不同外源調節(jié)劑對梅花花香性狀的影響

邱 晨，常 珺，王帥兵，范麗娜，賈浩田，郝瑞杰*

（1.山西農業(yè)大學 城鄉(xiāng)建設學院，山西 太谷 030801；2.山西農業(yè)大學 園藝學院，山西 太谷 030801；3.山西農業(yè)大學 資源環(huán)境學院，山西 太谷 030801）

花香是觀賞植物的主要品質指標，其能有效提高觀賞植物的經濟價值和觀賞價值，也能影響人們的情緒、心理狀態(tài)、社交行為等［1］。通過調控花香物質的組成和用量，可以開展靈活的“芳香療法”，從而實現(xiàn)保障人體健康或緩解疾病痛苦的目標［2］。花香是植物重要的次生代謝產物，其由多種小分子化合物組成［3］，國內外已從90個屬991種植物中鑒定出2000多種花香物質［4］，主要包括酯類、醇類、萜烯類、烷烴類、芳香烴類、醛類、酮類以及醚類等［5-6］。花香物質的釋放由植物自身遺傳特性決定，但生物、環(huán)境等眾多外界因素也會影響植物花香物質的揮發(fā)，如害蟲、真菌、溫度、激素、外源調節(jié)劑等［7-10］。

生產中已經發(fā)現(xiàn)多種調節(jié)劑可以影響植物花香物質的揮發(fā)［10-11］，如甘草酸是一種兩親性分子，可以自由組裝形成主客體復合物，從而將客體分子包裹起來，提高其溶解度，起到抑制次生代謝產物轉運和揮發(fā)的作用［12］。槲皮素是基于類黃酮結構的一類具有生物活性的化合物，其與植物多種功能有相關作用［13］，外源槲皮素處理可以通過參與ABA信號通路和降低ATP合酶的活性，從而抑制擬南芥中生長素等次生代謝產物的運輸［14］。釩酸鹽是一種重要的ABC轉運蛋白活性抑制劑［15］，在擬南芥中外源添加釩酸鹽可抑制液泡膜對水楊酸的轉運［16］。在煙草懸浮細胞檢測PhABCG1轉運苯甲酸甲酯的試驗表明，正釩酸鈉可有效抑制矮牽牛關鍵芳香物質的揮發(fā)［11］。目前，利用外源調節(jié)劑調控植物花香機理研究仍未闡明，生產中也缺乏有效的花香調節(jié)劑，因此繼續(xù)開展觀賞植物花香調節(jié)劑研究意義重大。

梅花 (Prunus mume Sieb. et Zucc)為薔薇科杏屬落葉觀花小喬木，是我國十大傳統(tǒng)名花之一，自古就與國人的生產、生活和文化結緣，深受人們喜愛。前人研究揭示梅花花香的主要特征物質是乙酸苯甲酯、苯甲醇、苯甲醛等，梅花已成為研究苯環(huán)類物質合成與揮發(fā)的模式植物［17-19］，而有關外源調節(jié)劑對梅花花香性狀影響的研究鮮有報道，其調控方式和影響機制尚不清楚。本研究以梅花彩枝舞粉為材料，利用甘草酸、槲皮素、正釩酸鈉這3種外源試劑噴施處理，采用頂空固相微萃取和氣質聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS)技術，對不同處理后盛花花朵進行揮發(fā)成分檢測分析以探究3種花香調節(jié)劑對梅花揮發(fā)性狀的影響，以期篩選出有效的花香揮發(fā)調節(jié)劑，為指導后續(xù)的花香應用和花香調控工作提供實踐依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以山西農業(yè)大學校內栽培的梅花彩枝舞粉(Prunus mume ‘Caizhiwufen’)為試材，剪切帶有盛花期梅花花朵的枝條插入超純水中，置于20 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)（瑞徽電子上海有限公司），光周期為12 L/12 D，光照強度為5000 lx。外源花香調節(jié)劑為甘草酸、槲皮素、正釩酸鈉，均購買自麥克林公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 外源調節(jié)劑處理試驗采用2 mmol/L甘草酸、槲皮素和正釩酸鈉3種外源調節(jié)劑，選擇長勢一致的盛花期梅花花朵分別噴施此3種不同的外源試劑，以噴施清水為對照，每個處理重復3次。

1.2.2 花香采集與分析使用氣相色譜—質譜聯(lián)用儀（Trace ISQ型號，Thermo公司），參考袁穎的研究方法中設定的SPME-GC-MS工作條件［20］，將不同處理的盛花花朵離體稱重后置入20 mL頂空進樣瓶中，揮發(fā)成分鑒定采用NIST08譜庫檢索結合人工解析圖譜共同確定，揮發(fā)物成分定量分析采用外標法［21］。

