犬細小+犬冠狀+賈第鞭毛蟲抗原三合一膠體金檢測卡的制備與評價

莊昕哲，孫曉笛

（杭州奧泰生物技術(shù)股份有限公司，浙江 杭州 310018）

犬細小病毒病是由犬細小病毒（canine parvovirus，CPV）引起的急性傳染病，可通過嘔吐物、糞便及唾液傳播。犬細小病毒病發(fā)病率、病死率高，傳染性強[1-2]，多發(fā)生于寒冷季節(jié)，6月齡以下幼犬最易感，純種犬較雜種犬發(fā)病率明顯更高[3-4]。臨床上可分為腸炎型和心肌炎型。腸炎型的主要臨床表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、體溫升高、糞便稀而腥臭、體重明顯下降；心肌炎型則無明顯臨床特征，易突然衰竭死亡[5-6]。犬冠狀病毒病是一種由犬冠狀病毒（canine coronavirus，CCV）引起的高度接觸性腸道傳染病，以急性腸炎、水樣腹瀉、血便、嘔吐和脫水為主要特征[7-9]。該病多發(fā)于寒冷季節(jié)，主要通過糞便傳播，也可垂直傳播，2～4 月齡幼犬感染發(fā)病率幾乎為100%，病死率50%；成年犬的病死率相對較低[10-11]。賈第鞭毛蟲（Giardia）寄生于動物小腸，可引起人畜共患的慢性腸道原蟲性感染疾病，即賈第鞭毛蟲病[12-13]。Giardia 多感染6 月齡以下的幼年犬貓，主要臨床表現(xiàn)為幼年犬貓急性、慢性或間歇性腹瀉以及長期腹瀉導致營養(yǎng)不良、發(fā)育遲緩；成年犬貓感染后多無臨床表現(xiàn)。該病以糞便及污水為主要傳播途徑，流行率高，嚴重時可繼發(fā)犬細小病毒病及犬冠狀病毒病等嚴重傳染病[14-15]。

上述動物傳染病均以傳染性極強為主要特征，尤其易對幼年犬貓的健康造成危害，及時發(fā)現(xiàn)治療尤為重要。膠體金檢測為臨床上最方便快捷的檢測方法之一。因此，本研究采用膠體金免疫層析技術(shù)，制備可快速檢測CPV、CCV和Giardia的三合一膠體金檢測卡，評價其檢測效果，為CPV、CCV和Giardia的臨床診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：抗犬細小病毒抗體（CPV-Ab1）、抗犬細小病毒抗體（CPV-Ab2）、抗犬冠狀病毒抗體（CCV-Ab1）、抗犬冠狀病毒抗體（CCV-Ab2）、抗賈第鞭毛蟲抗體（Giardia-Ab1）、抗賈第鞭毛蟲抗體（Giardia-Ab2）、鼠IgG、羊抗鼠IgG均購自傲銳生物醫(yī)藥科技有限公司；鏈霉親和素和生物素購自Sigma 公司；犬細小病毒陽性樣本（CPVAg）、犬冠狀病毒陽性樣本（CCV-Ag）和賈第鞭毛蟲陽性樣本（Giardia-Ag）均由杭州寵物醫(yī)院提供。

主要儀器：連續(xù)點膜機及點金標機（海寧威爾芬自動化設備有限公司）、可編程切割機（杭州格倫坤科技有限公司）、鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 CPV+CCV+Giardia抗原三合一膠體金檢測卡的制備

1.2.1 膠體金顆粒的制備

1 mL 1%的氯金酸加入雙蒸水定容至100 mL，煮沸后保持3 min，攪拌并快速加入2 mL 1%的檸檬酸三鈉溶液；95°C攪拌6～8 min，冷卻后定容至原體積，4°C保存。

1.2.2 膠體金標記抗體

取3 份適量的膠體金溶液，分別調(diào)至最適pH 值，加入CPV-Ab1、CPV-Ab1、Giardia-Ab1，充分攪拌1 h；加入20%的濃度為0.2% PEG-2000 穩(wěn)定劑，1 200 r/min 離心30 min，4°C保存。

1.2.3 金標墊的制備

將已被膠體金標記的CPV-Ab1、CCV-Ab1、Giardia-Ab1 分別與鼠IgG 金標抗體復合物混合，均勻涂布于聚酯纖維膜，37°C烘干，封入裝有干燥劑的鋁箔袋。

