尹玉婷，黃煒

上海市中醫藥大學附屬龍華醫院藥學部，上海 200032

肝癌具有易轉移、侵襲及預后不良等特點［1］，5年生存率僅為16.8%［2］。肝癌以手術治療為主，放療等為輔，但肝癌細胞敏感性低限制了放療在臨床的應用［3-4］。近年來，中醫藥在癌癥治療上已經取得了明顯的效果。白頭翁含有多種化學成分（三萜皂苷類、三萜酸和糖蛋白等），具有抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調節和抗腫瘤等藥理活性，參與腫瘤細胞的增殖、凋亡和自噬等過程［5-6］。白頭翁皂苷A（PSA）是白頭翁皂苷類分離提取的單體成分之一［7］，可抑制乳腺癌細胞的增殖，增加其放療敏感性［8］。SIRT1在肝癌細胞中表達上調，miR-29c通過調控SIRT1表達調節肝癌細胞的增殖、凋亡和化學耐藥性［9］。PSA在肝癌細胞中的增殖、轉移和放療敏感性的作用機制尚不明確。因此，2018年6月—2019年8月，本研究通過體外培養肝癌細胞（HepG2細胞），探討PSA對HepG2細胞增殖、遷移、侵襲和放療敏感性的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 HepG2細胞購自上海生命科學院細胞庫；胎牛血清、RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000試劑盒、TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司；PSA購自上海翰香生物科技有限公司；si-NC、si-SIRT1、pcDNA、SIRT1序列和引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；MTT試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；Transwell、Matrigel膠購于美國Corning公司；反轉錄試劑盒、AceQ qPCR SYBR?Green Mix試劑盒購自日本TaKaRa公司；SIRT1抗體購自美國Abcam公司。Synergy HT型酶標儀購自美國Bio Tek公司；BDS200型倒置相差顯微鏡購自重慶奧特光學儀器有限公司；Applied Biosystems PCR熱循環儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 細胞培養及分組 將細胞置于含胎牛血清的RPMI-1640培養基內培養，然后置于恒溫培養箱，條件設置為37℃、5%CO2。收集對數生長期的細胞，調整細胞密度為1×106/mL，接種到96孔板，分別用不同濃度（0、10、15、20 mg/L）PSA干預24 h，根據實驗結果，分別將0、20 mg/L PSA干預的細胞記為對照組、PSA組。

1.3 細胞增殖能力檢測 采用MTT法。取以上兩組細胞，調整細胞密度為3×104/mL，接種到96孔板中，并在每孔加入5 g/L MTT溶液，在恒溫培養箱內繼續培養4 h，加入DMSO溶液150μL，用酶標儀檢測每孔490 nm波長處的OD值。細胞活力（%）=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.4 細胞遷移、侵襲能力檢測 采用Transwell實驗。細胞遷移能力檢測：取以上兩組細胞，離心后通過無血清的RPMI-1640培養基，調整細胞懸液密度至2×105/mL。在Transwell上室加入細胞懸液200μL，下室加入含血清的RPMI-1640培養基500μL。在恒溫培養箱培養24 h，用甲醇固定，結晶紫染色30 min后，隨機選取3個視野，100倍顯微鏡下觀察細胞遷移數目，計數取平均值。細胞侵襲能力檢測：將無血清的RPMI-1640培養基、Matrigel膠按照5∶1混合稀釋，調整細胞懸液，其余步驟同遷移能力檢測。

1.5 細胞放療敏感性檢測 采用克隆形成實驗、單擊多靶模型。取以上兩組細胞，接種至6孔板內，然后分別給予0、2、4、6、8 Gy X射線照射24 h，在恒溫培養箱內繼續培養10～14 d。去培養基，PBS清洗2次，甲醇固定15 min，結晶紫染色30 min。在顯微鏡下選取細胞≥50個集落數，計算細胞存活分數。采用單擊多靶模型在Graph Pad Prism 7.0擬合細胞存活曲線，模擬單擊多靶模型，并計算以下參數：平均致死劑量（D0）、準閉劑量（Dq）、2 Gy細胞存活分數（SF2）、外推值（lnN=Dq/D0）、參數值（k=1/D0）、放射增敏比（SER）。

1.6 細胞內SIRT1 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。通過TRIzol試劑盒提取以上兩組細胞的總RNA后，檢測其細胞濃度和純度，然后反轉錄合成cDNA，經AceQ qPCR SYBR?Green Mix試劑盒進行PCR擴增。反應體系20μL：cDNA 1μL，正、反向引物各0.5μL，2×SYBR Green 10μL，無菌蒸餾水8μL。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性20 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s共40個循環。以GAPDH為內參。用2-ΔΔCt法計算SIRT1 mRNA相對表達量。SIRT1正向引物5'-GTTGTGTGCCTTCGTTTTGGA-3'，反向引物5'-AGGCCGGTTTGGGCTTATACA-3'；GAPDH正向引物5'-AGCTACTGGCGTCTTCACC-3'，GAPDH反向引物5'-CCACGATGCCAAAGTTGTCA-3'。

1.7 細胞內SIRT蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取以上兩組細胞加入裂解液后，提取各組細胞的總蛋白。按照蛋白上樣量50μg在凝膠電泳處理，將蛋白轉移至PVDF膜內。室溫封閉培養1.5 h并加入5%脫脂奶粉，然后加入一抗SIRT，稀釋比例為1∶800，PBS清洗3次，加入山羊抗鼠IgG二抗稀釋1∶5 000，PBS繼續清洗3次，暗室內加入化學發光液顯影、定影。Quantity One軟件分析灰度值，以CAPDH為內參。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.8 統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件。符合正態分布的計量資料用±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