1.2.3 徒手切片觀察將梅花花瓣表皮分離后制成徒手切片，選取合適的切片在正置顯微鏡（日本Nikon公司，NI-U）下對花瓣表皮細胞結構及形態(tài)進行觀察并拍照。

1.2.4 FDA染色觀察稱量5 mg FDA溶于1 mL丙酮中，4 ℃保存為貯備液。用20%的蔗糖將貯備液稀釋50倍并混合均勻，配制成濃度為100 μg/mL的FDA測定液。取不同處理后花瓣表皮制成徒手切片，于室溫下浸泡在FDA測定液中，黑暗處染色7 min后在顯微鏡（Nikon Ni-U、Nikon C-HGFI熒光發(fā)射源、Nikon-Fi3相機）上進行觀察和拍照，激發(fā)光為藍色，目鏡為10倍，物鏡為4倍。

1.3 數據分析

試驗采用Thermo Xcalibur和Microsoft Excel 2016軟件進行數據整理，用The SAS System for Windows V8軟件進行統(tǒng)計分析，采用AVONA進行顯著性檢驗（P＜0.05），采用Origin 2019b軟件進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 花香調節(jié)劑對梅花花香主要揮發(fā)物質的影響

由不同外源花香調節(jié)劑處理后梅花彩枝舞粉花香離子流（圖1）所示，與清水處理相比，處理后揮發(fā)物總離子流圖中峰數量及其相應峰面積差異明顯，各處理間也存在明顯差別。但不同處理的梅花花香主要物質種類未發(fā)生明顯變化，均為乙酸苯甲酯、苯甲醇、苯甲醛、丁香酚等。由不同外源調節(jié)劑對彩枝舞粉花香總揮發(fā)量的影響（圖2）可知，與清水對照相比，各處理的花香揮發(fā)物釋放總量均有所降低，其中經甘草酸和正釩酸鈉處理的花香揮發(fā)物總釋放量均顯著降低，且正釩酸鈉處理的下降幅度最明顯，達到了44.75%；而槲皮素處理的花香揮發(fā)物總釋放量與清水對照相比差異不顯著。

圖1 不同調節(jié)劑處理梅花花香離子流

圖2 不同調節(jié)劑對梅花花香揮發(fā)物總揮發(fā)量的影響

2.2 花香調節(jié)劑對梅花花香揮發(fā)物類別的影響

梅花花香揮發(fā)物的歸類情況如圖3所示，各處理中共檢測到的40余種揮發(fā)物，主要分為酯類、萜烯類、苯環(huán)類、烷烴類、醇類、醛類、酸類、酮類和其他共9個類別，其中數量最多的是酯類，其次是苯環(huán)類，兩者共占總類別的50%左右。由圖3可知，與清水處理相比，甘草酸處理可有效增加梅花花香揮發(fā)物中酯類、苯環(huán)類、醇類、醛類和其他類物質的數量，并使得烷烴類和酸類物質數量減少，而萜烯類物質并未檢測到。經槲皮素處理后，梅花花香揮發(fā)物中的酯類、烷烴類、醇類和醛類物質數量與清水對照相比保持不變，萜烯類物質的數量明顯減少，其他類物質的數量明顯增加，而酸類物質未檢測到。正釩酸鈉處理對梅花盛花花朵釋放揮發(fā)物種類數量的影響較大，其揮發(fā)物總種類有30種，較清水對照減少了30.23%，其酯類、烷烴類物質的數量明顯減少，萜烯類物質未被檢測到，其余種類物質數量與清水對照組相比基本保持不變。