1.2.4 NC膜的制備

1.2.4.1 CCV膠體金檢測條的NC膜的制備

將鏈霉親和素和羊抗鼠IgG作為檢測線（T線）和質(zhì)控線（C 線）分別包被于NC 膜，37 °C 烘干，封入裝有干燥劑的鋁箔袋。

1.2.4.2 CPV膠體金檢測條和Giardia膠體金檢測條的NC膜的制備

將CPV-Ab2、Giardia-Ab2 和羊抗鼠IgG 作為檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）分別包被于NC膜，37 °C烘干，干燥密封保存。

1.2.5 CCV樣品墊的制備

CCV-Ab2與生物素（biotin）耦聯(lián)，按照0.006 g/L濃度加入玻纖溶液混勻，均勻涂布于玻璃纖維，37 °C 烘干，干燥密封保存。

1.2.6 CPV+CCV+Giardia 抗原三合一膠體金檢測卡的組裝

將準備的3個產(chǎn)品的樣品墊、金標墊、NC膜、吸水墊分別依次粘貼于各自潔凈的PVC，切割4.0 mm寬的試紙條，按順序裝入三合一測試板，干燥密封保存。

1.3 檢測原理、判定標準及檢測方法

1.3.1 CCV檢測原理及判定標準

采用鏈霉親和素和生物素信號放大的雙抗夾心法進行檢測。若樣本中含有犬冠狀病毒抗原（CCV-Ag），則與樣本墊中的CCV-Ab2-biotin 結(jié)合，被金標墊上的CCVAb1 捕獲，形成CCV-Ab2-biotin-CCVAg-CCV-Ab1 抗體金標復合物；在橫向?qū)游龅淖饔孟吕^續(xù)流動至NC膜，被T線處的鏈霉親和素捕獲，形成抗體-抗原-抗體固相復合物，呈現(xiàn)紅色條帶；繼續(xù)層析至質(zhì)控線C 處，溶液中的鼠IgG金標物與羊抗鼠IgG結(jié)合，呈現(xiàn)紅色條帶。

若樣本中不含有CCV-Ag，則檢測線處不呈現(xiàn)紅色條帶，僅質(zhì)檢線處呈現(xiàn)紅色條帶。

1.3.2 CPV、Giardia檢測原理及判定標準

采用雙抗夾心法進行檢測。若樣本中含有犬細小病毒抗原（CPV-Ag），則與金標墊中的犬細小病毒抗體（CPV-Ab2）結(jié)合；在橫向?qū)游龅淖饔孟拢^續(xù)流動至NC膜，被T 線處的犬細小病毒抗體（CPV-Ab1）捕獲，形成CPV-Ab2-CPV-Ag-CPV-Ab1 抗體抗原固相復合物，呈現(xiàn)紅色條帶；繼續(xù)層析至質(zhì)控線C處，溶液中的鼠IgG金標物與羊抗鼠IgG結(jié)合，呈現(xiàn)紅色條帶。

若樣本中不含有CCV-Ag，則檢測線處不呈現(xiàn)紅色條帶，僅質(zhì)檢線處呈現(xiàn)紅色條帶。Giardia檢測同理。

1.3.3 檢測方法

于地上或犬的肛門處采集適量犬嘔吐物或糞便，與緩沖液攪拌混勻取出，確保充分提取樣品。

將測試板置于干凈平整的表面，分別垂直滴加3 滴樣品（約120 μL）于測試板S 孔，5～10 min 判讀結(jié)果，15 min后結(jié)果無效。

1.4 CPV+CCV+Giardia 抗原三合一膠體金檢測卡質(zhì)量評價試驗

1.4.1 特異性試驗

采用3個批次各9個CPV、CCV和Giardia抗原膠體金檢測卡分別檢測CDV、CPV、CAV、CRV、CCV和Giardia的陽性樣本，觀察并記錄結(jié)果，評價其特異性。

1.4.2 靈敏度試驗

將CPV 高濃度陽性樣本稀釋成不同濃度：320.0、160.0、80.0、40.0、20.0、10.0、5.0 和2.5 HAU/mL；將高濃度的CCV 重組抗原稀釋成不同濃度：100.0、50.0、25.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5μg/L；將Giardia高濃度樣本稀釋為不同濃度：625 000、125 000、62 500、31 250、15 625、3 125、2 500、1 000、500 和0 cysts/mL。采用組裝好的CPV、CCV 及Giardia 抗原膠體金檢測卡分別測試，觀察并記錄結(jié)果，評價其靈敏度。

