蒙古斑點馬黑、白毛色區域皮膚中相關基因的表達研究

白東義，拉?，?，趙若陽，陶娜拉，韓海格，丁文淇，賈紫潔，劉慧瑩，王文興，黃博光，芒 來*

(1. 內蒙古農業大學動物科學學院 內蒙古自治區馬屬動物遺傳育種與繁殖重點實驗室 農業農村部馬屬動物遺傳育種與繁殖科學觀測實驗站 內蒙古農業大學馬屬動物研究中心，呼和浩特 010018； 2. 內蒙古中蘊馬產業集團，錫林浩特 026000； 3.錫林郭勒盟鑲黃旗農牧和科技局，鑲黃旗 013250)

內蒙古自治區地域遼闊，草原面積廣，被世人譽為馬的故鄉，具有深厚的馬文化歷史淵源和文化底蘊。目前有蒙古馬、阿巴嘎黑馬、錫尼河馬、鄂倫春馬、三河馬、錫林郭勒和科爾沁馬等品種。其中蒙古馬有烏珠穆沁馬、烏審馬、百岔鐵蹄馬和巴爾虎馬等優良類群[1-2]。蒙古馬起源于西伯利亞東部草原，是世界上最古老的馬品種之一。蒙古馬經過漫長的自然和人工選擇，形成了抗病力強、易增膘、掉膘慢、耐寒冷、耐粗飼、合群性好等特征。其體質粗糙結實、體軀粗壯、體格較小、胸廓寬深、鬐甲明顯、肌肉豐滿、四肢較短而質堅實有力、被毛濃密、毛色復雜，常見的毛色有栗、騮、黑、青等，還有較特殊的海騮、鼠灰、兔褐、沙毛、花毛、斑點毛等。其中，斑點毛色的表型豐富多樣，有均勻分布在全身的斑點，也有位于背部的毯狀斑點，而且斑點的大小、形狀各不相同[3-4]。本研究以蒙古斑點馬為試驗對象，基于以往對馬屬動物毛色的研究基礎，將毛色表型與轉錄組表達譜進行了關聯分析，填補了蒙古馬毛色研究領域的新內容。對多個與毛色相關的候選基因進行分子生物學、轉錄組學和組織學鑒定，為今后蒙古斑點馬選育環節中對毛色的選擇提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣本 從內蒙古自治區包頭市達茂旗購置3匹具有典型斑點表型的雌性成年蒙古馬(圖1)，分別采集蒙古斑點馬軀體部位黑、白斑點區域皮膚組織樣品，通過觀察發現，在黑毛色皮膚區域和白毛色皮膚區域有一個漸變色的過程，因此，在采樣時采集黑色區域的中心區，即圖1中的綠色方框位置。在采集樣本時首先注射地拖嘧啶和布托啡諾對馬匹進行麻醉，然后用手術刀割取黑、白色目標區域各1 cm ×1 cm皮膚，然后對馬匹皮膚取樣處進行沖洗、消毒和縫合。將采集獲得的樣本首先分割成2塊， 1塊 立即投入液氮存儲后轉移至實驗室-80 ℃冰箱儲存。另1塊用 4% 的多聚甲醛固定24 h，然后乙醇梯度脫水至 100%無水乙醇溶液中，在4 ℃冰箱保存。

圖1 蒙古斑點馬斑點表型Fig.1 Spot phenotype of Mongolia spotted horse

1.1.2 試驗儀器與設備 輪式切片機、撈片機、烤片機(Leica，德國)，通風櫥、超純水系統(PALL，美國)，精密天枰、熒光倒置顯微鏡(ZEISS，德國)、顯微成像系統(IX73，奧林巴斯，日本)，真空泵、微波爐、移液器、多功能臺式冷凍離心機(Eppendorf，德國)，多功能酶標儀(BIO-TEK，美國)，多用電泳儀(BIO-TEK)，全能型成像系統(Bio-Rad，美國)，移動紫外燈、CFX96 Touch熒光定量PCR儀(Bio-Rad)、C1000 Touch梯度PCR儀(Bio-Rad)、凝膠成像儀(Bio-Rad)、高壓滅菌鍋(TOMY)、臺式高速冷凍離心機(EPPENDORF)、切片盒、濕盒、暗盒、染色缸、甘油、一次性吸管、透明指甲油、搖床、數據中心服務器等。

