初探lncRNA-Tubb4b的蛋白編碼能力及其對微管基因的調控

馮美瑩, 衛恒習, 李 莉, 張守全*

(1. 肇慶學院生命科學學院，肇慶 526061； 2. 華南農業大學動物科學學院 國家生豬種業工程技術研究中心 廣東省農業動物基因組學與分子育種重點實驗室，廣州 510642)

在人類基因組的30億個堿基對中，僅有1.9%的核酸序列用于蛋白質編碼，其余均為非編碼的RNA(noncoding RNA，ncRNA)[1-3]。ncRNA在生物體內廣泛存在，是一類由基因組轉錄產生但不編碼蛋白質的 RNA 分子，并以 RNA 結構形式發揮其生物學功能，按照長度分為長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)和小片段編碼RNA(包括miRNA和siRNA等)。lncRNA是近年來研究比較多的ncRNA之一，其轉錄本長度在200 bp～200 kb之間[4]，缺失或僅含有很短的開放閱讀框(open reading frame，ORF)[5-7]，不具備編碼蛋白質的功能。lncRNA曾一度被認為是轉錄中的“噪音”，不具有生物學功能[8-9]。近年來的研究表明，lncRNA以RNA的形式發揮結構作用，在表觀遺傳、轉錄和轉錄后調控等層面上調控基因的表達水平[2, 5, 10-13]。然而，最新的研究發現lncRNA可以編碼產生小分子多肽，具備編碼能力[6, 14]。Anderson等[15]證實，骨骼肌特異表達的lncRNA編碼一個包含46個氨基酸的微肽(myoregulin)，生成具有生物功能的小蛋白。然而，并不是所有的lncRNAs都會編碼小蛋白，本研究關注的lncRNA-Tubb4b是否具備編碼能力仍需進一步的研究。

長鏈非編碼RNA和微管在哺乳動物早期胚胎發育和精子發生過程中起重要的作用[16-19]，前期研究發現lncRNA-Tubb4b與Tubb4b存在靶標關系，可能會影響小鼠雌雄原核遷移過程[18]。本研究將lncRNA-Tubb4b克隆到真核表達載體pcDNA3.1中，在N端添加起始密碼子ATG，C端添加3種編碼模式的“T”堿基和Flag標簽，轉染小鼠精原細胞后利用Western blot技術研究lncRNA-Tubb4b是否具備蛋白編碼能力。隨后，構建lncRNA-Tubb4b過表達載體并合成lncRNA-Tubb4b的siRNA，通過脂質體轉染和實時熒光定量PCR等技術初步探討lncRNA-Tubb4b對微管基因Tubb4b的調節作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的陽性對照組細胞為課題組前期制備[20]，而本試驗所用的試劑來源如下：細胞總RNA提取試劑盒(DP430)(離心柱型)和Pro-light HRP化學發光檢測試劑(PA112-01)購于Tiangen公司，D2110-03 HiPure Gel Pure DNA Micro Kit(凝膠DNA微量回收試劑盒)購于Magen公司，Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase(P505)高保真DNA聚合酶、AceQ Universal SYBR?qPCR Master Mix(Q511)和E.coli-DH5a感受態購于南京諾唯贊公司，T4 DNA Ligase(D2011A)載體連接試劑盒、內切酶EcoR I和BamH I等購于TaKaRa公司，全蛋白提取試劑盒和BCA蛋白含量檢測試劑盒購于凱基生物有限公司，細胞刮、羊抗鼠二抗和脫脂奶粉購于佳研生物公司，β-actin(鼠源)一抗和FLAG單克隆抗體(鼠源)購于Millipore公司，細胞培養所用的試劑均購于GIBCO公司，分子克隆所用的其他試劑購于廣州鼎國生物技術有限公司，引物合成和載體測序由廣州艾基生物公司完成，其中引物序列如表1所示。