圖3 不同調節(jié)劑對梅花花香揮發(fā)物種類的影響

2.3 花香調節(jié)劑對梅花花香不同類別揮發(fā)物釋放總量的影響

由各處理中揮發(fā)物質中各類別釋放量(圖4)可知，花香揮發(fā)物中酯類、苯環(huán)類和醇類物質的平均釋放量均相對較高（圖4），且酯類是梅花花香成分中的主要物質，至少達到了205.09 ng/(g·h)，其次是醇類，苯環(huán)類、醛類、烷烴類、萜烯類、酸類、酮類和其他類物質的含量依次減少。與清水對照相比，經不同外源花香調節(jié)劑處理后，花香成分中酯類、萜烯類、苯環(huán)類、烷烴、酸類和酮類物質的揮發(fā)均受到了明顯抑制。噴施甘草酸溶液后，梅花花香揮發(fā)性成分中醇類物質的釋放量顯著增加，酯類、苯環(huán)類、烷烴類、酸類、酮類物質的釋放量均顯著減少，萜烯類物質的釋放量為0；經槲皮素處理后，醛類物質的釋放量顯著增加，酯類、萜烯類、苯環(huán)類、醇類、酮類物質的釋放量顯著減少，而酸類物質則無法被檢測到；正釩酸鈉處理顯著提高了醛類物質的釋放量，酯類、苯環(huán)類、烷烴類、酸類和酮類物質的揮發(fā)受到了明顯抑制，而萜烯類物質的揮發(fā)受到了完全抑制。

圖4 花香調節(jié)劑對梅花花香不同種類揮發(fā)物釋放量的影響

2.4 花香調節(jié)劑對梅花花香主要揮發(fā)物釋放量的影響

通過對處理后梅花彩枝舞粉的揮發(fā)物進行鑒定和統(tǒng)計，從40多種不同的揮發(fā)物成分中篩選出了9種代表性成分，并對這9種成分的釋放量進行分析。從圖5可以看出，乙酸苯甲酯和苯甲醇是梅花彩枝舞粉主要的花香成分，一些酯類和苯環(huán)類物質的釋放量也相對較高。經不同外源花香調節(jié)劑處理后，大部分揮發(fā)物質釋放量均顯著降低，如乙酸苯甲酯、苯甲醇、丁香酚、乙酸己酯、乙酸異戊酯、正二十一烷、苯酚、乙酸葉醇酯，尤其是乙酸苯甲酯的揮發(fā)量降低了50%以上，在甘草酸處理中的揮發(fā)量僅為107.39 ng/(g·h)。而甘草酸、槲皮素和正釩酸鈉處理均使得正二十一烷消失；噴施甘草酸溶液后，苯酚無法被檢測到；正釩酸鈉處理后，苯甲醛的揮發(fā)量顯著提升，達到了34.07 ng/(g·h)，相當于清水對照的3倍，而乙酸葉醇酯無法被檢測到。

圖5 不同調節(jié)劑對梅花花香9種主要揮發(fā)物釋放量的影響

2.5 花香調節(jié)劑處理后梅花花瓣表皮細胞觀察

由梅花花瓣徒手切片觀察結果（圖6）顯示，各調節(jié)劑處理下花瓣表皮細胞整體均呈現(xiàn)淡粉色，細胞間以鑲嵌結構形式緊密排列，與對照相比，細胞形態(tài)未見明顯變化。花瓣表皮細胞FDA染色觀察結果（圖6）顯示，所有花瓣表皮細胞均在藍光下呈現(xiàn)黃綠色熒光，且不同外源調節(jié)劑處理后的花瓣表皮細胞較對照熒光差異不明顯，表明處理后花瓣表皮細胞膜未被破壞且仍具有完整性，花瓣表皮細胞活力未見明顯改變。

圖6 花香調節(jié)劑處理后梅花花瓣表皮徒手切片與FDA染色觀察

3 討論與結論

花是植物主要的觀賞部位，花香也是人們關注的焦點之一。近年來，隨著花香揮發(fā)性物質提取和檢測技術的進步與發(fā)展［22］，眾多植物花香成分已被鑒定出來，且對花香性狀調控的研究取得了較大進展［23-24］，外源調節(jié)劑能有效影響植物花香物質的揮發(fā)與合成，但各調節(jié)劑所產生的影響差異較大。外源NO會抑制牡丹不同花期花瓣揮發(fā)性成分中烷烴類、醇類和芳香烴類物質的揮發(fā)，并影響其花期花瓣揮發(fā)性成分的種類及含量，但對萜烯類和酮類物質影響不大［25］。外源乙烯處理可以提高白姜花萜類花香物質的釋放量［26］，而使香豌豆花主要花香揮發(fā)物芳樟醇大量減少［27］。外源茉莉酸甲酯對玫瑰花香物質的釋放具有明顯促進作用［28］，但噴施50 μmoL/L茉莉酸甲酯對百合花瓣的花香揮發(fā)物釋放產生了抑制作用［29］。而在本研究中，3種外源調節(jié)劑處理均使梅花彩枝舞粉花香揮發(fā)性物質的總揮發(fā)量降低，說明不同調節(jié)劑作用效果不同，對不同植物花香性狀的影響也不同。清水對照處理梅花花香主要揮發(fā)物乙酸苯甲酯的揮發(fā)量占總揮發(fā)量的52.63%，甘草酸、槲皮素、正釩酸鈉處理后乙酸苯甲酯的揮發(fā)量分別降低了64.18%、58.01%、45.66%。由此可見，3種外源調節(jié)劑均能有效抑制乙酸苯甲酯的揮發(fā)，梅花花香總揮發(fā)量的降低也主要歸因于乙酸苯甲酯揮發(fā)量的降低。