1.1.3 主要試劑與耗材 TRIzol(Invitrogen，美國)、Rnase-free ddH2O(天根，北京)、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Applied Biosystems，美國)、SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ (TaKaRa，日本)、氯仿(國藥)、核酸染料(北京天根，中國)、異丙醇(國藥)、無水乙醇(國藥)、96孔板光學貼膜(ABI)、PCR 用96孔板(axygen)、多聚甲醛(sigma，美國)、高效切片石蠟(56～58 ℃，58～60 ℃， Leica，德國)、蘇木素(GHS116-500ML，Sigma，美國)、伊紅(HT110116-500ML，Sigma，美國)、碳酸鋰(V900124-500G， Sigma，美國)、濃鹽酸(中國)、二甲苯(天津科茂，中國)、無水乙醇(天津科茂，中國)、95%乙醇(利爾康，中國)、75%乙醇(山東安捷高科，中國)、丙三醇(天津北宏，中國)、顯微鏡蓋玻片(世泰，中國)、黏附載玻片(世泰，中國)、顯微鏡載玻片(美韋德，中國)、一次性切片刀片(Leica，德國)、組織包埋盒(世泰，中國)、PBS緩沖液、羊血清、DAPI，一抗：Anti-TYR antibody(Abcam)、Anti-TYRP1 antibody(Abcam)、 Anti-DCT antibody(Abcam)、Anti-CD34 antibody(Abcam)、Anti-MiTF antibody(Abcam)、Anti-hair cortex Cytokeratin/K40 antibody [AE13] (Abcam)；二抗： goat anti rabbit IgG(Jackson,美國)、goat anti mouse IgG(Jackson,美國)等。

1.1.4 主要使用的軟件與網站 MobaXterm_Personal_10.9、Cutadapt1.10、FastQC 0.10.1、Tophat & HISAT 2.0、StringTie 1.3、RStudio、R x64 3.5.3、DESeq2、Cuffmege、Cuffdiff、Cufflinks、FileZilla、TBtools、Notepad++、NCBI(National Center for Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、DAVID(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)、GO(Gene Ontology，http://www.geneontology.org)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/kegg/)

1.2 試驗方法

1.2.1 石蠟切片及HE染色 為觀察蒙古斑點馬黑毛色區域和白毛色區域皮膚的表型信息，對黑、白毛色區域皮膚進行了石蠟包埋和組織切片制作，具體步驟如下：將梯度脫水后的皮膚組織使用二甲苯和石蠟進行透明、過渡、包埋，蠟塊經過修整和冷卻后，使用切片機縱切皮膚毛囊組織得到厚度7 μm的切片，經撈片和烘片得到黑毛色區域和白毛色區域皮膚組織切片。使用二甲苯對切片脫蠟，經過梯度水化后，使用蘇木素和伊紅進行染色，最后經過脫水和二甲苯清洗，使用中性樹膠封片，晾干后在顯微鏡下觀察HE染色結果。

1.2.2 RNA-seq文庫構建及測序 從各樣品中取3 μg提取總RNA用于構建cDNA文庫。建庫及后續測序工作在安諾優達基因科技(北京)有限公司完成。首先，對總RNA 進行質量檢測，并將RNA片段化(平均片段長度約為350 nt)；其次，進行逆轉錄合成cDNA，末端修復，加堿基A及測序接頭，經瓊脂糖凝膠電泳分離并回收大小為 450～500 bp 左右的目的片段;其后，進行PCR擴增并純化，質檢篩選片段大小為450～500 bp左右的文庫，從而完成整個文庫制備工作;最后，將構建好的文庫使用 Iumina NextSeq500進行測序

