沉默長鏈非編碼RNA NR_027324對低糖缺氧損傷大鼠H9C2心肌細胞凋亡的影響

孟慶坤 譚 昊 顧 卉 駱佳瑩 王菁菁 王傳合 韓 蘇 孫志軍*

心肌梗死是一種致命性疾病，是人類致死的重要原因[1]。在心肌梗死病理生理變化過程中，心肌細胞缺血缺氧引起的心肌細胞凋亡對疾病進展及預后起重要作用。而心肌細胞的凋亡與基因表達的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[2]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類不具備編碼蛋白質(zhì)的，轉(zhuǎn)錄長度＞200 nt的非編碼RNA[3]，在心肌梗死的病理生理過程中發(fā)揮重要作用[4-8]。基于之前的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在大鼠心肌梗死邊緣區(qū)有大量差異表達，以及通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)lncRNA存在多種潛在病理機制作用[9]。為了模擬心肌缺血缺氧狀態(tài)，本研究采用低糖缺氧處理大鼠H9C2細胞，選取lncRNA芯片中差異表達顯著的NR_027324作為研究對象，驗證在低糖缺氧H9C2細胞模型中NR_027324的變化，以及與凋亡的關(guān)系。通過觀察沉默NR_027324對心肌細胞凋亡的影響，以探討NR_027324調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡的作用機制，為防治心肌梗死后心肌細胞凋亡提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠H9C2心肌細胞購自萬類生物技術(shù)有限公司。si-RNA載體由萬類生物技術(shù)有限公司合成。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine TM2000：Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Inc.，美國。DMEM培養(yǎng)基：Gibco;Thermo Fisher Scientific, Inc.，Waltham，MA，美國。胎牛血清：FBS；EverGreen，浙江天杭生物科技有限公司。TRIpure試劑（Cat. No. RP1001）：北京百泰克生物技術(shù)有限公司。Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶（Cat. No. PR6502）：北京BioTeke Corporation。SYBR GREEN mastermix（Cat. No. SY1020）：北京索萊寶科技有限公司。特異性引物：上海生工生物科技。全蛋白提取試劑盒（cat. no. WLA019）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（cat.no.WLA004）：萬類生物技術(shù)有限公司。Bax，Bcl-2，cleaved caspase-3，cleaved caspase-9抗體：萬類生物技術(shù)有限公司。辣根過氧化物酶標記的二抗：萬類生物技術(shù)有限公司。ECL化學發(fā)光試劑盒：萬類生物技術(shù)有限公司。乳酸脫氫酶測定試劑盒（cat.no. WLA072）：萬類生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)和低糖缺氧處理、si-RNA轉(zhuǎn)染和分組 采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H9C2細胞，3 d后換液，當細胞融合度達到50%時，胰酶消化后，進行傳代。si-RNA分子序列設(shè)計合成：選取NR_027324序列進行分析，依據(jù)si-RNA原則設(shè)計3條lncRNA NR_027324干擾序列，并設(shè)計一條陰性對照序列。qRT-PCR檢測si-RNA轉(zhuǎn)染效率。細胞轉(zhuǎn)染：將對數(shù)生長期H9C2細胞接種于6孔板中（每孔1×105個細胞），并在37 ℃，5%CO2下孵育24 h。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，用20 nmol/L最終劑量的小干擾RNA（si-Lnc）或小干擾RNA陰性對照（si-Lnc-NC），使用Lipofectamine 2000根據(jù)制造商的規(guī)程，瞬時轉(zhuǎn)染細胞，孵育24 h。

實驗分組：對照組（Con）：在高葡萄糖（4.5 g/L）的DMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清，溫度37 ℃和5%CO2。低糖缺氧組（oxygen and glucose deprivation,OGD）：在低葡萄糖（1.0 g/L）DMEM中培養(yǎng)，將其置于含1% O2、94%N2和5%CO2的低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。沉默NR_027324陰性對照+低糖缺氧組（si-Lnc-NC+OGD）：轉(zhuǎn)染小干擾RNA陰性對照（si-Lnc-NC）后，給予低糖缺氧培養(yǎng)6 h。沉默NR_027324+低糖缺氧組（si-Lnc+OGD）：轉(zhuǎn)染小干擾RNA（si-Lnc）后，給予低糖缺氧培養(yǎng)6 h。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）分析使用TRIpure試劑提取總RNA。使用Nanodrop 2000系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，Inc，美國）測量RNA的濃度和純度。根據(jù)制造商的規(guī)程，使用Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成互補DNA（cDNA）。根據(jù)制造商的規(guī)程，使用SYBR GREEN mastermix對cDNA樣品進行擴增。利用韓國BIONEER公司生產(chǎn)的ExicyclerTM 96熒光定量儀進行熒光定量分析。mRNA和lncRNA的PCR反應條件如下：在94 ℃下持續(xù)5 min，然后進行40個循環(huán)，分別是94 ℃下持續(xù)10 s和60 ℃下持續(xù)20 s。另外，對每個孔使用雙蒸水（ddH2O）作為非模板對照。使用β-actin用于標準化NR_027324的表達水平。相對表達通過2-△△Ct法定量，并進行了3次重復。取3次結(jié)果的中位數(shù)計算相對表達水平。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3 乳酸脫氫酶（LDH）檢測 分別轉(zhuǎn)染后，收集各組細胞上清液，采用LDH測定試劑盒，按照說明書的方案檢測LDH以確定細胞損傷，在490 nm的酶聯(lián)免疫檢測儀（ELX-800，BIOTEK，美國）測量每一孔的吸光度，每組重復3次。

