溫度和鹽度脅迫對紅螯螯蝦蝦苗存活率和免疫酶活力的影響

張高偉，王宣朋，周翰林，吳 春

（江蘇省農業科學院 宿遷農科所，江蘇 宿遷 223800）

紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)，原產于澳大利亞熱帶水域，肉質鮮美，營養豐富，含多種不飽和脂肪酸，是較為名貴的淡水經濟蝦種，該蝦具有出肉率高、抗逆性強、生長速度快等優良性狀［1-3］。近年來，克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)的市場不穩定，存在高溫季節病害嚴重的問題，而紅螯螯蝦的價格較高且保持穩定，同時能夠作為稻田養殖的優良品種，可以在高溫季節完美代替克氏原螯蝦，填補淡水螯蝦高端市場的空白［4］。近年來，隨著國內外學者的不斷探索和研究，紅螯螯蝦的養殖技術逐漸成熟，養殖模式不斷完善，人工繁育技術也日趨進步，但苗種繁育相關的基礎研究仍較匱乏。

由于紅鰲鰲蝦是熱帶蝦類，在我國大部分地區自然水溫條件下繁殖培育的蝦苗無法在當年被養成商品蝦，需要集中越冬養殖，產量較低且提高了養殖成本，需要開展紅鰲螯蝦工廠化人工繁殖。在人工繁殖過程中，溫度和鹽度的變化容易造成紅螯螯蝦蝦苗的生長速度緩慢和高死亡率的現象。急性的溫度和鹽度應激會影響蝦類的機體活力和免疫功能，造成血細胞吞噬活性和免疫相關酶活性的降低，進而導致蝦苗存活率降低［5-6］。免疫相關酶活性是評價逆境脅迫下甲殼類動物生命狀態的重要指標［7］。在凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)［8］、克氏原螯蝦［9］、葛氏長臂蝦(Palaemon gravieri)［10］、斑 節 對 蝦(Penaeus monodon)［11］、脊 尾 白 蝦(Exopalaemon carinicauda)［12］和 中 華 絨 螯 蟹(Eriocheir sinensis)［13］等研究中都已證實，溫度和鹽度變化會對甲殼類動物的免疫指標產生顯著影響。其原因可能是溫度和鹽度較大幅度的急性脅迫打破了甲殼動物的代謝及能量供給平衡，使得機體對免疫防御的能量投入大大降低，進而導致免疫相關酶活性下降，最終影響蝦體的生長存活［14］。因此，研究溫度和鹽度的適宜變化范圍是維持紅螯螯蝦蝦苗免疫功能正常運轉的重要前提，對紅螯螯蝦人工繁殖和大規格苗種培育具有重要意義。

為探究紅螯螯蝦蝦苗對不同溫度和鹽度的適應性，提高蝦苗在培育過程中的存活率，本研究分析了溫度和鹽度變化對紅螯螯蝦蝦苗存活和免疫相關酶活力的影響，并綜合評定了紅螯螯蝦蝦苗對溫、鹽變化的適應和抗逆能力，探究了紅螯螯蝦蝦苗生長培育所需要的適宜溫度和鹽度條件，旨在為紅螯螯蝦的人工繁育和大規格苗種培育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與來源

2022年3月在江蘇省農業科學院宿遷農科所孵化中心紅螯螯蝦自繁群體中，從脫離母體后培育15 d的個體中選取體表光滑、攝食良好、活力旺盛的苗種作為研究對象。試驗開始之前，利用紫外殺菌循環水控溫養殖系統暫養2周，暫養期間，溫度控制在25 ℃，鹽度控制在0.5‰，每日投喂紅螯螯蝦專用配合飼料2次，暫養和試驗環境均放置伊樂藻。暫養后挑選狀態良好且穩定的紅螯螯蝦用于研究，每組試驗隨機挑選50只個體進行生長指標的測定，測得其平均體長為（15.75±5.19）mm。