1.2.3 轉錄組表達譜數據分析 利用比對軟件，將獲得的原始測序序列比對到馬參考基因組序列上，并且進行轉錄組數據分析，分析流程如下:1)測序數據質量檢測及分布：從Illumina 高通量測序平臺得到的原始圖像數據文件經 CASAVA 軟件進行堿基識別后轉化為原始測序序列(raw reads)，以FASTQ文件格式存儲。隨后對堿基測序錯誤率和堿基含量進行了檢測和評估。2)測序數據過濾：對原始數據進行以下幾個方面的過濾，最終得到高質量的clean reads:去除接頭污染的 reads→去除低質量的 reads→去除含 N 比例大于 5%的reads→去除與核糖體 RNA 匹配的reads。3)基因組比對分析：采取HiSAT2軟件將過濾后的RNA-seq數據同馬參考基因組(EquCab3.0)進行比對分析。隨后根據序列的比對信息，分別統計比對到外顯子、內含子和基因間區的序列數，繪制出唯一比對序列在參考基因組基因各區域的分布。4)轉錄本組裝：轉錄本拼接采用StringTie拼接軟件完成。StringTie是利用 RNA-Seq 比對結果快速組裝轉錄本并預計表達水平的軟件。StringTie先將 reads分為不同的類，然后再針對每個類的 reads生成一個拼接圖確定轉錄本，之后每個轉錄本產生一個流型神經網絡的最大流算法來評估表達水平，將復雜的數據集組裝成轉錄本。5)表達量差異表達分析統計及聚類分析：mRNA的表達量利用Countreads進行歸一化處理；利用DEseq2進行差異表達分析，并選取P<0.01和log2| fold change | >1作為有效差異表達的篩選條件，得出上、下調基因個數。6)差異表達 mRNAs 功能富集分析：以得到的差異表達mRNAs作為背景，分別進行GO注釋和KEGG富集分析。

1.2.4 RT-qPCR驗證轉錄組mRNA數據 根據轉錄組數據結果篩選了3個(TYR、TYRP1、DCT)與毛囊發育及色素合成相關的差異表達基因，通過NCBI中GenBank檢索馬的TYR、TYRP1和DCT基因序列，利用NCBI在線引物設計功能設計特異性引物(表1)并選擇GAPDH基因為內參基因，后將設計好的引物送Invitrogen公司合成。對皮膚組織提取的總RNA 按照HiScript?III 1 st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。熒光定量PCR是采用SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)，Bulk。cDNA中添加引物和熒光酶根據說明書反應體系進行實時熒光定量PCR試驗。

表1 引物列表

1.2.5 蒙古斑點馬TYR、TYRP1和DCT基因蛋白定位 對皮膚組織切片進行免疫組織化學染色，試驗流程依據UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒說明書制定。切片經過脫蠟水化處理，PBS(pH 7.2～7.4)沖洗后滴加正常非免疫動物血清，室溫孵育30 min；PBS沖洗后滴加第一抗體分別為：Anti-TYR antibody(Abcam)、Anti-TYRP1 antibody(Abcam)、 Anti-DCT antibody(Abcam)，4 ℃濕盒孵育24 h；PBS沖洗后滴加熒光二抗goat anti rabbit IgG(Jackson,美國)、goat anti mouse IgG(Jackson，美國)，暗盒孵育2 h；PBS沖洗加DAPI后將片子放置于暗盒孵育10 min；PBS沖洗后用甘油封片。

2 結 果

2.1 蒙古斑點馬體軀黑、白皮膚區域表型采集

蒙古斑點馬皮膚組織石蠟切片經過HE染色結果顯示，蒙古斑點馬皮膚毛囊結構完整，可以清晰地觀察到毛囊的毛乳頭、毛母質、毛干、內根鞘和外根鞘等。其中，黑色被毛對應的皮膚組織表皮處有明顯的黑色素沉積。毛囊的毛乳頭、毛母質部位同樣有黑色素沉積(圖2A)。而白色被毛對應的皮膚組織表皮處、毛囊的毛乳頭和毛母質部位均無黑色素沉積(圖2B)。此外，通過統計發現，蒙古斑點馬黑色被毛皮膚組織和白色被毛皮膚組織的毛囊長度、毛囊密度以及毛乳頭寬度均無顯著差異(圖3)。

綠色箭頭所指部位是毛球部The green arrow points to the position of hair bulb圖2 蒙古斑點馬毛囊形態及色素分布Fig.2 The hair follicle morphology and pigment distribution in Mongolian spotted horses

圖3 黑色被毛皮膚組織和白色被毛皮膚組織的毛囊表型比較Fig.3 Comparison of hair follicle phenotype between black and white skin tissues of Mongolian spotted horse

