刺槐素對Nigericin誘導小鼠骨髓巨噬細胞NLRP3炎癥小體活化的影響

補娟，史深，周玲，張曉玲，葉勒丹·馬漢，朱沂

1新疆維吾爾自治區人民醫院醫學研究與轉化中心，烏魯木齊 830001；2新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心；3新疆維吾爾自治區人民醫院神經內科

含NLR家族Pyrin域蛋白3（NLRP3）炎癥小體是由斑點樣蛋白、NLRP3和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1前體（Pro-caspase-1）組成的多聚蛋白化合物。活化的NLRP3炎癥小體導致Caspase-1活化，介導炎癥因子IL-1β和IL-18的釋放，進而促進炎癥反應以及細胞焦亡［1］。NLRP3炎癥小體活化失調會導致許多疾病的發生［2］。抑制NLPR3炎癥小體的激活可能是治療這些疾病的潛在靶點，但目前臨床還未見靶向NLPR3炎癥小體的治療藥物。隨著深入研究，在動物實驗中發現了效果較好的NLPR3炎癥小體抑制劑［3-4］。但這些藥物存在特異性不強、半衰期短、生物利用度差、臨床應用前景不明等缺點，需要進一步尋找靶向NLRP3炎癥小體的特異性抑制劑。刺槐素又稱刺槐黃素、金合歡素，屬黃酮類化合物，可從菊花、刺槐、雪蓮等多種植物中提取獲得，相對分子質量小，易通過血腦脊液屏障，不良反應小，具有多種藥理活性。目前研究發現，刺槐素可以誘導細胞凋亡、抑制癌細胞存活發揮抗癌作用［5-6］。刺槐素通過抑制NF-κB、MAPK通路下調TNF-α和IL-1β的表達，發揮抗炎作用，對動物模型的關節炎、帕金森病（PD）等炎性疾病具有治療作用［7］。但刺槐素作用靶點和具體機制尚不明確。我們前期研究發現，刺槐素和NLRP3炎癥小體有關［8］，但是刺槐素是直接作用于NLRP3炎癥小體，還是通過抑制腦缺血再灌注損傷后的級聯反應間接抑制NLRP3炎癥小體的表達尚不明確。本研究于2019年11月—2020年11月探討刺槐素對尼日利亞菌素（Nigericin）誘導的NLRP3炎癥小體激活的影響，為其成為靶向NLRP3炎癥小體的候選藥物奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 12周SPF級健康雄性C57BL/6小鼠，體質量（25±2）g，購自新疆維吾爾自治區實驗動物研究中心，許可證號：SCXK（新）2016-0001；給予標準飼料，自由飲水，室溫保持在22～26℃，濕度45%～60%。本實驗嚴格遵循科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》。胎牛血清（FBS）購自上海Excell Bio公司；DMEM（高糖）培養基、胰酶、青霉素-鏈霉素雙抗均購自美國GIBCO公司；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GMCSF）、脂多糖（LPS）、刺槐素均購自美國SIGMA公司；小鼠TNF-α、IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒購自杭州聯科生物有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Nigericin購自美國InvivoGen公司；Anti-IL-1β抗體、Anti-Pro Caspase-1+p10+p12抗體購自美國Abcam公司。熒光倒置顯微鏡購自日本尼康公司；蛋白電泳儀、轉膜儀購自美國Bio-Rad公司；化學發光成像儀系統購自上海勤翔科學儀器有限公司。

1.2 小鼠骨髓巨噬細胞（BMDM）原代分離培養 頸椎脫臼處死小鼠，取雙側脛骨和股骨至超凈工作臺。仔細分離肌肉等組織，完整暴露骨質，離斷兩端，用無菌PBS溶液沖洗骨髓至DMEM培養基中。室溫下1 000 r/min，離心10 min（離心半徑10 cm），棄上清，用2 mL紅細胞裂解緩沖液重懸，在冰上靜止5 min。加入8 mL含10%FBS及1%雙抗的DMEM培養基，1 400 r/min室溫離心5 min（離心半徑10 cm）。棄上清液，用含10 ng/mL粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的DMEM培養基（10%FBS及1%雙抗）重懸。用移液器反復吹打使細胞混勻，然后將細胞懸液轉移到培養皿，于37℃細胞培養箱培養。3 d后，全換液；5 d后，半換液。顯微鏡下觀察細胞貼壁及分化情況，鏡下可見細胞貼壁良好，伸出偽足，呈梭形［11］。

