誘導痰檢測技術在支氣管哮喘中的應用進展

張亞麗，蔣毅

1山西醫科大學第一臨床醫學院，太原 030001；2山西醫科大學第一醫院呼吸與危重癥醫學科

支氣管哮喘（哮喘）是常見的呼吸系統慢性疾病，其本質是慢性氣道炎癥，由多種細胞和細胞因子參與。誘導痰檢測是通過霧化吸入高滲鹽水誘導產生痰液，進而分析其中細胞成分和上清液可溶性介質的一項技術［1］。作為氣道采樣的一種非侵入性方法，誘導痰檢測具有無創、安全、可靠、簡便、可重復、更易被患者接受的優點。已有研究表明，誘導痰和自然咳痰的檢測結果差異并無統計學意義［2］，所反映的氣道炎癥結果也與其他傳統有創技術結果具有一致性，故誘導痰檢測常用于不能自主排痰的患者。誘導痰中的細胞學計數被廣泛用于哮喘的診斷、分型、炎癥水平的評估，其非細胞成分如細胞因子等在哮喘中的作用也在臨床實驗中被反復驗證。近年來，組學在國內外各項研究中的運用不斷成熟。對誘導痰成分進行組學分析，特別是轉錄組學與蛋白組學分析為哮喘診治、病理生理學研究提供了一個全新的方向［3］。本文將從以上幾個方面進行綜述。

1 誘導痰細胞學計數

誘導痰細胞學計數在臨床上已被廣泛應用，主要是對其中的中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞所占百分比進行分析。目前尚無公認的誘導痰細胞計數參考值范圍［4］。

誘導痰細胞學計數結果與傳統診斷、評估哮喘方法具有一致性，但其在哮喘分型、病情評估、個體化治療上的作用不可替代。研究發現，誘導痰嗜酸性粒細胞計數與肺功能中1 s用力呼氣量（FEV1）、1 s用力呼氣量占預計值百分比（FEV1%）、1 s用力呼氣量與用力肺活量比值（FEV1/FVC%）均呈負相關［5-6］。對比誘導痰嗜酸性粒細胞百分比與呼出氣一氧化氮（FeNO）、呼氣峰流速（PEF）變異率、基線FEV1、FEV1/FVC%、口服糖皮質激素后FEV1的變化等在哮喘中的診斷價值，發現痰嗜酸性粒細胞的敏感度（86%）和特異度（88%）最高［7］。誘導痰細胞學計數反應的氣道炎癥水平可用來評估病情，還可根據誘導痰中細胞學計數所占比例比將哮喘分為四種表型：嗜酸性粒細胞型（單純嗜酸性粒細胞百分比≥2.5%，中性粒細胞百分比＜61%）、中性粒細胞型（中性粒細胞百分比≥61%）、混合細胞型（嗜酸性粒細胞百分比≥2.5%且中性粒細胞百分比≥61%）、寡細胞型（各細胞比例均在正常范圍）［8-9］。不同表型哮喘患者表現為不同的臨床特征。誘導痰嗜酸性粒細胞比例在重癥哮喘患者中顯著增高，可見誘導痰嗜酸性粒細胞水平可能與哮喘嚴重程度、肺功能下降有關。也有研究證明，誘導痰中性粒細胞比例的升高與哮喘嚴重程度密切相關［10］。中性粒細胞比例增高還多見于老年哮喘患者，或空氣污染、細菌、病毒感染的哮喘患者［11-12］。連續監測痰中嗜酸性粒細胞以量身定制成人哮喘治療方案可能會減少哮喘惡化，這在兒童哮喘中也同樣得到證明［13-14］。

臨床中誘導痰細胞學計數可反映氣道炎癥類型及水平的動態變化，借以評估治療效果，及時調整治療方案，還有利于長期優化管理和評估預后。但目前由于時間和成本問題，在臨床工作中進行頻繁的誘導痰分析被限制，其在臨床實踐中的診斷和治療價值還需要進一步探索和發展。