1.4.3 重復性試驗

分別制備3 批CPV+CCV+Giardia 抗原膠體金檢測卡，采用3 個批次的膠體金檢測卡分別檢測CPV、CCV 和Giardia的陰性、中陽性和高陽性樣品。每一批次每組樣本各10份，觀察并記錄結(jié)果，評價其在同批次和不同批次間的重復性。

1.4.4 穩(wěn)定性試驗

1.4.4.1 加速穩(wěn)定性試驗

制備3 批CPV、CCV 和Giardia 抗原膠體金檢測卡，分別45 °C 保存0、7、14、21、28、35、42、56、77、84 d 和55 °C下0、7、14、21、28、35、42 d 后進行試驗。每個時間點分別檢測CPV、CCV 和Giardia 陰性對照品、弱陽性對照品、中陽性對照品和強陽性對照品各3份，觀察并記錄結(jié)果。

1.4.4.2 實時穩(wěn)定性試驗

制備3 批CPV、CCV 和Giardia 抗原膠體金檢測卡，室溫條件進行0、6、12、15、18、21、24月的穩(wěn)定性試驗。

每個時間點分別檢測CPV、CCV 和Giardia 陰性對照品、弱陽性對照品、中陽性對照品和強陽性對照品各3份，觀察并記錄結(jié)果。

1.4.5 與RT-qPCR檢測結(jié)果符合率

收集經(jīng)RT-qPCR 檢測的3 批數(shù)量分別為82、179 和162 個的臨床樣本，采用CPV、CCV 及Giardia 抗原膠體金檢測卡分別進行檢測，觀察記錄結(jié)果并計算膠體金檢測與RT-qPCR檢測結(jié)果符合率。

1.4.6 與其他品牌檢測結(jié)果對比

分別采用上述制備的CPV、CCV 和Giardia 抗原膠體金檢測卡與A 公司的CPV、CCV 和Giardia 抗原膠體金檢測卡分別對CPV、CCV和Giardia陰性和樣本各7份進行檢測，觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性試驗結(jié)果（見表1）

表1 特異性試驗結(jié)果Tab.1 Results of specificity test 單位：個

由表1可知，僅CPV陽性樣本在CPV檢測線和質(zhì)檢線處出現(xiàn)紅色條帶，結(jié)果為陽性；僅CCV陽性樣本在CCV檢測線和質(zhì)檢線處出現(xiàn)紅色條帶，結(jié)果為陽性；僅Giardia 陽性樣本在Giardia抗原檢測線和質(zhì)檢線處出現(xiàn)紅色條帶，結(jié)果為陽性；其余結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明，CPV 膠體金檢測卡與CDV、CAV、CRV、CCV 和Giardia 均無交叉反應；CCV 膠體金檢測卡與CDV、CAV、CRV、CPV 和Giardia 均無交叉反應；Giardia 抗原膠體金檢測卡與CDV、CAV、CRV、CCV和CPV均無交叉反應。CPV、CCV及Giardia抗原膠體金檢測卡均特異性良好。

2.2 靈敏度試驗結(jié)果（見表2）

由表2 可知，CPV-Ag 濃度分別為320.0、160.0、80.0、40.0、20.0、10.0 HAU/mL 時，均呈陽性結(jié)果；濃度低于10.0 HAU/mL 時，呈可疑結(jié)果或陰性結(jié)果。CCV-Ag 濃度分別為100.0、50.0、25.0、10.0、5.0、2.0μg/L時，均呈陽性結(jié)果；濃度低于2.0 μg/L 時，呈可疑結(jié)果或陰性結(jié)果。Giardia-Ag 濃度分別為625 000、125 000、62 500、31 250、15 625、3 125 cysts/mL 時，均呈陽性結(jié)果；濃度低于3 125 cysts/mL時，呈陰性結(jié)果。

表2 靈敏度試驗結(jié)果Tab.2 Results of sensitivity test 單位：個

結(jié)果表明，CPV、CCV 及Giardia 抗原膠體金檢測卡靈敏度均較好，分別可檢測CPV-Ag 濃度低至10.0 HAU/mL的樣本、CCV-Ag 濃度低至2.0μg/L 的樣本和Giardia-Ag濃度低至3 125 cysts/mL的樣本。

2.3 重復性試驗結(jié)果（見表3）

由表3 可知，同批次CPV、CCV 及Giardia 抗原膠體金檢測卡分別檢測10份陰性樣本，結(jié)果均為陰性；分別檢測10 份中陽性樣本和強陽性樣本，結(jié)果均為陽性；且不同批次同組樣本的檢測結(jié)果也一致。結(jié)果表明，CPV、CCV 及Giardia抗原膠體金檢測卡的重復性均良好。