1.3 細胞分組及NLRP3炎癥小體刺激 將細胞隨機分為六組：空白對照組、LPS組、LPS+Nigericin組、LPS+2.5μmol/L刺槐素+Nigericin組、LPS+5μmol/L刺槐素+Nigericin組和LPS+10μmol/L刺槐素+Nigericin組。于12孔板每孔置入5×105個BMDM，除空白對照組外，其他各組加入LPS（50 ng/mL）預處理3 h，除空白對照組、LPS組外其他各組繼續加入不同劑量（2.5、5、10μmol/L）刺槐素處理細胞0.5 h，然后加入刺激劑Nigericin（10μmol/L）處理0.5 h。

1.4 裂解液中Pro-caspase-1、Pro-IL-1β和上清液中caspase-1、IL-1β表達檢測 采用Western blotting法。收集細胞樣品并提取蛋白，BCA法蛋白定量。蛋白質樣品加熱變性后，取30μg樣品，以12%凝膠濃度進行SDSPAGE凝膠電泳。電泳條件：濃縮膠80 V，分離膠100 V。電泳結束后，將膠上蛋白質條帶轉移至PVDF膜上。裂解液Pro-caspase-1、Pro-IL-1β及β-Actin使用0.45μmol/L PVDF膜，上清液caspase-1、IL-1β使用0.20μmol/L PVDF膜，Pro-IL-1β、Pro-caspase-1、caspase-1、IL-1β及β-Actin轉膜時間為60 min。將轉印后的膜用封閉劑（5%牛血清白蛋白，TBST配制）在室溫下封閉2 h，不需洗膜，將膜分別加入含兔抗大鼠β-肌動蛋白（1∶5 000）、兔抗Pro-IL-1β及IL-1β（1∶500）及兔抗Pro-caspase-1、caspase-1（1∶1 000），4℃孵育過夜。TBST洗滌10 min×3次，加入相應的二抗抗體（1∶5000），室溫下孵育2 h。TBST洗滌10 min×3次，將化學發光試劑A液和B液按1∶1比例配制，均加2 mL至膜上，用ChemiScopeMini化學發光儀檢測、拍照。以目的基因條帶吸光度值/β-Actin吸光度值計算各蛋白相對表達量。

1.5 上清液中IL-1β、IL-18、TNF-α檢測 采用ELISA法。收集各組細胞上清液。按試劑說明書進行操作。使用酶標儀進行雙波長檢測，測定450 nm最大吸收波長和570 nm參考波長下的OD值。校準后OD值為450 nm的測定值減去570 nm的測定值。

1.6 細胞上清液LDH檢測 收集每組細胞上清液，按照LDH試劑說明書進行操作。酶標儀檢測波長450 nm處吸光度值。LDH濃度（U/L）=（測定OD值-對照OD值）/（標準OD值-空白OD值）×標準品濃度（0.2μmol/mL）×1 000。

1.7 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 刺槐素對Nigericin誘導NLRP3活化的影響見表1。

表1 各組裂解液和上清液中相關蛋白表達比較（±s）

表1 各組裂解液和上清液中相關蛋白表達比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，▲P＜0.05；與LPS+Nigericin組比較，#P＜0.05；與LPS+2.5μmol/L刺槐素+Nigericin組比較，▼P＜0.05；與LPS+5μmol/L刺槐素+Nigericin組比較，☆P＜0.05。

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2.2 刺槐素對Nigericin誘導NLRP3活化后炎癥因 子釋放的影響 見表2。

表2 各組細胞上清液中IL-1β、IL-18、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組細胞上清液中IL-1β、IL-18、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，▲P＜0.05；與LPS+Nigericin組比較，#P＜0.05；與LPS+2.5μmol/L刺槐素+Nigericin組比較，▼P＜0.05；與LPS+5μmol/L刺槐素+Nigericin組比較，☆P＜0.05。

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2.3 刺槐素對Nigericin誘導NLRP3活化后細胞死亡的影響 空白對照組、LPS組、LPS+Nigericin組、LPS+2.5μmol/L刺槐素+Nigericin組、LPS+5μmol/L刺槐素+Nigericin組、LPS+10μmol/L刺槐素+Nigericin組LDH活性分別為（205.797±101.532）、（991.304±287.483）、（1 759.420±331.387）、（1 388.406±358.777）、（985.507±302.770）、（1 063.768±315.010）U/L。與空白對照組比較，LPS組LDH活性高（P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+Nigericin組LDH活性高（P＜0.05）；LPS+Nigericin組LDH活性與LPS+2.5μmol/L刺槐素+Nigericin組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與LPS+Nigericin組比較，LPS+5μmol/L刺槐素+Nigericin組、LPS+10μmol/L刺槐素+Nigericin組LDH活性低（P均＜0.05）；LPS+2.5μmol/L刺槐素+Nigericin組、LPS+5μmol/L刺槐素+Nigericin組、LPS+10μmol/L刺槐素+Nigericin組LDH活性比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