2.2 蒙古斑點馬體軀黑、白區域皮膚轉錄組比較

蒙古斑點馬6個RNA 測序文庫總共獲得約512 M(million)原始讀段(raw reads)。其中，6個RNA測序文庫各獲得82 027 190、91 580 266、93 635 418、 74 062 856、78 684 708、92 543 100條原始下機reads，除去低質量的reads 和接頭污染以及其他污染，最終獲得約500 M(million)有效數據(valid data)，分別為80 057 270、89 617 730、91 562 830、 72 442 634、76 848 028、90 466 312 條高質量的reads。從測序數據質量結果來看，總Q20的比例均99.99%，總Q30的比例在98.02%～98.69%之間，總GC含量在43～44%之間(表1)?？梢哉f明本研究中的測序數據堿基讀取的準確率較高。

表2 蒙古斑點馬RNA-seq數據質控

利用DEseq2軟件對蒙古斑點馬黑色和白色皮膚組織文庫中的所有 mRNA進行顯著性差異分析(圖4)，利用DESeq2軟件對兩個部位之間對比進行差異表達分析。使用Benjamini-Hochberg法校正P值小于0.05，log2|fold change| 值大于 1作為有效差異表達的閾值。共鑒定出740個基因的表達量在黑、白兩個不同顏色皮膚組織中存在顯著差異(P<0.05)，其中109個基因在蒙古斑點馬黑色皮膚組織表達量較高，215個基因在蒙古斑點馬白色皮膚組織表達量較高。

圖4 差異基因統計圖Fig.4 Scatter plot of differentially expressed genes

利用R語言的GOseq包進行差異表達基因GO富集分析，選取P<0.05的GO條目。使用KOBAS軟件(http://www.genome.jp/kegg/)來實現差異表達基因在KEGG通路中的富集統計。通過將差異表達基因同GO 數據庫進行比對，找出顯著富集的GO Term。本研究對蒙古斑點馬黑色皮膚組織間差異表達的109個基因進行了GO注釋。結果發現，差異表達的109個基因被注釋到26條 顯著GO通路上，其中注釋到生物過程中的13條 通路 上，在細胞組成被注釋到7條通路上，在分子功能被注釋到6條通路上。差異表達基因及GO通路富集到的GO term分別為melanosome(黑素體)，melanosome membrane(黑素體膜)，integral component of membrane(膜的組成部分)，structural constituent of muscle(肌肉的結構成分)，actin binding(肌動蛋白結合)，protein tyrosine/serine/threonine phosphatase activity(蛋白質酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性)，motor activity(運動活動)，melanosome organization(黑素體組織)，cellular response to lipopolysaccharide(細胞對脂多糖的反應)，melanin biosynthetic process(黑色素生物合成過程)，developmental pigmentation(發育性色素沉著)，response to interferon-gamma(對γ干擾素的反應)，muscle contraction(肌肉收縮)，sarcomere organization(肌節組織)，cardiac muscle tissue morphogenesis(心肌組織形態發生)，myofibril assembly(肌原纖維組裝)，skeletal muscle contraction(骨骼肌收縮)，protein ubiquitination(蛋白質泛素化)，striated muscle contraction(橫紋肌收縮)，skeletal muscle fiber development(骨骼肌纖維發育)，calcium ion binding(鈣離子結合)，oxidoreductase activity(氧化還原酶活性)，structural constituent of muscle(肌肉的結構成分)，actin binding(肌動蛋白結合)，protein tyrosine/serine/threonine phosphatase activity(蛋白質酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性)。

為了進一步了解差異表達基因，本研究對蒙古斑點馬差異表達基因進行了KEGG分析。結果顯示，蒙古斑點馬顯著富集的通路有11個(P<0.05)，這些通路分別為Tyrosine metabolism(酪氨酸代謝)，Hematopoietic cell lineage(造血細胞譜系)，Toll-like receptor signaling pathway(Toll樣受體信號通路)，Melanogenesis(黑色素生成)，TNF signaling pathway(TNF信號通路)，Calcium signaling pathway(鈣信號通路)，Insulin secretion(胰島素分泌)，Adrenergic signaling in cardiomyocytes(心肌細胞中的腎上腺素信號傳導)，Glycolysis / Gluconeogenesis(糖酵解/糖異生)，Oxytocin signaling pathway(催產素信號通路)，cGMP-PKG signaling pathway(cGMP-PKG信號通路)。