表3 重復性試驗結(jié)果Table 3 Results of reproducible experimental 單位：個

2.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.4.1 加速穩(wěn)定性試驗結(jié)果

同一批次及不同批次內(nèi)共9 個檢測板，使用CPV、CCV 和Giardia 陰性樣本分別于45 °C 條件下0、7、14、21、28、35、42、56、77、84 d 和55 °C 下0、7、14、21、28、35、42 d檢測，均顯示陰性；CPV、CCV和Giardia 弱陽性樣本、中陽性樣本和強陽性樣本檢測時均顯示陽性。結(jié)果表明，CPV、CCV及Giardia抗原膠體金檢測卡在45 °C 84 d或在55 °C 42 d 時的檢測結(jié)果均有效;根據(jù)阿倫尼烏斯公式推算該產(chǎn)品可保存2年。

2.4.2 實時穩(wěn)定性試驗結(jié)果

同一批次和不同批次內(nèi)共9個測試板使用CPV、CCV和Giardia 陰性樣本在0、6、12、15、18、21、24 月檢測，結(jié)果均顯示陰性；CPV、CCV 和Giardia 弱陽性樣本、中陽性樣本和強陽性樣本檢測結(jié)果均顯示陽性。結(jié)果表明，該產(chǎn)品在24月內(nèi)具有穩(wěn)定性。

2.5 與RT-qPCR檢測結(jié)果符合率（見表4）

由表4 可知，與RT-qPCR 檢測結(jié)果相比，膠體金檢測卡檢測CPV 的陰性符合率為100.00%，陽性符合率為95.74%，總符合率為97.56%；CCV 的陰性符合率為97.52%，陽性符合率為93.10%，總符合率為96.09%；Giardia的陰性符合率為95.87%，陽性符合率為95.12%，總符合率為95.68%。結(jié)果表明，CPV、CCV和Giardia抗原膠體金檢測卡檢測與RT-qPCR檢測結(jié)果基本一致。

表4 RT-qPCR與膠體金檢測結(jié)果比較Tab.4 Comparison of RT-qPCR and colloidal gold detection results單位：個

2.6 與其他品牌產(chǎn)品檢測對照結(jié)果（見表5）

表5 與其他品牌產(chǎn)品檢測對照結(jié)果Tab.5 Results of controled test with A company 單位：個

由表5 可知，CPV、CCV 和Giardia 各7 份陰性樣本通過二者的檢測在檢測線處均無紅色條帶出現(xiàn)，質(zhì)檢線處出現(xiàn)紅色條帶，顯示陰性；CPV、CCV和Giardia各7份陽性樣本通過二者的檢測在檢測線和質(zhì)檢線處均出現(xiàn)紅色條帶，顯示陰性。結(jié)果表明，二者產(chǎn)品均能夠有效檢測CPV、CCV及Giardia。

3 討論

各項試驗結(jié)果表明，制備的CPV+CCV+Giardia 抗原三合一膠體金檢測卡具有良好的特異性，不與CDV-Ag、CAV-Ag、CRV-Ag、CCV-Ag、Giardia-Ag 和CPV-Ag 除對應抗原外任何一種抗原發(fā)生交叉反應；靈敏度較高，分別可檢測CPV 濃度低至10.0 HAU/mL 的樣本、CCV 濃度低至2.0μg/L的樣本和Giardia濃度低至3 125 cysts/mL 的樣本；對于不同批次或同批次的不同樣本的檢測重復性良好；45 °C 84 d 內(nèi)或在55°C 42 d 內(nèi)熱穩(wěn)定性良好，室溫條件下24個月內(nèi)均穩(wěn)定，檢測效果良好；對經(jīng)RT-qPCR檢測的82 個CPV 相關(guān)樣本、179 個CCV 相關(guān)樣本以及162 個Giardia相關(guān)樣本進行膠體金檢測，結(jié)果顯示，與RT-qPCR檢測結(jié)果相比，膠體金檢測卡檢測CPV 的陰性符合率為100.00%，陽性符合率為95.74%，總符合率為97.56%；CCV的陰性符合率為97.52%，陽性符合率為93.10%，總符合率為96.09%；Giardia的陰性符合率為95.87%，陽性符合率為95.12%，總符合率為95.68%，其檢測結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

本試驗制備的CPV+CCV+Giardia 抗原三合一膠體金檢測卡具有特異性好、靈敏度高、重復性好、穩(wěn)定性高、結(jié)果準確率高的優(yōu)點，能夠快速、準確地檢測CPV、CCV 及Giardia抗原。