多項研究表明，刺槐素具有抗炎作用。在細胞實驗中，刺槐素可抑制活性氧（ROS）的產生，增加血紅素氧合酶1和轉錄因子NF-E2相關因子2的活性，抑制炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達，從而減輕LPS誘導的肺損傷［9］。研究發現，刺槐素抑制脂肪細胞和肥胖小鼠的脂肪形成，降低炎癥介質的水平和促分裂原活化蛋白激酶、NF-κB的活性［10］。刺槐素可調節輔助性T細胞17和調節性T細胞的分化，減輕膠原誘導的關節炎小鼠的癥狀［11］。離體實驗發現，刺槐素能抑制LPS刺激小膠質細胞細胞后一氧化氮、誘導型一氧化氮合酶、前列腺素E2、環氧化酶、TNF-α、IL-1β的表達［12］。除此之外，刺槐素對炎性疾病PD［13］、AD［14］和糖尿病［25］等具有很好的治療效果。但刺槐素的抗炎機制并不明確。

我們前期研究發現，刺槐素可增加氧糖剝奪后人神經母細胞瘤（SH-SY5Y）細胞的存活率，降低細胞死亡率，減少缺血再灌注損傷后的腦梗死體積，改善神經功能評分，抑制小膠質細胞介導的炎癥反應，進而抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路，對腦缺血再灌注損傷發揮治療作用。

NLRP3炎癥小體在炎癥相關疾病的發生發展中扮演了重要角色，而刺槐素對該類疾病具有顯著的治療作用，且同時伴隨NLRP3炎癥小體活性的降低和IL-1β表達的減少。推測刺槐素的抗炎癥作用與NLRP3炎癥小體存在聯系。我們通過分離培養小鼠BMDM，采用NLRP3炎癥小體經典活化劑Nigercin活化NLRP3，觀察刺槐素對NLRP3炎癥小體活化導致的caspase-1活化以及IL-1β分泌的影響，結果顯示刺槐素可以抑制caspase-1活化，10μmol/L刺槐素干預可顯著抑制IL-1β分泌。因此，我們推測刺槐素可作為NLRP3炎癥小體的候選抑制劑。并且研究發現，10μmol/L對NLRP3炎癥小體活化具有很好的抑制效果，為后續實驗劑量的選擇奠定了基礎。但是刺槐素能否特異性抑制NLRP3炎癥小體，刺槐素對其他炎癥小體是否有抑制作用還需要進一步研究。

目前研究認為NLRP3炎癥小體的活化需要兩個過程，第一信號是預刺激，第二信號是活化過程。預刺激是由Toll樣受體、核苷酸結合寡聚結構域2、Ⅰ型腫瘤壞死因子受體或Ⅱ型腫瘤壞死因子受體介導，其目的是為了激活NF-κB信號通路，從而上調NLRP3和Pro-IL-1β的表達。活化過程，細胞外源的病原相關分子模式或機體內部的危險相關分子模式刺激，激活NLRP3招募各種相關蛋白組裝炎癥小體，隨后caspase-1自剪切激活并導致IL-1β和IL-18成熟和分泌，伴隨著細胞焦亡的發生［15］。因此我們進一步采用ELISA法觀察刺槐素對LPS預刺激過程中TNF-α的影響以及對活化過程中IL-1β、IL-18的影響，結果發現僅10μmol/L的刺槐素能下調預刺激過程中產生的TNF-α，而刺槐素可以濃度依賴性抑制活化過程中IL-1β、IL-18的表達。說明刺槐素在NLRP3炎癥小體活化的兩個過程中都發揮了作用，為進一步深入機制研究提供了方向。

正常情況下LDH存在于細胞質內，當細胞損傷或死亡時釋放到細胞外，所以細胞死亡數目與細胞培養上清中LDH活性呈正比。本研究采用LDH法分析了刺槐素對NLRP3炎癥小體活化后引起的細胞死亡的影響，發現刺槐素能明顯下調LDH的釋放，從而抑制細胞死亡，進一步證明刺槐素抑制了NLRP3炎癥小體活化。

綜上所述，本研究證實刺槐素可以抑制Nigercin誘導的NLRP3炎癥小體的激活，但抑制NLRP3炎癥小體激活的機制還需要深入研究。