重組人源膠原蛋白局部應用對絕經(jīng)后陰道壁組織病理學的影響

呂廣偉，呂騰，于新平，馬德花，焦今文，王黎明，白書楊

1青島大學附屬醫(yī)院婦科，青島 266003；2濟寧市任城區(qū)婦幼保健院婦產科

絕經(jīng)期泌尿生殖系綜合征（GSM）是指絕經(jīng)過渡期及絕經(jīng)后期婦女因雌激素和其他性激素水平降低引起的生殖道、泌尿道萎縮以及性功能障礙等［1］。GSM發(fā)生時，外陰陰道組織結構和生理功能均發(fā)生改變，組織學變化包括黏膜上皮膠原蛋白及彈性蛋白減少，上皮變薄，結締組織密度增加，彈性下降，盆底肌肉收縮力降低，神經(jīng)傳導速度減慢；生理變化包括陰道血流量減少，腺體分泌不足，潤滑減少，陰道pH值升高等［2］。在世界范圍內，有36%～90%的絕經(jīng)過渡期和絕經(jīng)后女性受GSM的困擾［3］。盡管陰道雌激素及潤滑劑和保濕劑被推薦用于GSM的治療，然而兩者皆存在局限性。陰道用雌激素可被少量吸收入血，存在少量全身作用，同時是否對子宮內膜存在刺激依然存在爭議，因此影響其長期應用［4］。目前，絕經(jīng)后激素治療（MHT）需要定期對患者進行風險和收益評估，但依然缺乏1年以上陰道用雌激素的安全性和有效性的研究。非激素的潤滑劑和保濕劑可有效治療陰道干澀以緩解性交疼痛和不適，但尚未證實其能夠有效改善陰道組織學變化［5］。為此我們就重組人源膠原蛋白局部應用對絕經(jīng)后陰道壁組織的影響進行了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年10月—2021年10月本院婦科收治的絕經(jīng)后盆腔臟器脫垂患者50例，均需行手術治療。納入標準：①經(jīng)臨床確診的盆腔臟器脫垂患者；②符合手術指征。排除標準：①已知或懷疑患有惡性腫瘤；②3～6個月內服用激素類藥物；③合并嚴重感染性和免疫性疾病；④對產品的任意成分過敏。50例患者隨機分為對照組25例和實驗組25例。實驗組年齡（62.8±10.61）歲，體質量指數(shù)（21.5±3.15）kg/m2，月經(jīng)初潮（15.4±1.80）歲，絕經(jīng)年齡（49.8±3.52）歲，絕經(jīng)時間（13.2±4.66）年，產次（1.5±0.81）次；對照組年齡（62.5±10.32）歲，體質量指數(shù)（21.5±2.42）kg/m2，月經(jīng)初潮（15.5±1.92）歲，絕經(jīng)年齡（49.7±4.08）歲，絕經(jīng)時間（13.1±5.02）年，產次（1.6±0.79）次。兩組以上資料比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 治療方法 對照組術前不使用任何激素類藥物和非激素類潤滑劑或保濕劑。實驗組于術前給予重組人源膠原蛋白（山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司，晉械注準20142640008）陰道內涂抹，每次2 g，隔天1次，術前至少使用10次。術中取陰道前壁修補時切下的陰道壁組織作為實驗標本。

1.3 陰道壁組織病理變化觀察 采用HE、Masson染色法。HE染色后觀察和評價兩組陰道壁上皮厚度；Masson染色顯示評估陰道壁肌肉和膠原纖維的分布排列情況。HE染色法：60℃烤片20 min后，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各10 min，100%、95%、85%、75%梯度乙醇脫水各5 min，蒸餾水洗滌5 min，蘇木精染色5 min后流水稍洗，1%鹽酸乙醇分化，水洗反藍，伊紅浸染5 s，充分水洗，75%、85%、95%、100%Ⅰ、Ⅱ梯度乙醇脫水各2 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各5 min，中性樹膠封片，鏡檢觀察并拍照。Masson染色法：切片脫蠟至水，Masson復合染色液滴染5 min，蒸餾水沖掉染液，磷鉬酸染液滴染5 min，甩干，滴加苯胺藍染色液染色5 min，蒸餾水沖洗，滴加分化液分化30～60s，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片。

1.4 陰道壁組織中Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）、Ⅲ型膠原蛋白（CollagenⅢ）、基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）和白細胞介素-6（IL-6）蛋白表達檢測 采用石蠟包埋組織進行連續(xù)性切片，脫蠟至水后采用H2O2室溫下孵育10 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min，8%的蛋白粉封閉液封閉2 h，倒去封閉液后加入CollagenⅠ、CollagenⅢ、MMP-1、IL-6一抗（1∶200），4℃冰箱過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min，加入二抗，室溫孵育20～30 min，沖洗3次，每次3～5 min，加入辣根酶或堿性磷酸酶的標記物，室溫孵育10 min，沖洗3次，每次3～5 min，滴加顯色劑，復染，脫水，封片。均由2位觀察者獨立閱片，將免疫組化切片置于光鏡下觀察，對染色強度和陽性細胞百分比進行評分［6］。染色強度評分：無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；陽性細胞百分比≤25%計1分，＞25%～50%計2分，＞50%～75%計3分，＞75%計4分。將兩項評分相乘≤7為陰性，＞7為陽性。

