三重串聯四級桿液質聯用法測定人血漿中布洛芬濃度的不確定度評定

董曉茜 楊 瑞 唐 思 張世良 劉 君 夏素霞

布洛芬是一種經典的非甾體抗炎藥，是目前臨床上公認的安全有效的解熱鎮痛藥物之一。用于減輕中度疼痛，如關節痛、神經痛、肌肉痛、偏頭痛、頭痛、牙痛，也可用于減輕普通感冒或流行性感冒引起的發熱[1-3]。目前，國內外對布洛芬的各類研究報道較多，但尚未見對于人血漿中布洛芬藥物濃度測定的不確定度評定相關研究報道。現根據國家GB/T 27418-2017《測量不確定度評定與表示》中要求，建立數學模型并計算各分量不確定度和合成不確定度，對三重串聯四級桿液質聯用法測定人血漿樣品中布洛芬定量方法學的不確定度進行了評定[4-5]，以此評定測量過程中不確定度各分量的主要來源以及對測定結果可靠性的影響，進而為生物樣本中此類藥物評定測量結果質量提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥 布洛芬標準物質（中國食品藥品檢定研究院，批號100179-201406，純度98.9%）；吲哚美辛標準物質（中國食品藥品檢定研究院，批號100258-200904，純度99.9%）；甲醇、醋酸銨為色譜純，冰醋酸為分析純，空白血漿由遼寧中醫藥大學附屬第二醫院藥物臨床試驗中心提供。

1.1.2 儀器 安捷倫G6410A三重四級桿串聯質譜儀（美國安捷倫公司）；XW-80A微型旋渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；XS105分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；低溫冷凍離心機SIGMA 3-18K（德國sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 液相條件 色譜柱：Aglient Poroshell 120 SB-C18（4.6 mm×75 mm，2.7μm）；流動相：10 mmol/L醋酸銨（含0.1%冰醋酸）-甲醇（24∶76）；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μl；流速：0.6 ml/min。

1.2.2 質譜條件 電噴霧電離源；負離子模式檢測；掃描方式為選擇反應監測（MRM）；Gas Flow：9 L/min，Gas Temp: 350 ℃，Nebulizer：40psi，Capillary：4000 V；用于定量的離子分別為布洛芬 m/z 205.1 →m/z 161.0，Fragmentor 110，Collision Energy 0 V；內標吲哚美辛m/z 356.1 → m/z 312.1，Fragmentor 120，Collision Energy 1 V；掃描時間為200 ms[9]。

1.2.3 血漿樣品處理方法 用移液槍精密量取100 μl血漿樣品于1.5 ml空白離心管中，精密加入10 μl吲哚美辛內標溶液，渦旋混勻30 s，再加入300 μl甲醇，渦旋混勻2 min，低溫冷凍離心機離心14 000 r/min，離心10 min，取其上清液10 μl進樣分析[10]。

1.2.4 標準曲線和質控樣品的制備 用移液槍分別精密量取布洛芬標準溶液10 μl，濃度為1.101、5.504、11.01、22.02、88.06、110.1、275.2 μg/ml，置于6個1.5 ml空白離心管中，室溫下氮氣吹干。再分別加入100 μl空白血漿，渦旋混勻30 s，配制成濃度分別為0.110 1、0.550 4、1.101、2.202、8.806、11.01、27.52 μg/ml的布洛芬標準含藥血漿，按照1.2.3項操作，建立標準曲線。

取3個2 ml空白離心管，用移液槍分別加入不同濃度的布洛芬標準溶液10 μl，室溫下N2吹干，再加入100 μl空白血漿，配制成布洛芬血漿藥物濃度分別為2.202、55.04和220.2 μg/L的低、中、高3個濃度血漿樣品，按1.2.3項操作，作為低、中、高3個濃度的質控樣品，進行精密度考察[11-12]。

1.2.5 精密度測定中的不確定度計算方法 按1.2.4項方法建立布洛芬血藥濃度測量方法的標準血漿，同時平行配制3個濃度的質控樣品各6份，按“血漿樣品處理方法”操作后進樣，以待測物和內標物的峰面積之比對樣品濃度做回歸曲線，計算出標準曲線方程。3個濃度的質控樣品，每個濃度測定3組，共18份樣品。

1.2.6 稱量標準物質過程中引入的不確定度

實驗中所用的十萬分之一電子天平e= 0.1，非線性誤差：

天平在調零時也會存在誤差：

所以，天平的標準不確定度為：

在稱量過程中的相對標準不確定度為

1.2.7 配制對照品溶液過程中引入的不確定度 實驗過程中，所用到的容量瓶規格為10 ml、25 ml和50 ml，由檢定證書可知，對應的相對允差分別為±0.02 ml、±0.04 ml、±0.05 ml。室內溫度控制為20 ℃，因此溫度的影響可以忽略不計。按照均勻分布，根據公式由相對允差引起的相對標準不確定度為：ur(x,V1)=0.000 2，ur(x,V2)=0.001 0，ur(x,V3)=0.004 1