試驗中所用的溶液主要成分如下：細胞完全培養液中含有DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)、體積分數為10%的胎牛血清(FBS，Fetal Bovine Serum)和4 mmol· L-1L-谷氨酰胺；LB液體培養基中含有1 g酵母提取物、2 g蛋白胨、20 g NaCl和200 mL純凈水(LA液體培養基是在LB培養基上添加20 mg氨芐青霉素，LA固體培養基是在LA液體培養基配方上添加1.5 g瓊脂粉)；電泳緩沖液中含有3.03 g Tris、18.77 g甘氨酸、1 g SDS和1 000 mL蒸餾水；轉移緩沖液中含有5.8 g Tris、2.9 g 甘氨酸、0.37 g SDS、200 mL的甲醇和800 mL的蒸餾水。

1.2 試驗方法

1.2.1 小鼠精原細胞cDNA的合成 首先，提前將4×105個·mL-1的細胞接種到6孔板中，細胞密度達到90%時按照細胞總RNA提取試劑盒的操作指南獲得小鼠精原細胞RNA；然后，在200 μL的RNase-free離心管中添加5.0 μL的5×gDNA Eraser Buffer、2.5 μL的gDNA Eraser、2.5 μg的小鼠精原細胞RNA和適量的RNase free dH2O(補至總體系25.0 μL)，42 ℃反應2 min后去除基因組DNA；最后，在上述離心管中添加10.0 μL的5×PrimeScriptBuffer2(for Real Time)、10.0 μL的RT Primer Mix、2.5 μL的PrimeScript RT Enzyme Mix I和2.5 μL的RNase Free dH2O，輕柔混勻后在PCR儀中50 ℃反應15 min、85 ℃反應5 s后置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 pcDNA3.1(-)-lncRNA-Tubb4b載體的構建 首先，使用Primer 5.0軟件設計lncRNA-Tubb4b特異性擴增引物，并在下游引物分別添加0/1/2個堿基 “T”后連接flag序列的5′端，以小鼠精原細胞cDNA為模板擴增lncRNA-Tubb4b序列(引物見表1)，按照95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s和72 ℃ 7 min的步驟進行反應，中間3步循環37次后再進行最后一步(以pcw-cas9質粒為模板，用同樣的方法擴增3×flag序列)；然后，按照凝膠DNA微量回收試劑盒的操作回收以上片段，并分別以lncRNA-Tubb4b(3組，分別包含0/1/2個堿基“T”)和Flag DNA片段共同作為模板，lncRNA-Tubb4b 上游和3×Flag下游為引物，重疊lncRNA-Tubb4b和Flag序列，并回收相關片段；接著，分別使用EcoR I和BamH I同時對pcDNA 3.1(-)和lncRNA-Tubb4b-/T/TT-Flag片段進行酶切后，回收后分別使用T4連接酶在16 ℃下進行過夜連接，體系(10 μL)如下：1 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、75～150 ng DNA片段、25～50 ng 載體DNA、1 μL T4 DNA Ligase和若干ddH2O(補至10 μL)。

隨后，將連接的載體進行分子克隆，通過轉化、涂板和單菌落挑選等步驟獲得單克隆菌落，并將其接種于含300 μL LA培養液的2 mL離心管中，在37 ℃搖床(220 r·min-1)中擴大培養3～4 h；接下來，以1 μL的菌液為模板對單克隆菌落進行PCR鑒定，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測挑選正確的菌落進行測序；最后，利用Blast進行序列比對分析，并將測序正確的重組載體分別進行擴大培養，按照無內毒素質粒DNA小量提取試劑盒的操作提取質粒后同時使用EcoR I和BamH I對3組重組質粒進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳驗證載體構建結果。