對通過差異表達分析篩選到的蒙古斑點馬黑、白區域皮膚組織中的差異基因做出韋恩圖，結果發現蒙古斑點馬109個基因在黑色皮膚組織中表達，215個 基因在白色皮膚中表達(圖5)。

圖5 蒙古斑點馬黑、白皮膚組織mRNA差異表達韋恩圖Fig.5 Venn diagram of differential expressed mRNAs in black and white skin tissues of Mongolian spotted horse

2.3 實時熒光定量PCR驗證

為了驗證轉錄組測序數據的有效性，本研究測定了對黑白色皮膚組織中的差異表達基因TYR、TYRP1和DCT的表達量，統計結果顯示PCR表達趨勢與測序表達趨勢一致(圖6)，說明測序結果可用于后續生物信息學分析。

圖6 黑、白皮膚組織中TYR、TYRP1和DCT基因qRT-PCR結果Fig.6 The qRT-PCR results of TYR，TYRP1 and DCT in black and white skin tissues

2.4 蒙古斑點馬TYR、TYRP1和DCT基因蛋白定位

為了進一步驗證數據的準確性，本研究對文獻中總結的和本試驗中篩選到的與黑色素形成相關的基因進行免疫熒光驗證試驗。結果顯示(圖7、圖8)，TYR和TYRP1蛋白在毛囊的毛球部位沒有信號，而DCT蛋白在毛囊毛球的毛母質位置有信號(圖9)。

圖A含黑色素毛囊，圖B不含色素毛囊，圖中黃色箭頭所指的位置是毛囊的毛球位置。下同Picture A contains black pigmented hair follicles and picture B does not contain pigmented hair follicles, the position indicated by the yellow arrow in the picture is the position of the hair bulb of the hair follicle. Same as below圖7 斑點馬背部毛囊TYR蛋白免疫熒光結果圖Fig.7 The results of TYR immunofluorescence in hair follicles at back of spotted horse

圖8 斑點馬背部毛囊TYRP1蛋白免疫熒光結果圖Fig.8 The results of TYRP1 immunofluorescence in hair follicles at back of spotted horse

3 討 論

哺乳動物色素沉著是一個復雜的調控過程，受不同因素的控制。黑色素決定了皮膚顏色，黑色素生成受亞細胞水平調控。黑色素生成過程中，各種黑素生成相關酶和抑制劑的合成和表達起關鍵作用[3]。酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)被認為是催化黑素細胞中黑色素合成的關鍵酶[4]。TYR催化兩個主要的反應：酪氨酸羥基化生成3，4-L -二羥基苯丙氨酸(3，4-L-dihydroxyphenylalanine，dopa)，和dopa氧化生成多巴醌(dopaquinone)[5]。之后，多巴醌自發轉化為多巴鉻。酪氨酸酶相關蛋白2/ 多巴異構酶(tyrosinase- related protein 2 / dopachrome tautomerase，TRP2/DCT)催化dopachrome轉化為5，6-二羥基吲哚-2-羧酸(dopachrome to 5，6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid，DHICA)。TRP1催化DHICA氧化酶氧化生成 5，6-吲哚醌羧酸(indole-5，6-quinone-2-carboxylic acid)。TRP1和DCT密切相關，可以產生不穩定的醌類化合物，并進行進一步聚合，最終導致黑色素生成[6]。酪氨酸酶及其相關蛋白是TYR基因家族中不同基因的產物，其5′端有轉錄因子的共同識別位點[7]。編碼TRPs家族的基因通常被稱為TYPS，TYR、TRP1與DCT基因相類似。目前認為，tyrp1基因編碼氧化酶活性，而tyrp2基因編碼多巴色互變酶[8]。人類TYR是由tyr基因編碼的。TYPS、TYR和TRP1受上游的小眼畸形相關轉錄因子(microphthalmia-associated transcription factor，MITF)調控，影響基因表達；它們具有多態性，可以行使不同功能，這使得幾種色素沉著狀態會同時存在，以及突變的存在[9]。同時，有研究表明，酪氨酸和酪氨酸酶相關蛋白I (TRP-I)在黑素細胞中不表達。此外，缺乏TRP-2的表達會影響蛋白銀位點的產物[9]。這也許是蒙古斑點馬黑色斑點部位毛囊有色素沉積的原因。