1.2.4 噻唑藍比色法（MTT）檢測 按實驗分組將細胞接種于96孔板中，每孔細胞量5×103個，每組設(shè)置5個復孔，并設(shè)置一對照孔，只加培養(yǎng)基。待細胞貼壁后進行細胞轉(zhuǎn)染，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，分別按分組進行低糖缺氧處理。到達時間點后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入20 μl MTT試劑，37 ℃、5%CO2孵育4 h，棄孔內(nèi)上清液，然后每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），避光靜置10 min，在570 nm的酶聯(lián)免疫檢測儀測量每一孔的吸光度，計算5孔的平均值。計算細胞成活率。細胞成活率=OD值實驗組/OD值對照組。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測蛋白表達 收集各組細胞，使用全蛋白提取試劑盒裂解總蛋白。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測量蛋白質(zhì)的濃度和純度。每泳道40 μg的蛋白質(zhì)樣品在SDS-PAGE凝膠上分離（10%），并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。在室溫下，將膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h，然后與一抗孵育在4 ℃下過夜。然后將膜用TBST洗滌3次，與辣根過氧化物酶標記的二抗在37 ℃下孵育45 min，然后進一步用TBST洗滌6次。隨后，使用ECL化學發(fā)光試劑盒檢測印跡，并用凝膠圖象處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標條帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較行事后比較-最小顯著性差異法t檢驗（post-hoc LSD-t檢驗），雙側(cè)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 低糖缺氧H9C2細胞中NR_027324的相對表達量，LDH、細胞成活率變化

與對照組相比，低糖缺氧組NR_027324表達量明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。低糖缺氧組較對照組LDH升高（P＜0.001），成活率下降（P＜0.001）。見表2。

表2 低糖缺氧處理H9C2細胞的NR_027324表達、LDH、細胞成活率變化(±s)

表2 低糖缺氧處理H9C2細胞的NR_027324表達、LDH、細胞成活率變化(±s)

注：與對照組比較，aP＜0.001；Con，對照組；OGD，低糖缺氧組

組別 NR_027324相對表達量 LDH(U/L) 細胞成活率(%)Con 1.004±0.106 55.128±5.875 0.318±0.043 OGD 2.081±0.088a 114.744±2.938a 0.164±0.020a

2.2 沉默NR_027324后，低糖缺氧H9C2細胞中NR_027324的相對表達量，LDH、細胞成活率變化

與沉默NR_027324陰性對照+低糖缺氧組比較，沉默NR_027324+低糖缺氧組中NR_027324的相對表達量顯著下降76.78%（P＜0.001）。沉默NR_027324+低糖缺氧組中LDH與沉默NR_027324陰性對照+低糖缺氧組比較進一步升高（P＜0.001）；成活率下降（P＜0.001）。沉默NR_027324陰性對照+低糖缺氧組與低糖缺氧組（不進行轉(zhuǎn)染）比較NR_027324的相對表達量、LDH、成活率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 沉默NR_027324后低糖缺氧H9C2細胞的NR_027324表達、LDH、細胞成活率變化(±s)

表3 沉默NR_027324后低糖缺氧H9C2細胞的NR_027324表達、LDH、細胞成活率變化(±s)

注：與si-Lnc+OGD組比較，aP＜0.001；OGD，低糖缺氧組；si-Lnc-NC+OGD，沉默NR_027324陰性對照+低糖缺氧組；si-Lnc+OGD，沉默NR_027324+低糖缺氧組

組別 NR_027324相對表達量 LDH(U/L) 細胞成活率(%)OGD 2.081±0.088a 114.744±2.938a 0.164±0.020a si-Lnc-NC+OGD 1.996±0.056a 118.269±2.885a 0.179±0.019a si-Lnc+OGD 0.4images/BZ_106_903_2939_908_2939.png63±0.016 173.397±4.934 0.094±0.015

2.3 低糖缺氧H9C2細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達以及沉默NR_027324后凋亡相關(guān)蛋白表達

蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測結(jié)果顯示與對照組比較，低糖缺氧組H9C2細胞促凋亡相關(guān)蛋白Bax，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達下降。沉默NR_027324+低糖缺氧組與沉默NR_027324陰性對照+低糖缺氧組比較，H9C2細胞促凋亡相關(guān)蛋白Bax，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達下降。沉默NR_027324陰性對照+低糖缺氧組與低糖缺氧組（不進行轉(zhuǎn)染）比較，凋亡相關(guān)蛋白差異變化不明顯。見圖1。

圖1 低糖缺氧處理H9C2細胞及轉(zhuǎn)染小干擾RNA沉默NR_027324后凋亡相關(guān)蛋白表達（蛋白質(zhì)免疫印跡法）

3 討論

有研究表明，原代大鼠心肌細胞經(jīng)過低糖缺氧損傷（oxygen and glucose deprivation, OGD）干預4 h后，細胞成活率降低，LDH釋放增多[10]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果趨于一致，低糖缺氧損傷的H9C2細胞中，與對照組比較，LDH明顯升高，MTT提示細胞成活率下降。本研究中蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測結(jié)果顯示低糖缺氧大鼠H9C2細胞中促凋亡相關(guān)蛋白Bax，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達下降，提示凋亡激活。心肌細胞凋亡是心肌梗死中導致心肌細胞損傷的重要原因。多種凋亡相關(guān)基因的異常表達可促進或抑制心肌細胞凋亡，如Bax、Bcl-2和caspase-3、caspase-9等[11]。Caspase是一類與凋亡密切相關(guān)的蛋白水解酶家族，活化的cleaved caspase-9 是線粒體細胞凋亡途徑的啟動者，進而激活細胞凋亡的執(zhí)行者cleaved caspase-3蛋白，誘導細胞凋亡[12]。在之前的研究通過芯片技術(shù)分析心肌梗死邊緣區(qū)的lncRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)lncRNA在心肌梗死邊緣區(qū)有大量差異表達[9]。其中l(wèi)ncRNA NR_027324表達上調(diào)，重注釋分析提示其為H19基因的一段。有研究結(jié)果顯示H19基因?qū)π募〖毎毖鯎p傷具有保護作用[13-14]。本研究采用低糖缺氧環(huán)境中培養(yǎng)H9C2細胞的方法模擬大鼠心肌梗死邊緣區(qū)缺血缺氧狀態(tài)，研究NR_027324在其中發(fā)揮的作用。結(jié)果顯示，給予沉默NR_027324處理后，低糖缺氧損傷的H9C2細胞中Bax，cleavedcaspase3和cleaved-caspase9表達進一步增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達進一步下降。對低糖缺氧損傷的H9C2細胞進一步沉默NR_027324后，LDH進一步升高提示細胞損傷進一步加劇，MTT法檢測細胞成活率進一步下降。我們認為，NR_027324與低糖缺氧的心肌細胞凋亡明確相關(guān)，沉默NR_027324后能夠促進凋亡發(fā)生。進而推論NR_027324可能是一種保護性lncRNA，抑制低糖缺氧H9C2細胞中的凋亡過程。心肌細胞經(jīng)過6 h的低糖缺氧干預后，NR_027324表達上調(diào)，給予沉默其表達后，凋亡相關(guān)蛋白表達增加，使LDH釋放增多、細胞成活率進一步下降，反之，低糖缺氧損傷后的NR_027324表達上調(diào)可能是細胞應對缺血缺氧導致凋亡增加的一種應激性自我保護機制。內(nèi)源競爭RNA（competing endogenous RNAs, ceRNA）是lncRNA通過內(nèi)源競爭結(jié)合的方式調(diào)節(jié)miRNAs的表達，進而發(fā)揮在轉(zhuǎn)錄后翻譯水平調(diào)控靶基因表達的一種作用方式。重注釋分析提示NR_027324為H19基因的一段，通過生物信息學分析預測miR-103-3p可能為其結(jié)合靶點。而在大鼠心肌細胞中miR-103-3p能夠下調(diào)Atg5的蛋白表達[15]。我們大膽推測NR_027324可能通過ceRNA的方式調(diào)節(jié)miR-103-3p表達，繼而調(diào)節(jié)下游靶點ATG5的表達，來調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡。上述推論尚需進一步研究證實。

綜上所述，NR_027324能夠調(diào)節(jié)低糖缺氧的大鼠心肌細胞凋亡過程。在低糖缺氧的大鼠心肌細胞中，lncRNA NR_027324可能是減少心肌細胞凋亡的一個可能的治療靶點。不可忽視的是，隨著心肌梗死的時間演變，凋亡也存在動態(tài)變化，lncRNA在其中發(fā)揮的作用可能也有著動態(tài)的變化，需要進一步研究證實。