1.2.3 重組載體的脂質體轉染 首先，提前1 d將小鼠精原細胞按2.5×105個·mL-1的密度接種到6孔板中，細胞密度達到70%～80%時進行轉染；然后，按照lipo 3000 的操作分別取8個復孔(兩組，分別用于RNA和蛋白抽提)轉入4.5 μg的pcDNA3.1-EGFP、pcDNA3.1-lncRNA-Tubb4b-Flag、pcDNA 3.1-lncRNA-Tubb4b -T-Flag和pcDNA 3.1-lncRNA-Tubb4b-TT-Flag質粒至小鼠精原細胞中，并置于含5% CO2的37 ℃細胞培養箱中培養；最后，在轉染5～6 h后更換2 mL新鮮的完全培養液繼續培養，轉染48 h后收集細胞進行定量檢測和蛋白檢測試驗，試驗重復3次。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 首先，抽提上述脂質體轉染后的小鼠精原細胞的RNA，分別合成40 μL的cDNA作為實時熒光定量PCR的模板；然后，以Gapdh基因為內參引物、lncRNA-Tubb4b定量為檢測引物(引物序列見表1)，按照95 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 10 s、72 ℃ 30 s和72 ℃ 7 min的步驟進行反應，其中95 ℃ 10 s至72 ℃ 30 s這個反應過程需要循環40次；最后，采用△△Ct法比較各細胞中lncRNA-Tubb4b的轉染情況(△△Ct=△Ct(試驗組)-△Ct(對照組)，相對表達量=2-△△Ct)。

1.2.5 Western blot蛋白檢測方法 首先，將上述脂質體轉染后的小鼠精原細胞用冷PBS洗兩遍后，按照全蛋白提取試劑盒的操作提取各個樣品的蛋白液；然后，利用BCA蛋白含量檢測試劑盒測定各蛋白樣品在562 nm下的吸光值，并計算出相應的蛋白含量(μg)和樣品的實際濃度(μg·μL-1)；接著，用SDS上樣緩沖液將每組蛋白的濃度用PBS調到1 μg·μL-1后，置于沸水中煮5～10 min使蛋白變性；接下來，分別配制10%的分離膠和4%的濃縮膠，待濃縮膠凝固后，每孔分別加入20 μg處理過的蛋白液，并按照濃縮膠70 V恒壓40 min、分離膠90 V恒壓2 h進行電泳；電泳完成后，將膠置于濾紙和PVDF膜間在80 V恒壓下低溫轉膜1 h來進行蛋白印跡，并在封閉液中室溫封閉1 h；隨后，將鼠源的FLAG抗體(1∶1 000)用TBST稀釋后，4 ℃過夜孵育；隔天，將雜交膜用TBST洗兩次后，添加抗鼠的IgG(1∶10 000)后室溫避光孵育1 h，并用TBST洗兩次；最后，根據Pro-light HRP化學發光檢測試劑說明書上的操作進行化學發光反應，凝膠成像系統進行成像顯影。

1.2.6 lncRNA-Tubb4b過表達和siRNA干擾試驗 提前將小鼠精原細胞接種到六孔板中，置于37 ℃飽和度為5% CO2的細胞培養箱中培養；待細胞密度達到70%～80%時，按照上述“脂質體轉染”的方法將pcDNA 3.1(-)-EGFP和pcDNA 3.1(-)-lncRNA-Tubb4b過表達載體或每孔50 nmol·L-1的lncRNA-Tubb4b siRNA(GCAGGTGTGCTTCACCAAA)和對照siRNA分別轉染小鼠精原細胞。48 h 后收集細胞，按照“小鼠精原細胞cDNA的合成”的方法進行反轉錄，獲得模板cDNA。隨后，運用實時熒光定量PCR技術檢測lncRNA-Tubb4b和Tubb4b基因的表達(引物序列見表1)。

1.2.7 統計分析 所有試驗均重復3 次以上，統計數據用“平均值±標準誤(S.E.)”表示，應用SPSS 17.0 對試驗數據進行單因素方差分析，當P>0.05時，差異不顯著；當0.01

