1株奶牛源約翰遜不動桿菌的分離鑒定

田秋豐，張 紅，尹珺伊，史同瑞，張 軍，劉秋瑾，王 巖，秦平偉，王 歡，白長勝，陳楠楠，朱慶賀，苗 艷

(黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，齊齊哈爾 161005)

不動桿菌屬(Acinetobacterspp.)最早是由荷蘭微生物學家Beijerinck于1911年從土壤中分離出來，不動桿菌典型特征是無芽胞、無鞭毛、無動力，生存能力強，廣泛分布于土壤、水塘等自然界中[1-3]，并且具有廣泛的耐藥性[4]。約翰遜不動桿菌引起畜禽動物感染發病的報道極少，僅有少量報道從白額雁臟器[5]、肉牛鼻腔拭子[6]、草魚腸道[7]等分離到約翰遜不動桿菌。本研究從奶牛墊料中分離到1株約翰遜不動桿菌，并進行了生物學特性的研究，研究結果可為奶牛源約翰遜不動桿菌病的防治提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 從齊齊哈爾市某奶牛場，隨機無菌采集奶牛墊料，低溫運輸至實驗室。

1.1.2 主要試劑及培養基 革蘭染色試劑盒購自比克曼生物科技有限公司；基因組DNA抽提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；細菌微量生化反應管和藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。營養瓊脂、肉湯培養基、鮮血瓊脂培養基購自青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 實驗動物 選用健康的9周齡、體重約25 g的雌性 BALB/c 小鼠10只，購自齊齊哈爾醫學院實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 分離菌純化及革蘭染色 在超凈臺內將采集的墊料用無菌生理鹽水稀釋，混勻后吸取稀釋液100 μL涂布于高壓滅菌后的營養瓊脂平板、血平板，37 ℃恒溫需氧培養24 h，挑取平板上的典型單菌落進行純化培養。將3次劃線傳代純培養后的分離菌命名為HLJBDJ-1，挑取純化后的菌落進行革蘭染色，在1 000倍光鏡下觀察細菌形態。

1.2.2 生化試驗 按照《伯杰細菌鑒定手冊》進行鑒定，對純培養分離菌株在超凈臺內無菌接種到微量生化管進行精氨酸雙水解酶、精氨酸脫羧、葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖醇、半乳糖、麥芽糖、果糖、甘露醇、葡萄糖磷酸鹽、硫化氫、動力試驗、尿素等生化試驗，觀察并記錄結果。

1.2.3 16S rDNA序列測定及同源性分析 不動桿菌的鑒定采用PCR方法進行判定，選用細菌16S rDNA通用引物擴增，引物序列為 27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R: 5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′。25 μL PCR反應體系:DNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL(引物濃度為10 μmol·L-1)，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，加超純水至25 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃延伸20 min， 4 ℃保存。反應結束后，取7 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，對陽性PCR產物進行測序分析。將測序結果與NCBI數據庫中參考菌株進行Blast同源比對分析，并利用MEGA6.0軟件中鄰接法(Neighbor-joining)構建系統進化樹。

1.2.4 動物致病性試驗 將純化后分離菌接種于營養肉湯培養基中，37 ℃ 培養12～24 h，將分離菌用生理鹽水調整濃度至6.9×108CFU·mL-1。將10只健康BALB/c 小鼠，隨機分為試驗組、對照組，每組5只，試驗組每只腹腔注射0.2 mL菌液，對照組腹腔注射等體積無菌生理鹽水。接種后分開飼養，觀察記錄小鼠死亡及發病情況。無菌剖檢死亡小鼠，觀察組織器官病變情況，無菌采取心、肝等組織，按照“1.2.1”方法分離細菌。

1.2.5 藥敏試驗 本分離菌藥敏試驗采用K-B紙片瓊脂擴散法。取100 μL新鮮菌液均勻涂布在營養瓊脂平板上，待菌液稍干后無菌操作貼上藥敏片，置37 ℃溫箱培養18～24 h，使用游標卡尺測量抑菌圈直徑(mm)，記錄菌株的敏感程度，參照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI 2019)抗菌藥物敏感性標準，判斷分離菌對不同抗生素的敏感性。

2 結 果

2.1 細菌的培養特征及鏡檢

該分離菌在營養瓊脂平板上需氧培養生長良好，培養12 h菌落呈露珠狀，菌落表面光滑、灰白色、半透明，直徑1～2 mm(圖1A);在血瓊脂平板上可見圓潤、半透明、不溶血的白色菌落(圖1B)。挑取已純化菌落進行革蘭染色，鏡下可見分離菌為陰性，可見菌體多為短桿狀，常雙排列，偶見單個零散排列(圖1C)。