2 誘導痰中的細胞因子

誘導痰中各種非細胞成分中，細胞因子檢測在臨床及各項研究中的運用最為常見。誘導痰中細胞因子主要是由氣道上皮細胞和各種免疫細胞產生，在哮喘發病的各個階段發揮作用并參與哮喘的發生和發展［15］。根據引起氣道炎癥的免疫反應不同，哮喘可以分為2型與非2型，分別由不同的細胞因子介導。呼吸道嗜酸性粒細胞浸潤是哮喘的病理特征，Th2型細胞因子IL-4、IL-5、IL-13、巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）等參與嗜酸性細胞的活化、增生、聚集曾被認為在哮喘發病中起主要作用；IL-4、IL-13還可促進免疫球蛋白E的分泌，促進氣道炎癥的形成與維持。近年來研究發現IL-13還參與維持氣道高反應性、氣道重塑，在哮喘中發生、發展中的作用越來越引起重視。參與非2型哮喘發病的細胞因子及可能的機制：IL-8、TNF-ɑ、白三烯B4趨化形成肺組織中性粒細胞炎癥；IL-17介導的3型免疫反應；干擾素-γ介導的1型免疫應答；全身性炎癥反應（由IL-6介導）。還有一些由氣道上皮細胞產生的細胞因子如胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP）、IL-25、IL-33、IL-8，作為促炎因子，促進各型免疫反應的極化，在哮喘發病的初期起重要作用。

哮喘患者誘導痰中細胞因子水平與正常對照組之間有著明顯差異已被反復驗證，且與疾病嚴重程度、控制情況密切相關。曾有研究表明，在重癥哮喘患者誘導痰中GM-CSF、IL-26明顯增多［16］。近期的研究也發現，誘導痰中TSLP、TNF-α等水平與哮喘嚴重程度密切相關［17］，IL-6與FEV1、FEV1/FVC呈顯著負相關［18］。還有研究證明，誘導痰中TNFR1和TNFR2在中性粒細胞型哮喘和重癥哮喘患者中明顯增加，其水平還與肺功能、哮喘控制情況、年齡密切相關［19］。研究發現，IL-5、IL-17a、IL-25 mRNA高表達的患者肺功能參數明顯下降；哮喘未控制組痰中IL-5、IL-17a、IL-25 mRNA表達高于哮喘控制組，IL-5、IL-17a高表達的哮喘患者中未控制哮喘發生率顯著高于低表達的哮喘患者，IL-5、IL-17a、IL-25高表達的患者哮喘往往難以控制［20］。

除了對哮喘病情評估，誘導痰中細胞因子檢測在不同哮喘表型的病理生理分析上也被廣泛應用，為制訂個體化的治療方案提供理論依據。研究發現，老年哮喘患者中性粒細胞和嗜酸性粒細胞水平升高，IL-1β、IL-6、IL-8、嗜酸細胞活化趨化因子-1、GM-CSF、與Th17細胞相關的細胞因子蛋白表達升高。研究還表明，老年哮喘患者痰中IL-6、人類巨噬細胞炎性蛋白3α水平升高與哮喘控制率降低顯著相關，痰中中性粒細胞、IL-1β、IL-6和人類巨噬細胞炎性蛋白3α水平升高與過去12個月住院風險增加相關［21］。關注誘導痰中細胞因子的檢測有助于針對老年哮喘患者這一特殊人群制訂新的管理策略。FEV1快速下降的哮喘患者誘導痰中IL-5、IL-8水平明顯上升。這些因子可能是哮喘患者FEV1加速下降的非侵入性生物標志物和治療靶點［22］。檢測分析誘導痰中細胞因子雖然還沒有廣泛運用于臨床，但在哮喘的發病、病情評估、個體化治療等研究中的作用已被反復驗證。

3 誘導痰轉錄組學

轉錄組學在整體水平上研究細胞或組織中基因的轉錄情況，反映不同組織或細胞中基因轉錄的總體特征。利用誘導痰轉錄組學可以對異質性的標本進一步分析，有助于加深對哮喘的認識，為哮喘的發病機制研究及診斷提供新思路，甚至可能為治療提供新靶點，特別是近年來被用于重度哮喘，使重度哮喘研究有了全新突破。

一項研究采用無監督聚類分析法對哮喘患者痰與血轉錄組分析確定了三個具有不同臨床和生理特征的“轉錄內型”，其中兩種與重度哮喘特征相關，表明哮喘個體中存在著與年齡、發病年齡或持續時間無關的常見、穩定的基因表達模式，其中嚴重哮喘患者中基因表達存在系統性改變［23］。BAINES等［24］對哮喘患者誘導痰的全基因組基因表達譜采用皮爾遜中心完全鏈接算法進行聚類分層分類，將哮喘在轉錄水平上分為三種表型，第一種富含嗜酸性粒細胞，第二種富含中性粒細胞，而第三種表型不遵循粒細胞炎癥模式。這與之前根據誘導痰細胞學分類確定的嗜酸性、嗜中性和寡細胞型哮喘的炎癥表型相似，但并未對混合細胞型單獨分類，混合粒細胞性炎癥哮喘被視為一種過渡型炎癥，根據細胞計數比例被歸在第一類或第二類中。這三種基因表達差異與哮喘癥狀、免疫和炎癥反應均有關。這項研究支持了哮喘的分子異質性，為進一步探討哮喘表型的病理機制提供一個框架。