2 結 果

2.1 lncRNA-Tubb4b的編碼能力預測與驗證載體構建

通過ORF Finder軟件預測lncRNA潛在的ORF發現，lncRNA-Tubb4b有5個ORF(圖1A)，可能編碼微肽。為了研究lncRNA-Tubb4b是否具備蛋白編碼能力，在其前面添加ATG序列，后面加入Flag標簽；并以添加0、1和2個“T”尾的方式，把lncRNA-Tubb4b潛在的編碼情況都羅列出來(圖1B)。通過PCR克隆把723 bp的lncRNA-Tubb4b片段和90 bp左右的Flag片段分別擴增后拼接成3段810 bp左右的lncRNA-Tubb4b-Flag片段(圖1C和1D)。隨后，將獲得的片段連接到pcDNA3.1(-)載體中，并通過EcoR I和BamH I雙酶切(圖1E)和測序驗證載體構建成功。

2.2 lncRNA-Tubb4b的蛋白編碼能力鑒定

將驗證后的pcDNA3.1(-)-lncRNA-Tubb4b-0/T/TT-Flag載體和pcDNA3.1(-)載體分別轉染小鼠精原細胞，通過實時熒光定量PCR檢測發現,轉染pcDNA3.1(-)-lncRNA-Tubb4b-0/T/TT-Flag的小鼠精原細胞中高表達lncRNA-Tubb4b片段(圖2A)。接著，以穩定表達Flag-Cas9的小鼠精原細胞蛋白為陽性對照，通過Western blot檢測發現3種潛在編碼情況的lncRNA-Tubb4b-Flag均不表達FLAG蛋白(圖2B)，而作為內參的β-actin 蛋白在各個細胞中表達水平是相當的(圖2C)。由此可見，lncRNA-Tubb4b不具備蛋白編碼的能力。

2.3 過表達lncRNA-Tubb4b對Tubb4b的影響

以轉染pcDNA 3.1(-)-EGFP載體(NC)為對照，在小鼠精原細胞中過表達lncRNA-Tubb4b后發現，對照組的小鼠精原細胞表達熒光蛋白(圖3A、B和C)，表明載體成功轉入到目標細胞中，瞬時轉染結果有效。通過熒光定量PCR檢測發現，相對于對照組，試驗組成功過表達lncRNA-Tubb4b(圖3D)。而且，過表達lncRNA-Tubb4b后極顯著(P<0.01) 降低小鼠精原細胞中Tubb4b基因的表達(圖3D)。由此可見，lncRNA-Tubb4b對Tubb4b基因存在調控作用。

2.4 干擾lncRNA-Tubb4b對Tubb4b的影響

為了進一步研究lncRNA-Tubb4b對Tubb4b的影響，以轉染Mock(NC)為對照，在小鼠精原細胞中轉染干擾RNA(lncRNA-Tubb4b siRNA)來降低lncRNA-Tubb4b的表達后發現(P<0.05，圖4A)，會極顯著地增高Tubb4b基因的表達(P<0.01，圖4B)，這也暗示lncRNA-Tubb4b對Tubb4b基因存在調控作用。

3 討 論

人類基因組約98%的轉錄本為缺乏蛋白質編碼功能的ncRNA，lncRNA屬于ncRNA，主要參與機體重要生命活動(干細胞維持、細胞增殖和分化等)的調控[1-3, 21-23]。自1990年Brannan等[24]在研究小鼠肝發育過程中發現不編碼蛋白質H19的印跡基因后，開始了對lncRNA的研究。在之后的研究中，大多數的學者都是偏向于研究不具備編碼蛋白的lncRNA，發現其以RNA結構形式發揮生物學功能。然而，近年來的研究指出，部分與mRNA結構相似存在ORF的lncRNA能夠編碼小于100個氨基酸的功能性多肽，并以微蛋白的形式在動物機體中發揮功能[6, 25-28]。

