金壇某公司生產）同時工作，收集垃圾中轉站及附近區域空氣中的生物氣溶膠顆粒。該采樣器共有6級，第1級直徑＞7.0 μm，第2級直徑4.7～7.0 μm，第3級直徑3.3～4.7 μm，第4級直徑2.1～3.3 μm，第5級直徑1.1～2.1 μm，第6級直徑0.65～1.10 μm。在每級篩板下面放置1個直徑為90 mm、帶有LB培養基的玻璃培養皿。抽吸泵將流量為28.3 L/min的氣流送至各級，空氣流速逐級增大，從而把空氣中的帶菌粒子按粒徑的大小分別捕獲到各級培養皿上。空氣采樣器距離地面1.5 m（約為人體呼吸的高度）。每次取樣3 min，當吸入的空氣量達到所需值時，逐級取出培養皿，將其迅速密封后放入樣品箱，帶回實驗室，置于（37±2）℃的培養箱中培養48 h。在采集樣品的同時，使用溫濕度計監測并記錄采樣時的空氣溫度和相對濕度。

1.3 樣品的預處理

將樣品帶回實驗室后立即進行預處理。將平皿中所有的菌落用水反復清洗后收集于無菌處理的EP管中，采用Eppendorf離心機以8000 r/min的轉速離心5 min，收集菌體。將收集的菌體送至菲沙基因信息有限公司在PacBio Sequel平臺上進行測序。挑取平皿中的優勢單菌落于LB培養基中，進行分離純化，于4 ℃冰箱中保存備用。

1.4 數據分析

通過高通量測序得到的原始數據為Polymerase Reads，存在一定比例的干擾數據。為了使分析結果更加準確，利用SMRT Link v7.0軟件對原始測序數據進行了數據預處理和過濾，從而得到了高質量的數據，并計算了空氣中微生物群落的豐度［8］。

1.4.1 OTU(operational taxonomic units)聚類分析用Qiime軟件對垃圾中轉站不同月份空氣中的細菌群落進行OTU分析，通常將相似度≥97%的聚為一類，進行生物信息學統計分析。

1.4.2 Alpha分析主要分析反映微生物群落物種豐度的Chao 1指數，以及反映微生物多樣性的Shannon指數和Simpson指數；此外還有Coverage指數，它反映測序結果是否代表了樣本中微生物的真實情況，其值越高，測序結果越具有代表性。Observed species是指觀測到的OTU數目。

1.4.3 多樣性分析利用多樣性指數統計表，分析樣品中細菌群落的豐度和多樣性；再對OTU數據進行分析，并利用柱狀圖對樣品中的細菌進行統計分析，最終確定優勢菌屬。

1.4.4 冗余(RDA)分析該分析方法將對應分析與多元回歸分析相結合，所得結果主要用來反映菌群與環境因子之間的關系，樣本與環境因子間的夾角越小，說明菌群受環境因子的影響越大。

1.5 細菌的鑒定方法

將平皿中的優勢單菌落用接種環挑取少許至LB培養基中，于35 ℃下培養24～48 h，然后選取單菌落反復分離劃線，直至菌株完全純化。觀察待測菌落的特征，包括菌落的顏色、形狀等；通過革蘭氏反應、葡萄糖的氧化發酵測定、過氧化氫酶等生理生化試驗，確定細菌種屬。

2 結果與分析

2.1 垃圾中轉站細菌微生物組成及群落多樣性分析

從樣品中隨機抽取一定測序數量的個體，統計它們的OTUs數目，以隨機抽取的測序數據量為橫坐標，以對應的OTUs即物種數為縱坐標繪制稀釋曲線（圖2），圖2中不同的樣品使用不同圖例的曲線表示。當曲線趨向平坦時，說明測序數據量是合理的，增加測序的數據量只會產生少量新的物種(OTUs)。因此，稀釋曲線可以反映不同樣品的測序深度情況。

圖2 不同樣品的稀釋曲線

通過高通量測序數據對測序結果進行比對，并進行α-多樣性分析，得出垃圾中轉站不同空氣樣品的細菌多樣性指數。由表1可知：所有樣品的覆蓋度均在0.99以上，表明測序數據有效，可以作為分析的依據；樣品D1、D2和D3（7月份的所有取樣點）的Observed species指數較高，表明這3個點實際觀測到的OTU數目要高于其他取樣點的；樣品D1、D2和D3的Shannon指數要高于其他樣品的，且它們的Simpson指數也較高，表明7月份的細菌多樣性要明顯高于其他4個月的；就7月份的3個取樣點來說，樣品D2的Shannon指數高于D1和D3的，說明7月份垃圾站內的細菌多樣性要高于附近馬路邊取樣點及居民區取樣點的，這合情合理；就Chao 1指數而言，7月份的3個取樣點居前3位，其次是4月份（A2）和5月份（B3），表明不同月份這幾個位置細菌物種的豐富度較高。

表1 不同樣品的細菌多樣性指數

根據物種注釋結果，對OTU進行物種分類，選取每個樣品在門水平(Phylum)上最大豐度排名前6位的物種，繪制了15個樣品細菌物種組成的柱形圖。從圖3可以看出：所有樣品在門水平上以變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度最高，相對豐度為12.9%～78.0%；擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度為0.3%～66.1%；厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度為7.2%～61.6%；放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度為0.68%～39.70%；其余物種的相對豐度均小于0.74%。