1.2 試驗設計

為探究溫度和鹽度對紅螯螯蝦蝦苗存活率的影響，將蝦苗從暫養環境（25 ℃，鹽度0.5‰）直接轉移至6個溫度梯度（20、22、24、26、28、30 ℃）和6個鹽度梯度（0.1‰、1‰、2‰、3‰、4‰、5‰）處理組，各轉移 50只個體，每組均設置 3 個生物學重復，試驗持續 15 d，每天記錄各組紅螯螯蝦的死亡個數。

為分析溫度和鹽度急性脅迫對紅螯螯蝦免疫相關酶活性的影響，將試驗蝦苗從暫養環境（25 ℃，鹽度0.5‰）直接轉移至6個溫度梯度（20、22、24、26、28、30 ℃）和6個鹽度梯度（0.1‰、1‰、2‰、3‰、4‰、5‰）處理組，各轉移50只個體，進行48 h溫度和鹽度的突變脅迫，分別于脅迫后4、8、12、24和48 h對各處理紅螯螯蝦的肝胰腺組織進行取樣，用于SOD、LSZ和CAT的活力檢測，各個試驗組每次隨機抽取3只個體進行檢測。

1.3 酶活性的測定

1.3.1 樣品處理準確稱取一定重量的紅螯螯蝦肝胰腺組織，樣品處理按照胡益鳴等［30］的方法并加以改進，制備獲得10%的組織勻漿，2500 r/min離心10 min后取上清，再稀釋至最佳取樣濃度，待測。

1.3.2 免疫相關酶活性的測定使用酶活測定試劑盒和BCA試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）、酶標儀和分光光度計用于SOD、LSZ和CAT的活性檢測。

SOD活性的測定：將待測樣本、雙蒸水、酶工作液、酶稀釋液和底物應用液分別按照操作說明混勻，37 ℃ 孵育20 min，在450 nm 處酶標儀讀數；同時用BCA試劑盒測定其蛋白濃度，按公式計算出SOD活力。

LSZ活性的測定：分別按照標準將待測樣本、雙蒸水、溶菌酶標準應用液和應用菌液混勻，37 ℃水浴15 min后，立即取出，置于0 ℃以下的冰水浴中3 min，然后逐管取出，倒入1 cm光徑比色皿中，530 nm處以雙蒸水調透光度至100%，比色，測各管的透光度T15，即37 ℃水浴15 min后的透光度值，按照公式計算LSZ的活性。具體操作步驟參照試劑盒說明書。

CAT活性的測定：首先根據說明書步驟確定待測液的最佳取樣濃度，然后將試劑1、試劑2和待測液分別混勻，準確反應1 min，最后將試劑3、試劑4和待測液分別混勻，將波長調到405 nm，光徑調到0.5 cm，雙蒸水調零，測定各管的吸光度值，按照公式計算CAT活力。具體方法參照試劑盒說明書。

（2）金融支持城鎮化建設的組織體系有待完善。國家為保障城鎮化建設的順利開展，通過相關的金融機構利用金融工具進行系列的金融服務。金融體系的常態化發展能夠表現出城鎮化發展過程中正常的金融需求。當前，我國有政策性銀行、商業銀行、農村合作金融三類性質的金融機構體系，依次在提供保障性購銷貸款、信貸業務、零售、農村金融等領域提供金融服務。

1.4 數據分析

采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著差異。采用GraphPad prism 6.0軟件進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 不同溫度和鹽度脅迫對紅螯螯蝦存活率的影響

由圖1可知，隨著試驗時間的延長，各溫度組紅螯螯蝦的存活率均逐漸下降。到第 11天時，各溫度組存活率由大到小排序為 28 ℃＞30 ℃＞26 ℃ ＞24 ℃＞22 ℃＞20 ℃。到第12天時，20 ℃處理組的存活率降低到50%，而28 ℃處理組的存活率始終高于 90%。自第 9天起，28與20 ℃2組之間開始差異顯著（P＜0.05）；從第10天開始，22與 20 ℃ 2組之間呈極顯著差異（P＜0.01）；而 24、26和30 ℃ 3組之間一直無顯著性差異。