Anderson等[15]在研究人類和斑馬魚lncRNAs時利用核糖體作圖(ribosome profiling)鑒別出數百個ORF，發現其可能生成功能性的小蛋白肽。Cai等[29]通過軟件預測lncRNA-Six1存在7個低編碼潛能和低保守性的ORF，其中ORF-2會產生7.26 ku的微肽來激活Six1基因，從而促進細胞增殖和肌肉生長。本研究通過ORF Finder軟件預測到lncRNA-Tubb4b潛在5個ORF(圖1 A)，并采用與Wang 等[30]檢測lnc-DC編碼能力一樣的方法，將lnc-RNA-Tubb4b 三種潛在的編碼情況設計出來：在lncRNA-Tubb4b 的N-末端起始密碼子ATG，C-末端分別添加0、1和2個堿基“T”后與Flag標簽融合，并克隆到pcDNA3.1真核表達載體中，轉染細胞來檢測蛋白表達。要是lncRNA-Tubb4b存在蛋白編碼能力，在這3種情況下肯定有一種存在FLAG蛋白表達；要是lncRNA-Tubb4b不編碼蛋白，那這3種情況下均檢測不到FLAG蛋白的表達。

在lncRNA蛋白編碼能力的研究中，Lauressergues等[31]在研究前體轉錄物初級微小RNAs(pri-miRs)時發現，pri-miRNA包含編碼調節肽的短開放閱讀框序列。紫花苜蓿的pri-miR171b和擬南芥的pri-miR165a可以編碼分別產生miPEP171b和miPEP165a的微肽，在影響miR171b和miR165a的積累而導致側根發育減少和主根生長刺激，最終調節根的發育[31]。本研究將潛在編碼的pcDNA 3.1(-)-lncRNA-Tubb4b質粒分別轉染小鼠精原細胞后發現，這3種情況下的lnc-RNA-Tubb4b 均沒有FLAG蛋白的表達，表明lnc-RNA-Tubb4b 不具有編碼蛋白的能力，不是以微肽的形式發揮作用的。由此可見，小鼠精原細胞中不存在lncRNA-Tubb4b預測的5個ORF，不編碼相應的微肽，說明lncRNA-Tubb4b主要以非編碼的形式發揮作用的。

不編碼蛋白的lncRNA可以在表觀遺傳、轉錄及轉錄后水平上調控基因表達[2-3, 5, 10, 32-33]，主要參與X 染色體沉默[34]、基因組印記[35]以及染色質修飾[5, 36]、轉錄激活等多種重要的調控過程[37-39]，并與人類疾病的發生、發展和防治等都有著密切聯系[3, 5, 14, 40]。微管蛋白在早期胚胎和精子發生過程中起到重要的作用[16, 18-19]，前期研究也發現lncRNA-Tubb4b在小鼠早期胚胎和小鼠精原細胞中表達[18]。本研究發現lncRNA-Tubb4b可以調控Tubb4b的表達，降低lncRNA-Tubb4b時會升高Tubb4b的表達，升高lncRNA-Tubb4b時會降低Tubb4b的表達。可見，在小鼠精原細胞過表達和干擾lncRNA-Tubb4b的表達后對Tubb4b存在顯著的負調控作用(圖3和圖4)，拓寬了lncRNA-Tubb4b的作用范圍，為研究lncRNA-Tubb4b對微管的調控乃至胚胎發育和精子發生過程奠定基礎。

4 結 論

在lncRNA-Tubb4b序列上添加起始密碼子ATG、0/1/2個的T尾和Flag標記的情況下均沒有檢測出FLAG蛋白，表明lncRNA-Tubb4b不具備蛋白質編碼能力；而且，在小鼠精原細胞中過表達或干擾lncRNA-Tubb4b的表達時會極顯著地降低或升高Tubb4b基因的表達，表明lncRNA-Tubb4b能影響Tubb4b基因的轉錄。