2.2 生化鑒定

該分離菌對精氨酸雙水解酶和精氨酸脫羧酶呈陽性，對葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖醇、半乳糖、麥芽糖、果糖、甘露醇、葡萄糖磷酸鹽、硫化氫、硝酸鹽還原反應、動力試驗、尿素、枸櫞酸鹽、丙二酸鹽呈陰性。參照《伯杰氏系統細菌學手冊》，分離菌HLJBDJ-1與不動桿菌屬標準生化試驗結果基本一致。

A.營養瓊脂培養基；B.綿羊血瓊脂培養基；C.革蘭染色鏡檢(1 000×)A. Nutrient agar medium; B.Sheep blood agar medium; C. Gram staining morphology(1 000×)圖1 分離菌培養特性及形態觀察Fig.1 Culture characteristics and morphological observation of isolated bacteria

2.3 PCR檢測與測序分析

分離菌16S rDNA基因PCR擴增后條帶大小約1 300 bp(圖2)。測序結果顯示，分離菌16S rDNA核苷酸序列長為1 283 bp，將其進行Blast對比分析，結果顯示，該分離菌與不動桿菌屬同一分支，與GenBank收錄的約翰遜不動桿菌KJ806475(福建株)相似性最近，相似性為99.45%，與溶血不動桿菌、瓊氏不動桿菌等親緣性較遠(圖3)。

M. DNA相對分子質量標準；1～2. 分離菌株 16S rDNA PCR擴增產物；3～4. 陰性對照N. DL2000 DNA marker；1-2.16S rDNA PCR amplication products of isolated strain；3-4. Negative control圖2 分離菌株16 S rDNA的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of 16S rDNA of isolated strains

2.4 動物致病性試驗

接種后3 h內，試驗組全部開始表現出精神萎頓、腹式呼吸、畏寒抱團，瀕死小鼠張口呼吸等癥狀，8 h內死亡4只小鼠，死亡率為80%(4/5)，剩余1只 小鼠于48 h后恢復正常狀態。對照組小鼠無死亡，一切正常。剖檢死亡小鼠可見腸壁變薄積氣積液，肝充血腫大，呈暗紅色。從死亡小鼠的肝和腸道進行細菌分離，經鑒定均分離出HLJBDJ-1，證明HLJBDJ-1對小鼠具有較強的致病性。

2.5 藥敏試驗

HLJBDJ-1對鏈霉素、復方新諾明、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素敏感，對頭孢噻肟、頭孢呋辛中度敏感，對青霉素、克林霉素、紅霉素、氨芐西林耐藥，具體見表1。

3 討 論

目前，對不動桿菌屬的研究多數被集中在鮑曼不動桿菌上，很少人研究屬內其他菌種[8]。像鮑曼不動桿菌一樣，約翰遜不動桿菌廣泛分布于醫院內和自然環境中[9-10]，在醫院器具、患者痰和血液標本、土壤、海洋等均可分離到[11-13]。約翰遜不動桿菌具有較強的外界抵抗力，在一些殺菌劑或者高磷高鹽環境下依然能夠生存[14]。此外還具有光修復機制，在3 931 J·m-2的紫外線強度照射下，依然可以存活36 h，一段時間內能夠修復受損的DNA[15]。

本研究發現，分離菌除精氨酸雙水解酶、精氨酸脫羧酶試驗為陽性外，糖發酵、硝酸鹽還原動力試驗均為陰性，基本符合不動桿菌“三陰”的生化特性，說明對糖類成分分解利用能力極低。但與奉鑒金等研究并不完全一致，表明細菌生化試驗僅作為未知細菌鑒定的初步判定方法，再結合核酸擴增或基因測序等分子生物學檢測方法，可以進一步分型。不動桿菌具有廣泛的耐藥性，耐藥性與其復雜的耐藥機制有關。本研究中，分離菌對鏈霉素等6種藥物敏感，對青霉素、氨芐西林等耐藥，與奉鑒金等報道的主要對磺胺類和四環素類抗生素耐藥的結果不一致，可能是不同動物來源的細菌地域差異性所導致。

4 結 論

從奶牛墊料中分離到1株約翰遜不動桿菌，該菌對鏈霉素等6種藥物高度敏感，用6.9×108CFU·mL-1劑量的分離菌攻毒健康BALB/c小鼠，小鼠死亡率達80%，提示該分離菌株具有較強的毒力。

圖3 分離菌株16 S rDNA的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of isolated strains based on 16S rDNA

表1 藥敏試驗結果