圖1 不同溫度脅迫下紅螯螯蝦的存活率

各鹽度組的紅螯螯蝦的存活率也隨時間的延長而逐漸下降, 但存活率均高于50%（圖2）。第5天時，各鹽度組存活率由大到小排序為0.1‰＞1‰ ＞2‰＞3‰＞4‰＞5‰。第12天時，5‰鹽度 組的存活率降低到56%，而0.1‰鹽度組的存活率始終高于90%。單因素方差分析表明，自第6天起，5‰與0.1‰鹽度組之間一直存在顯著差異（P＜ 0.05）；自第9天起，4‰與 0.1‰鹽度組之間一直存在顯著差異（P＜0.05）；到第12天，5‰鹽度組的存活率降至最低（56%）且極顯著低于其余處理組（P＜0.01）； 而1‰、2‰和3‰這3個鹽度組之間從始至終無顯著性差異。

圖2 不同鹽度脅迫下紅螯螯蝦的存活率

2.2 不同溫度脅迫對紅螯螯蝦免疫相關酶活力的影響

不同溫度脅迫下3種免疫相關酶活性變化如圖3所示。由圖3A可知，20、22和24 ℃ 3個處理組的SOD活性整體水平較低且相對穩定。26和28 ℃處理組的SOD活性總體是隨著脅迫時間的延長而逐漸增強，30 ℃處理組整體呈現先上升后下降的變化趨勢。24 h時，26、28和30 ℃處理組的SOD活性均達到最大值，分別為123.04、146.80和138.06 U/mg。

由圖3B可知，各處理組的LSZ活性整體上隨著脅迫時間的增加呈現出先升高后降低的變化趨勢。28和30 ℃處理組的響應較其他處理組更為積極，其活性的變化幅度也高于其他處理組，且隨脅迫時間的增加而達到一個相對較高的穩定活性，28和30 ℃處理組在48 h時的最高值分別為20 ℃處理組的2.69和2.34倍。20、22和 24 ℃處理組的LSZ活性均在8 h達到峰值，并隨著脅迫時間的增加逐漸降低，最后低于脅迫初始階段的酶活力，其中20 ℃組的LSZ活性在48 h時顯著低于其他脅迫時間的（P＜0.05）。

由圖3C可知，各處理組的 CAT 活性變化規律與LSZ相似，均大致呈現先升高后降低的變化趨勢。20、22和24 ℃處理組的CAT活性均在8 h時達到峰值，并隨著脅迫時間的增加而逐漸降低，最后低于脅迫初始階段的酶活力，其中20 ℃組的LSZ活性在48 h時顯著低于其他脅迫時間的（P＜0.05）。26、28和30 ℃處理組均在 12 h達到峰值后逐漸下降。在48 h時，28和30 ℃處理組的CAT活性依然顯著低于脅迫初始階段，而24 ℃處理組在脅迫各個時期均未產生顯著性差異。

圖3 不同溫度脅迫下紅螯螯蝦免疫相關酶活性的變化

2.3 不同鹽度脅迫對紅螯螯蝦免疫相關酶活力的影響

不同鹽度脅迫下3種免疫相關酶活性變化如圖4所示。由圖4A可知，從脅迫4 h開始，4‰、5‰鹽度組的SOD活性開始升高，與脅迫2 h時差異顯著（P＜0.05），8 h到達峰值，隨后逐步下降。到48 h時5‰鹽度組的 SOD活性降到最低，與其他鹽度處理組形成顯著差異（P＜0.05）。3‰鹽度組的 SOD活性在8 h時達到峰值，然后隨著脅迫時間的增加而逐步降低，直到低于初始脅迫時的。0.1‰、1‰和2‰處理組的SOD 活性變化不大，在整個試驗中3個處理組之間均無顯著差異。