近年來誘導痰轉錄組學被運用于特殊類型哮喘機制研究不斷取得新進展。一項研究對重度哮喘患者、非重度控制哮喘患者、非重度未控制哮喘患者、健康對照組的誘導痰轉錄組分析發現，與其他組相比，重度哮喘患者的基因差異性表達。其中最明顯的是CLC，它是嗜酸性炎癥的標志，可能反映嚴重哮喘患者痰嗜酸性粒細胞的升高，進一步通路分析發現p38通路基因高度表達，這表明p38信號通路在嚴重哮喘的發病中起重要作用，p38通路可能為重癥哮喘潛在的治療靶點［25］。KIM等［26］對老年患者誘導痰進行轉錄組學分析，根據聚類分析，將老年哮喘患者分為兩個不同的分子簇，其中OXPHS基因集在一個聚類中顯著豐富，EMT基因在另一個聚類中顯著豐富，這兩種基因分別與氧化應激和細胞衰老引起的細胞組織重塑有關，提示這兩種機制參與老年哮喘的發生與發展。

4 誘導痰蛋白組學

隨著質譜和生物學技術的發展，蛋白組學被應用于多種疾病的研究［27］。通過對生物材料中的數百個蛋白進行測序，可獲得大量生物學信息。對人體在疾病或疾病前期表現出的或優先表現出的蛋白質進行測定、鑒別有助于發現疾病新的生物標志物，為哮喘發病機制、診斷及特異性治療提供新思路。

對哮喘患者誘導痰進行蛋白組學分析，發現不同臨床表型哮喘患者蛋白差異表達，同樣，不同蛋白組哮喘患者臨床特征也有所不同。一項對誘導痰蛋白組學綜合質譜分析的研究發現，典型哮喘、咳嗽變異性哮喘（CVA）、胸悶變異性哮喘（CTVA）患者的痰液中有23種蛋白分泌量顯著高于健康對照組，而這三種哮喘患者的誘導痰在蛋白譜和蛋白水平上無明顯差異，再次驗證了典型哮喘、CVA、CTVA具有相似的發病機制。但三種哮喘患者痰液中的部分蛋白表達存在差異，這些蛋白可作為不同臨床表現哮喘的特異蛋白，用于其機制、診斷、治療等的進一步研究［28］。對哮喘控制良好與控制不佳患者的血液和誘導痰進行蛋白質組學分析，發現在血液和誘導痰中均可測得一組生物標志物，其在兩組間濃度存在差異［29］。SCHOFIELD等［30］對246例受試者（206例哮喘患者）的痰上清液采用無偏標記定量質譜和拓撲數據分析方法進行分析，基于蛋白質組特征的相似性，將哮喘分為10個蛋白質型，其中3個為嗜酸性粒細胞型，3個為嗜中性粒細胞型，2個為粒細胞炎癥較低的特應型，另外2個根據其粒細胞偏向被歸為嗜酸性細胞型或嗜中性粒細胞型，實現了比目前僅通過粒細胞計數表型更深層次的分層，這三種粒細胞分型各有其對應的臨床特點，而其蛋白組型之間存在差異，又相互聯系。

誘導痰蛋白組學還有利于哮喘早期診斷及與其他疾病的鑒別診斷。一項針對慢性支氣管炎/慢性黏液分泌過多患者的研究，通過誘導痰蛋白定量方法，成功鑒別出一組蛋白質，它們可以不依賴于患者的臨床表現和影像、功能學檢查，對慢性支氣管炎、哮喘、慢阻肺和哮喘-慢阻肺重疊進行早期診斷，證明了誘導痰蛋白組學在鑒別氣道疾病方面的潛力［31］。同樣，對已確診為哮喘、過敏性鼻炎、慢性阻塞性肺疾病、囊性纖維化、支氣管擴張的患者誘導痰蛋白組學進行分析，分別可鑒別出一組蛋白，其表達在不同疾病中存在差異［32-33］。相較于一種生物標志物，蛋白組學在哮喘診斷、鑒別診斷方面表現出其優勢。

綜上所述，誘導痰細胞學計數已被廣泛用于臨床，其非細胞成分在各項臨床研究中的應用也已經很成熟，近年來組學在誘導痰中的應用為哮喘的研究提供了一個全新的方向。且隨著檢測技術的成熟、成本的降低、研究方法的不斷更新，越來越多的生物信息可從誘導痰中獲取，并用于臨床工作與實驗研究。誘導痰檢測技術在哮喘的診斷、監測疾病、研究發病機制和治療中的潛力值得我們期待。