實驗過程中，所用到的移液管量程為0～1 ml、0～2 ml、0～5 ml、0～10 ml，由檢定證書可知，對應的相對允差分別為±0.015 ml、±0.020 ml、±0.04 ml、±0.10 ml。按三角分布，其相對標準不確定度為（由于溫度對于移液管影響較小，忽略不計）ur(x,P1)=0.006 1，ur(x,P2)=0.005 1，ur(x,P3)= 0.004 1，ur(x,P4)=0.004 1。綜上所述，過程中一共用到10 ml容量瓶11次、25 ml容量瓶1次、50 ml容量瓶1次，1 ml移液管1次（取樣1 ml）、2 ml移液管2次（1次取樣1.6 ml，1次取樣2 ml），5 ml移液管7次（1次取樣2.5 ml，1次取樣4 ml，5次5 ml），10 ml移液管1次（取樣8 ml），因此，計算其相對標準不確定度。

1.2.8 含藥血漿樣品配制過程中引入的不確定度 本實驗方法學過程中，血漿標準液配置過程中，所使用到移液器的量程分別為0.5～10 μl、10～100 μl、20～200 μl，由檢定證書可知，對應各移液器的相對允差分別為±1.0 μl、±2.0 μl、±3.5 μl。室內溫度控制為20 ℃，因此溫度的影響可以忽略不計。根據計算由移液槍引入的相對標準不確定度為：ur(x1)=0.017 3，ur(x2)=0.015 4，ur(x3)=0.004 3，代入計算含藥血漿樣品配制過程中引入的相對標準不確定度。

1.2.9 回收率實驗過程中引入的不確定度 實驗方法學過程中，配制低中高濃度質控樣品各3份和相同濃度的對照溶液樣品各3份，進行三重串聯四級桿液質聯用法測定。根據得到的數值計算此方法布洛芬的提取回收率。

1.2.10 線性擬合標準曲線過程中引入的不確定度 實驗方法學中，建立標準曲線時，配制血藥濃度為0.110 1、0.550 4、1.100 8、2.201 6、8.806 4、11.008 0、27.520 0 μg/ml的布洛芬標準血漿樣品，進樣分析后，以每個樣品峰面積與內標峰面積之比的比值，對樣品的濃度作圖，擬合一條標準曲線，共擬合3條標準曲線。7個濃度的樣品，每個濃度重復測定次數為9次。

根據方法學擬合標準曲線過程中得到的數據，帶入以下方程，計算得出殘余標準偏差為：

2 結果

2.1 相對標準不確定度各分量計算結果

由各分量的計算結果可知，精密度測定、標準曲線的擬合及含藥血漿樣本的配制對不確定度的影響較大。見表1。

表1 相對標準不確定度分量

2.2 計算合成相對標準不確定度

布洛芬濃度測定的相對標準不確定度為上述各項不確定度數值相加：

ucrL =1.338 0，ucrM =0.102 8，ucrH =0.066 5

其標準不確定度為：

uc,L =3.05，uc,M =5.90，uc,H =16.11

2.3 擴展不確定度結果表示

根據JJF 1059.1-2012測量不確定度的評定與表示，包含因子k= 2，此時對應的置信概率為95.45%，得到擴展不確定度為：

uL=6.12，uM=11.80，uH=32.22

因此，人體血漿樣品中布洛芬低中高3個濃度的質控樣品的測定結果可表示為（2.20±6.12）μg/L、（57.36±11.80）μg/L、（242.2±32.22）μg/L，（k= 2，95.45%的置信區間）。

3 討論

實施和完善不確定度評定，可以提高檢測質量，也可以作為檢測數據認可的渠道和內容。我們通過三重串聯四級桿液質聯用法建立測定人血漿中布洛芬含量的方法學研究，按照實驗過程中的順序確定各類不確定度來源，并進行分析。由結果可知，標準曲線的擬合和配制，以及血漿樣本的處理對不確定度的影響較大。所以在實際的分析測定過程中，需對此類不確定度的各分量來源嚴格把控，以便減小不利因素，從而更好地為方法學建立提供科學指導，提高測定結果的準確性與可靠性[13-14]。

在實驗過程中，首先應采取適當增加標準曲線溶液的測定次數來減小不確定度。其次，盡量減少配制過程中量具的使用次數，或用精密度更高的量具。最后，高精密度的量器、檢測人員規范的操作、儀器設備的相關管理和維護、高純度的標準物質、重復測量次數的增加等都有助于減小測量數據的不確定度，最終提高檢測結果的準確性[15-16]。