由圖4B可知，與0.1‰、1‰和2‰3個鹽度組的LSZ活性變化不大，在整個試驗中3個處理組間均無顯著差異。整體來看，3‰、4‰和5‰ 處理組的LSZ活性隨著脅迫時間的增加呈現先升高后降低的變化趨勢，其中4‰和5‰處理組的響應較其他處理組更為積極，且在48 h時與其他處理組均形成顯著性差異（P＜0.05）。

由圖4C可知，整體來看，各個鹽度處理組的CAT活性均隨著脅迫時間的增加呈現出先升高后降低的變化趨勢。0.1‰、1‰和2‰處理組的CAT活性普遍較低，在各試驗時間點均未達到顯著性差異。3‰、4‰、5‰處理組的 CAT活性逐漸上升，均在8 h達到最大值后開始下降，到48 h時顯著低于初始脅迫階段。1‰鹽度組在48 h時恢復至脅迫初始階段水平，5‰鹽度組在則48 h時高于脅迫初始階段水平。

圖4 不同鹽度脅迫下紅螯螯蝦免疫相關酶活性的變化

3 討論

紅螯螯蝦對機體溫度和滲透壓的自我調節能力較差，對外界溫度和鹽度的變化會發生較為強烈的應激反應，因此，溫、鹽脅迫會對其生理生化功能產生消極影響，甚至導致死亡［15］。甲殼動物應對溫度和環境滲透壓的急性變化需要消耗大量能量，這會大大改變自身的代謝狀況，破壞其代謝及能量供給平衡，降低機體對免疫防御的能量投入，進而影響蝦體的生長存活［16-18］。本試驗采用單一變量的研究方法，將溫度或鹽度其中一個因子控制在正常范圍內，分別探究了溫度和鹽度對紅螯螯蝦存活率和免疫相關酶活力的影響。

3.1 不同溫度和鹽度脅迫對紅螯螯蝦存活率的影響

在溫度脅迫試驗中，隨著脅迫時間的增加，溫度降低幅度越大的試驗組紅螯螯蝦存活率越低，這與胡潤豪等［10］對葛氏長臂蝦的研究結果相似；溫度增加的試驗組中28 ℃處理組的存活率最高，隨著脅迫溫度的繼續上升，紅螯螯蝦的存活率開始下降，這與王天神等［19］在克氏原螯蝦上的研究結果相似，因此推測紅螯螯蝦生存的最適溫度在28 ℃左右。脅迫強度上升會加劇對甲殼類呼吸、攝食和免疫等功能的消極影響，降低其抗應激能力，甚至引起死亡［20］。另一方面，隨著溫度的降低，紅螯螯蝦的存活率也逐漸降低，20 ℃脅迫48 h后的存活率僅有53%，這表明紅螯螯蝦對低溫和低溫突變的耐受性更差，這與紅螯螯蝦是熱帶蝦類，更適合較高水溫的特性有關。26、28和30 ℃溫度組在脅迫48 h后的存活率總體均高于80%，表明這個溫度范圍內的紅螯螯蝦存活率較高，但是否適宜其生長發育仍需進一步研究。在鹽度脅迫試驗中發現，紅螯螯蝦在0.1‰～2‰鹽度下的存活率較高，適宜紅螯螯蝦生存。0.1‰鹽度組在脅迫48 h后的存活率顯著高于5‰處理組，說明紅螯螯蝦對高鹽度變化的耐受性并不強，更適合低鹽度環境。

紅螯螯蝦自然棲息于淡水、河流、湖泊，在淡水中繁殖，對高鹽環境的耐受性較弱［21］。隨鹽度脅迫時間的增加，紅螯螯蝦存活率的下降速度不斷加快，表明脅迫強度和處理時間的增加會影響紅螯螯蝦對鹽度的耐受性，可能是因為紅螯螯蝦為減輕鹽度變化帶來的影響，而消耗了大量能量來調節自身滲透壓，因此在苗種培育或者養殖過程中低鹽度的環境或較短的變化周期更有利于紅螯螯蝦的生長發育。