隨PSA濃度的增加，HepG2細胞活力、遷移細胞數目、侵襲細胞數目均逐漸降低（P均＜0.05），見表1。經0、2、4、6、8 Gy X射線照射后，對照組細胞存活分數分別為100%、61.0%、35.4%、16.2%、6.0%，PSA組細胞存活分數分別為100%、28.1%、7.5%、1.4%、0.5%。與對照組比較，PSA組細胞存活分數低（P均＜0.05）。單擊多靶模型參數見表2。與對照組比較，PSA組SIRT1 mRNA、蛋白表達低（P均＜0.05），見表3。

表1 不同濃度PSA對Hep G2細胞增殖、遷移、侵襲的影響（±s）

表1 不同濃度PSA對Hep G2細胞增殖、遷移、侵襲的影響（±s）

注：與0 mg/L比較，*P＜0.05。

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表2 對照組與PSA組單擊多靶模型參數

表3 對照組與PSA組SIRT1表達比較（±s）

表3 對照組與PSA組SIRT1表達比較（±s）

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3 討論

肝癌是全球癌癥死亡較高癌癥之一，每年死亡患者高達70萬例［10］，其發病受多種因素的影響，如家族遺傳、肥胖、環境和病毒感染等［11-12］。近年來，由于國民生活質量逐步提高，肝癌患者發病呈現年輕化趨勢，嚴重威脅人類的生命健康安全。肝癌起病隱匿，在肝癌早期臨床癥狀不甚明顯，多數肝癌患者發現時已經處理中晚期，這是肝癌患者治療面臨的一大難題。隨著醫療水平的進步，放療是臨床治療肝癌的主要手段，但仍存在5年生存率低、復發和產生放療耐藥性等問題［13］。

白頭翁屬于毛莨科植物白頭翁的干燥根，具有清熱解毒、涼血止痢的功效，可用于治療痢疾、濕疹和血痣等［14］。白頭翁具有豐富的化學成分，其中有效成分皂苷對腫瘤的治療效果明顯。任楠楠等［15］研究結果顯示，白頭翁皂苷B4處理宮頸癌細胞，可通過激活Notch信號通路抑制宮頸癌細胞的增殖和自噬。不同濃度白頭翁皂苷可過抑制MAPK信號通路抑制肺癌細胞增殖，并誘導細胞凋亡［16］。有研究結果顯示，白頭翁皂苷B4可抑制肝癌細胞增殖，使細胞周期阻滯，并誘導細胞凋亡［17］。彭超軍［18］研究結果顯示，PSA可以明顯抑制非小細肺癌細胞的增殖，增加放療敏感性，并誘導其細胞凋亡。以上均說明白頭翁皂苷的抗腫瘤效果良好，對肝癌細胞具有增殖抑制和凋亡促進的作用，但是其對肝癌細胞遷移、侵襲和放療敏感性的機制研究相對較少。鑒于此，本研究采用不同濃度PSA處理HepG2細胞，通過MTT、Transwell實驗檢測PSA對HepG2細胞增殖、遷移、侵襲的影響，結果顯示HepG2細胞活力、遷移細胞數、侵襲細胞數呈劑量效應關系降低，提示PSA可抑制明顯抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲。

電離照射細胞后，一些細胞會延遲死亡，這種細胞死亡程度與照射劑量有關，常用存活細胞分數表示，因此使用單擊多靶模型對存活細胞分數與照射劑量進行擬合，計算得出相關參數值。使用多靶單擊模型計算多個參數，其中D0反映每個細胞平均被擊中所需的輻射劑量，Dq反映修復亞致死細胞損傷能力的大小，SF2反映敏感程度，lnN反映細胞內放射敏感區域，k是與射線的質及細胞敏感性有關的常數，SER反映細胞敏感度變化，SER越大反映輻射敏感程度越大［19］。本研究使用20 mg/L的PSA處理HepG2細胞，結果顯示，PSA組細胞存活分數明顯降低高于對照組，提示PSA對肝癌細胞的放療敏感性增加，這與相關研究［18］結果相似。

Sirtuins蛋白家族具有多種催化功能，在調節葡萄糖和脂質代謝中具有重要作用。SIRT1是Sirtuins蛋白家族其主要成員之一，可介導參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲和放射治療等生物學過程［20-21］。SIRT1在肝癌細胞中高表達，杜仲醇可以下調SIRT1抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導其細胞凋亡［22］。下調SIRT1表達可促進肝癌細胞增殖、遷移，誘導其凋亡［23］。有研究發現，miR-204-5p通過下調SIRT1表達促進肝癌細胞增殖和藥物敏感性，并 誘 導 細 胞凋 亡［24］。miR-150-5p通 過抑 制SIRT1表達誘導肝癌細胞凋亡，增加肝癌細胞的放療敏感性［25］。以上說明SIRT1與肝癌發展密切相關，可以作為肝癌治療和診斷的作用靶點。本研究結果顯示，PSA處理HepG2細胞后，細胞中SIRT1 mRNA、蛋白表達下調，提示PSA可調控SIRT1表達。PSA可通過調控SIRT1的表達影響肝癌的惡性進展。

綜上所述，PSA可以明顯抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，增加其放療敏感性，其作用機制可能與SIRT1有關，這為PSA對肝癌細胞的研究提供新的實驗研究基礎。本研究也存在不足之處，關于PSA對肝癌細胞的具體作用機制，及其可能相關的信號通路，需進一步探索。