植物花香主要來源于花瓣釋放的多種揮發(fā)性香氣成分，本研究發(fā)現(xiàn)不同外源調節(jié)劑處理并未破壞梅花花瓣表皮細胞膜的完整性和影響其細胞活性，但梅花花香總揮發(fā)量明顯降低，這說明外源調節(jié)劑對花香性狀的影響不是基于細胞結構的破壞，可能是外源調節(jié)物質干預了梅花花香物質揮發(fā)的進程。在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)了ABC亞家族的ABCG轉運蛋白PhABCG1參與了轉運苯甲酸甲酯和苯甲醇［11］；Hao等［30］證實了ABCGs參與薔薇科植物梅、桃、杏中苯甲醛的揮發(fā)。ABC轉運蛋白利用水解ATP釋放的能量來特異性轉運相關產物［31-33］，而正釩酸鈉可以抑制ATP的水解，其已被證實為一種有效的ABC轉運蛋白抑制劑［34］。本試驗中，正釩酸鈉處理后大量揮發(fā)物質的揮發(fā)量均大幅減少，而苯甲醛的揮發(fā)量顯著增加，這可能與正釩酸鈉處理后，梅花處于逆境環(huán)境中，觸發(fā)了梅花自身的防御機制，釋放出大量苯甲醛吸引昆蟲進行授粉有關［35］。有研究表明，甘草酸與槲皮素能夠抑制ABC轉運蛋白的功能從而影響次生代謝產物的運輸［36-38］。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素與甘草酸的處理也顯著降低了梅花花香物質的揮發(fā)量，推測甘草酸與槲皮素也可能是通過調控相關轉運蛋白的功能以減少花香物質的揮發(fā)。

植物揮發(fā)性成分種類和含量差異對其獨特香氣特征的形成起到關鍵作用。童盼盼等［39］使用特定外源調節(jié)物質噴施庫爾勒香梨后，果實主要揮發(fā)性物質及特征香氣含量顯著提高，導致果香發(fā)生明顯變化。侯丹［7］研究表明溫度變化對桂花花香釋放產生顯著影響，烷烴類化合物比例增加，使桂花香氣濃淡發(fā)生變化。裴龍英［40］發(fā)現(xiàn)不同處理的哈密瓜汁香氣有明顯改變，特征酯類揮發(fā)性物質減少以及醛類物質占比增加導致果汁香氣明顯減弱。本試驗中，3種外源調節(jié)劑在有效抑制梅花花香總揮發(fā)量的同時，還使其花香成分的種類、含量以及特征花香物質的比例發(fā)生改變，導致處理前后梅花花香性狀的差異，而不同調節(jié)劑對梅花香氣特征的改變起到不同效果。甘草酸、槲皮素處理后梅花主要花香物質含量均顯著減少，主要成分為乙酸苯甲酯、苯甲醇、苯甲醛、丁香酚等；正釩酸鈉處理后梅花主要成分為乙酸苯甲酯、苯甲醛、苯甲醇、乙酸己酯等，表現(xiàn)為苯甲醛含量的顯著提高和丁香酚含量明顯減少。因此，可以充分利用特定外源調節(jié)劑達到調控觀賞植物花香的效果，進而改善園林觀賞植物因花香過于濃郁引起人體不適的現(xiàn)狀。

綜上所述，使用外源調節(jié)物質噴施梅花彩枝舞粉盛花期花朵，其揮發(fā)物總釋放量受到明顯抑制，并導致?lián)]發(fā)物種類以及主要花香物質含量減少。不同調節(jié)劑對花香總揮發(fā)量的影響程度存在差異，正釩酸鈉的抑制作用強于甘草酸和槲皮素，不同外源調節(jié)劑對梅花花香成分中不同物質的種類和數量的影響差異可能與ABC轉運蛋白被特異性調控有關。因此，關于噴施外源調節(jié)劑對植物花香性狀影響的探索，可為人工調控植物芳香性狀提供了借鑒，也為芳香植物材料的應用提供了新的思路，后續(xù)可將關鍵ABC轉運蛋白基因作為切入點，是今后從基因水平上進行花香調控和香花植物應用的有效途徑之一。