3.2 不同溫度和鹽度脅迫對紅螯螯蝦免疫相關酶活力的影響

溫度和鹽度的急性脅迫會導致水生動物體內活性氧(ROS)的過量累積，過量的ROS會攻擊水生動物細胞膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質過氧化，進而使得細胞功能受損［22-24］。蝦類的抗氧化能力主要依靠非特異性免疫抗氧化酶 SOD和CAT發揮作用，這2種抗氧化酶能夠有效清除水生動物機體內過量的ROS，對維持ROS代謝平衡和降低氧化損傷起著重要的免疫保護作用［25］。在甲殼類簡單的免疫系統中，LSZ在吞噬細胞、消滅機體異物過程中發揮了重要的作用；此外LSZ還具有較強的抑菌作用，可以通過溶解細菌細胞膜的肽聚糖等結構性物質使細菌崩解，因此，LSZ的活性大小能夠較為準確地衡量生物體的免疫狀態［26-28］。

26和28 ℃處理組的SOD活性隨著脅迫時間的增加呈現先上升后降低的變化趨勢，并且降低后的酶活性依然顯著高于對照組，說明較高溫度的脅迫可能先使得機體遭受氧化反應，導致ROS積累，但隨著脅迫時間的延長，SOD活性在降低后更加穩定，證明機體在此溫度下并未遭受損傷，反而對免疫活性產生了積極作用。20、22 和24 ℃處理組的SOD活性整體水平較低且相對穩定，證明此范圍內溫度并未對紅螯螯蝦的SOD活性產生顯著影響。各處理組的CAT活性整體上均呈現先上升后下降的變化趨勢。20和22 ℃處理組的CAT活性均在處理8 h時達到峰值，并隨著脅迫時間的增加而逐漸降低，且20 ℃處理組的CAT活力顯著低于脅迫初始階段，這說明20 ℃的脅迫已經對紅螯螯蝦產生了一定的機體損傷，導致其CAT活性無法再恢復到正常水平。其SOD與CAT的活性在經歷溫度驟變后均出現隨著處理時間延長而呈先顯著增加又逐漸降低的變化規律，但CAT活性未降低至正常水平，推測CAT比SOD更易受溫度變化的影響。本文高溫脅迫試驗的結果與高煥等［29］對脊尾白蝦T-AOC的研究結果有相似之處，即升溫與降溫對T-AOC活性影響有差異，這可能是由于溫度驟升導致ROS積累效應強于溫度驟降，因此溫度升高脅迫的試驗組需要更多時間消除ROS，屬于正常免疫調節范圍；不同的是，紅螯螯蝦的CAT活性在低溫脅迫下無法恢復到正常水平，這表明紅螯螯蝦對低溫的耐受能力更弱。LSZ活性隨著脅迫時間的增加整體呈現出先升高后降低的變化趨勢。28和30 ℃ 處理組的響應比其他處理組更為積極，其活性變化幅度也高于其他處理組。20、22和 24 ℃處理組的LSZ活性在8 h時達到峰值，并隨脅迫時間的增加而逐漸降低，直至低于脅迫初始階段的酶活力。胡益鳴等［30］研究發現溫度急劇降低會改變細胞膜對溶酶體酶的滲透性，進而影響免疫酶的釋放及其活性，推測本研究中20、22和24 ℃處理組在脅迫后的LSZ活性降低與此相關，較低的溫度影響了紅螯螯蝦的免疫功能，這勢必會影響紅螯螯蝦對侵襲病菌的抵御能力。Wang等［31］研究刺參時發現，溫度升高可以提高LSZ活性；而Paillard等［32］在研究溫度對菲律賓蛤仔脅迫影響的研究中發現溶菌酶活性與溫度呈負相關。本研究中溫度脅迫對LSZ活性的影響并無明顯的規律，與上述研究結果均不一致，這可能與研究對象親緣關系較遠及試驗方法的差異有關。