圖3 不同樣品在門水平上的物種相對豐度

選取每個樣品在屬(Genus)水平上的物種繪制了柱形圖，結果（圖4）顯示：在15個樣品中，除了樣品C3、E1和E2外，其他樣品中都發現有不動桿菌屬(Acinetobatcer)，而且在這些樣品中還檢測到了芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、泛菌屬(Pantoea)等機會性致病菌或潛在致病菌，這與李榮宗等［9］的研究結果“在垃圾收集點、吊裝點、壓縮站和垃圾焚燒作業點均可檢測出大腸菌群、沙門菌、變形桿菌等致病菌”是一致的。含有致病菌的微生物氣溶膠會導致人類感染呼吸系統疾病、腸道不適和皮膚過敏等［10］。于文凱等［11］對肺囊性纖維化患者的痰液進行細菌體外培養，發現主要致病菌有銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)。史廷明等［12］的研究表明：一線作業工人的慢性咽炎患病率為21.1%，肺功能輕度下降比例達11.5%，遠高于行政管理等對照人員的。垃圾填埋場附近人群的癌癥發病率比非暴露地區明顯升高，且在垃圾填埋場周圍患先天缺陷性疾病、脊柱裂的嬰兒明顯增多［13］。本研究發現，在垃圾中轉站檢測到的不動桿菌屬(Acinetobacter)和芽孢桿菌屬(Bacillus)在馬路邊及居民區也檢測到，這可能是因為垃圾中轉站內的微生物氣溶膠借助空氣的流動擴散到了周圍環境中。

圖4 不同樣品在屬水平上的物種相對豐度

2.2 垃圾中轉站氣象因子對細菌群落組成與多樣性的影響

通過冗余分析研究了氣象因子溫度、相對濕度對細菌氣溶膠逸散的影響。結果顯示，垃圾中轉站空氣中細菌多樣性和豐富度與環境溫度和相對濕度都相關。不同月份垃圾中轉站的環境溫度和相對濕度也不一樣（表2）。7月份垃圾中轉站內空氣平均溫度為30.7 ℃，相對濕度平均為71.3%，明顯高于其他月份的，且該月細菌群落多樣性及豐度也是最高的，這可能是因為在高溫、高濕的環境中，微生物利用垃圾中的有機物大量生長繁殖，從而導致更多的微生物逸散到周圍空氣中。這與馬嘉偉等［14］的研究結果一致。

表2 垃圾中轉站4～8月的氣象因子平均值

從圖5可以看出：與溫度關系較大的是B（5月）、C（6月）和D（7月）的細菌群落；與相對濕度關系較大的是A（4月）、C（6月）和E（8月）的細菌群落。雖然有些月份的平均溫度和相對濕度條件相近，如5月份與6月份，但是這些月份的細菌群落結構和豐度存在差異，這可能與垃圾中物質的組成及有機質含量不同有關。

圖5 氣象因子和細菌豐度的RDA分析結果

2.3 優勢細菌的初步鑒定

為了進一步探明垃圾中轉站空氣中有哪些機會性致病菌或潛在致病菌，以便更好地預防和治理，對空氣中的優勢細菌進行了初步的鑒定。

2.3.1 菌落及菌體形態通過對垃圾中轉站的多次取樣，發現在LB培養基上有4個菌株為可培養的優勢微生物，對這4個菌株的菌落及菌體形態進行了觀察，結果（圖6）顯示：H-1菌株的菌落顏色鮮紅、表面光滑、圓形、中間凸起、濕潤、易挑起，其菌體為細橢圓形，兩兩一起，無芽孢；F-1菌株的菌落呈亮黃色、圓形、中間凸起、濕潤、易挑起，其菌體為細小圓形，無芽孢；F-2菌株的菌落呈金黃色、圓形、濕潤、中間凸起、易挑起，其菌體細桿狀；B-1菌株的菌落呈灰白色、圓形、中間凸起、易挑起，其菌體細桿狀，有橢圓形芽孢。

圖6 4個菌株的菌落形態

2.3.2 菌種的理化特性在觀察菌株形態的基礎上，進一步對上述4個菌株進行了理化特性試驗，結果（表3）表明：除F-2的革蘭氏染色為陰性外，其他3個菌株均為陽性；菌株H-1的過氧化氫酶、VP試驗、MR試驗及H2S試驗均為陽性，其他試驗均為陰性；菌株F-1除葡萄糖產氣、吲哚試驗和檸檬酸鹽的利用試驗為陰性外，其他試驗均為陽性；菌株F-2的過氧化氫酶、葡萄糖產氣、MR試驗和吲哚試驗均為陽性，其他幾項試驗均為陰性；菌株B-1除葡萄糖不產氣外，其他試驗均為陽性。結合菌株的形態和生理生化試驗結果，初步判斷菌株H-1屬于微球菌屬，F-1屬于葡萄球菌屬，F-2屬于埃希氏菌屬，B-1屬于芽孢桿菌屬。

表3 4個菌株的理化特性試驗結果

3 小結

本研究結果表明：垃圾中轉站內空氣細菌無論是多樣性還是群落豐富度，均在7月份最高，其次是4月份和5月份；垃圾中轉站內細菌相對豐度最高的門是變形菌門(Proteobacteria)，其次是擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)；垃圾中轉站內存在潛在或機會性致病菌屬，如不動桿菌屬(Acinetobatcer)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)；細菌氣溶膠的多樣性和豐富度除受垃圾組分影響外，還受到環境溫度、相對濕度的影響。