1.5 陰道壁組織學形態(tài)和超微結構觀察 采用掃描電子顯微鏡。將標本固定在4%的戊二醛和1%的四氧化鋨中，用梯度乙醇脫水，在臨界點干燥器中干燥，使用離子濺射法將標本金屬鍍膜，在掃描電子顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，比較采用t檢驗。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組陰道壁組織病理變化比較 HE染色結果：對照組陰道上皮組織中只有幾層扁平細胞，細胞多樣性低，血管數(shù)量少。實驗組陰道上皮組織被覆厚厚的復層鱗狀上皮細胞，固有層結締組織富含血管。對照組、實驗組陰道壁上皮厚度分別為（220.76±36.37）、（299.36±45.43）μm。實驗組陰道壁上皮厚度大于對照組（P＜0.05）。Masson染色結果：對照組陰道壁肌肉排列散亂、膠原纖維稀疏；實驗組陰道壁平滑肌組織排列整齊，膠原基質緊密致密。

2.2 兩組陰道壁組織中CollagenⅠ、CollagenⅢ、MMP-1、IL-6蛋白表達比較 見表1。

表1 兩組陰道壁組織中CollagenⅠ、CollagenⅢ、MMP-1、IL-6蛋白表達陽性比較［例（%）］

2.3 兩組陰道壁組織超微結構比較 對照組陰道壁組織表面上皮細胞變性和萎縮，相鄰細胞間隙較大。實驗組陰道壁組織表面出現(xiàn)膜折疊和微絨毛網(wǎng)絡，組織內細胞排列緊密牢固。見圖1。

圖1 兩組陰道壁組織掃描電鏡圖像

3 討論

Collagen是導致陰道壁組織動態(tài)結構變化的重要因素［7］。Collagen是人體內含量最多的蛋白質，占體內蛋白總量的25%～33%，被譽為生命支架，其具有特殊的機械性能和生物學特性，參與維持組織的結構完整性，廣泛分布于皮膚黏膜、骨骼、結締組織、內臟間質、血管、韌帶及筋膜等部位。目前已知有多達28種不同亞型的Collagen，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型占Collagen總量90%以上。CollagenⅢ是人類盆底結締組織中的主要Collagen亞型之一，其構成陰道壁、韌帶、筋膜等盆底結締組織的結構骨架，同時也賦予這些盆底結締組織強度及張力［8］，維持著正常的盆底功能［9］。據(jù)Han等報道，相比于正常女性，絕經(jīng)后盆腔臟器脫垂女性陰道壁組織Collagen含量明顯減少［10］。因為標本采集不便，本研究未設置未絕經(jīng)女性和非盆腔臟器脫垂患者進行對照。經(jīng)過重組人源膠原蛋白干預的患者，陰道壁組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達均有升高。

MMP是一組含鋅離子的蛋白水解酶，能降解包括Collagen在內的幾乎所有的細胞外基質［11］。多項研究表明，絕經(jīng)后女性雌激素水平下降，陰道壁組織中MMP表達升高，Collagen含量減少［12］。本研究表明，重組人源膠原蛋白可以使陰道壁組織中MMP-1表達降低，改善陰道壁上皮厚度和膠原含量，同時，陰道肌肉變得更加緊湊。Collagen和平滑肌增加的機制可能與細胞表面的整合素受體有關［13］。有研究證實，與單純使用局部抗炎藥相比，重組人源膠原蛋白陰道凝膠聯(lián)合局部抗炎藥更能降低絕經(jīng)后萎縮性陰道炎患者血清炎癥因子水平［14］。這與本研究結果一致，重組人源膠原蛋白可減少陰道壁組織炎性細胞因子IL-6的表達，有效改善炎癥因子對陰道壁的刺激，有助于陰道上皮的修復，緩解GSM癥狀。

重組Ⅲ型人源化Collagen超高的細胞黏附活性（活性高于人天然Collagen190%以上）利于肉芽組織生長、成纖維細胞增殖分化和損傷修復，這可以快速緩解陰道干澀瘙癢等癥狀，能在人體中行使天然Collagen的功能。證明卵巢去勢小鼠使用重組Ⅲ型人源化Collagen后能夠有效促進陰道黏膜上皮的增厚、陰道黏膜上皮細胞膜面微絨毛結構恢復、陰道組織中膠原纖維結構重建、陰道黏膜上皮支撐和彈性功能恢復，同時重組人源Ⅲ型Collagen對卵巢去勢小鼠子宮內膜未見明顯影響，更有可能降低患子宮內膜癌的風險，相對于雌激素治療，更安全［13］。絕經(jīng)后女性體內的雌激素水平迅速下降，導致上皮組織學形態(tài)發(fā)生改變，黏膜萎縮，結締組織增生，Collagen呈玻璃樣變；同時上皮細胞數(shù)量減少，糖原合成減少，乳桿菌減少，pH升高，極易引發(fā)GSM相關癥狀。重組人源Ⅲ型Collagen可增加陰道彈性，改善陰道萎縮，減輕性交痛，提高性滿意度；并可通過增加陰道分泌物，提高陰道濕潤度，改善陰道的干燥狀態(tài)，可修復干燥引起的瘙癢、灼熱、皮膚皸裂等GSM所致的陰道癥狀。

本研究表明，重組人源膠原蛋白能夠有效改善絕經(jīng)后陰道壁組織學特征，增加陰道壁組織中Collagen含量，改善膜折疊和微絨毛網(wǎng)絡，并且一定程度上減輕陰道炎癥反應。由于本研究時間短，在未來的研究中，將對重組人源膠原蛋白持續(xù)使用的安全性和應用周期進行長期觀察，進一步論證研究結果。