甲殼動物需要調節自身的滲透壓來應對外部水環境的鹽度波動［33］。龍曉文等［34］發現隨水體鹽度的升高，雌性三疣梭子蟹肝胰腺中的SOD和CAT活性升高。本研究同樣發現，4‰和5‰鹽度組紅螯螯蝦SOD和CAT的活性在短時間內顯著上升，而低鹽度對紅螯螯蝦免疫酶活性無顯著影響，表明高鹽度引起了紅螯螯蝦的氧化應激反應，其抗氧化酶響應更加積極。4‰和5‰鹽度組的SOD活性從脅迫4 h后開始顯著上升，在8 h時到達峰值，隨后逐步下降，到48 h時5‰鹽度組的SOD活性下降到最低，與其他鹽度處理組形成顯著差異，表明5‰的鹽度水體會對紅螯螯蝦的免疫系統造成不可修復的損害。各個鹽度組的CAT活性隨著脅迫時間的增加總體上呈現出先升高后降低的變化趨勢。在鹽度過高時機體受自由基攻擊較強，從而加劇紅螯螯蝦肝胰腺中脂質過氧化反應，這可能是導致高鹽組紅螯螯蝦存活率較低的原因。高鹽度脅迫雖然能提高紅螯螯蝦的CAT和SOD活性，但在鹽度初始脅迫階段紅螯螯蝦抗氧化能力的提高可能只是氧化損傷的一種反應，如果隨著脅迫時間的增加其CAT和SOD活性低于初始水平，就可以證明高鹽度會加劇紅螯螯蝦的氧化損傷，這與本試驗結果一致。

LSZ為溶酶體酶，在吞噬細胞并且消滅和清除異物的過程中發揮著重要作用，此外LSZ還可以通過溶解細菌細胞壁的肽聚糖使細菌崩解，具有很強的抑菌作用。因此，LSZ的活性大小可被用于衡量生物體的免疫狀態［35-36］。本研究中各鹽度組的LSZ活性在不同時間內出現顯著性上升，這可能與紅螯螯蝦機體對鹽度脅迫產生應激的保護反應有關。3‰、4‰和5‰ 鹽度組的LSZ活性隨著脅迫時間的增加呈現出先升高后降低的變化趨勢，且在48 h時與其他處理組均形成顯著性差異。5‰ 鹽度組的LSZ活性最終顯著低于初始水平，說明鹽度變化已經超出機體免疫酶的承受限度，其免疫機能遭到破壞。隨著處理鹽度的降低，LSZ活性均在4‰鹽度組出現顯著下降，表明4‰鹽度可能已接近紅螯螯蝦免疫酶的承受臨界點，由此推測LSZ活性下降也是導致紅螯螯蝦存活率降低的原因。

綜上所述，不同溫度和鹽度的脅迫均會對紅螯螯蝦的存活率和免疫相關酶活性產生顯著影響。在26～30 ℃和0.1‰～1‰鹽度下紅螯螯蝦的免疫調節靈敏迅速，其免疫相關酶活力在適應環境之后也有顯著增高，表現出較強的適應能力，存活率較高。而較低溫度和較高鹽度的長時間脅迫會使紅螯螯蝦的免疫調節紊亂，其免疫相關酶活性會發生不可逆的損傷，導致存活率降低。因此在紅螯螯蝦人工繁育和養殖生產中應注意避開溫度和鹽度長期的大幅變化，尤其在人工孵化和苗種培育階段，需定期檢測紅螯螯蝦的免疫相關酶活性，這有助于了解機體的免疫能力和健康程度，對提高人工繁育的苗種存活率和養殖成功率具有重要意義。