圖9 斑點馬背部毛囊DCT蛋白免疫熒光結果圖Fig.9 The results of DCT immunofluorescence in hair follicles at back of spotted horse

大多數哺乳動物有兩種或兩種以上的毛色，這是由皮膚表面的兩種色素決定的。黑色素是在黑素小體發育過程中由各種蛋白質產生的。黑素體是黑素細胞中的細胞器，可以合成和運輸黑色素[10]。調控黑色素生成的一組重要的相關基因是酪氨酸酶基因家族(TYR，酪氨酸酶相關蛋白1，TYRP1， dopachrome tautomeraseDCT)。TYR是調控黑色素生成的關鍵酶。TYR、TYRP1和DCT在黑素小體發育的III期發揮作用，而黑色素小體蛋白基因PMEL是控制毛色的主要候選基因之一[11]。多巴醌是一種高活性的中間體，通過一系列復雜的氧化還原反應循環最終形成黑色素[12]。當TYR活性高時，合成真黑素。相反，褐黑素是在其活性不高時合成的[13]。TYR中的錯義突變His214Asn可能引起雞的巧克力毛色和黑素體結構的改變[14]。兔子中TYR基因的3個未翻譯區域的缺失導致黑色素合成減少[15]。與白水貂相比，TYRP1基因表達水平會在黑色毛皮中上調[16]。TYR基因在青灰色和黑色雞的表達水平高于白色[17]，但在淺棕色和白色組之間沒有顯著差異。然而，DCT基因的表達僅在青灰色組上調，與水貂和家兔的研究一致[18]。說明TYR、TYRP1和DCT基因富集在細胞成分，黑素體膜中；TYR和TYRP1基因富集于黑色素生物合成過程、黑素小體組織和色素沉著DCT基因在TYR的發育色素沉著和黑色素生物合成過程中富集。

動物的被毛顏色是毛囊中的黑色素細胞決定的，被毛附著在皮膚的最外層，具有防御、保護和信息交流作用[19-20]。本研究發現，蒙古斑點馬毛囊結構與其他哺乳動物毛囊結構基本一致，主要由毛干、毛根兩部分構成。粱朝錄[21]等在對雙峰駝毛囊群結構的研究中提出，雙峰駝的毛囊群結構與肉食獸的毛囊群相似，屬于復合毛囊。同樣，Trautmann[22]研究發現，駱駝、狗和貓的毛囊都屬于復合毛囊。趙若陽[23]對阿爾山雪兔毛色的研究發現，雪兔毛囊結構為典型的復合毛囊，同一個毛道中同時可以長出多根毛囊。而在蒙古斑點馬毛囊上未發現此現象。這與李超[24]對蒙古馬被毛毛囊形態的研究結果描述相符。因此，可以說明蒙古斑點馬為非復合毛囊。

轉錄組技術可以從細胞或者組織中獲取所表達的全部轉錄本，這些轉錄本可以表現出機體各種細胞類型、生理狀態、組織類型或生命階段下所表達的全部基因。因此，通過轉錄組技術可以反映出特定時期或生命狀態下全部基因的表達水平及調控規律。轉錄組技術在動物毛色研究上也有很多的應用價值。許鐘峯[25]對同一頭陸川豬黑色和白色皮膚組織進行了轉錄組測序，得知黑色皮膚相對于白色皮膚有7個基因表達顯著上調，包括TYRP1、DCT、TRPM1等與黑色素合成相關基因，由于白色皮膚因缺少TYRP1和TYRP2基因的表達造成代謝通路中無法合成真黑色素。趙博昊等[26]利用高通量測序技術篩選獺兔毛色相關基因，共篩選出17 327個差異表達基因，其中上調基因8 445個，下調基因8 882個，在這些差異基因當中，包含與毛色形成的相關基因，例如TYR、TYRP1、ASIP等基因，這些毛色相關基因都與酪氨酸及黑色素形成有著密切聯系。Yao等[27]利用Illumina HiSeq X Ten測序技術檢測了綿羊白色、淺棕色、黑色和青灰色毛色的相關基因，轉錄組分析結果發現，DCT、TYR、TYRP1、PMEL、SLC45A2、MLANA等 6個差異表達基因參與了毛色的調節。這些基因與黑素細胞分化、黑素小體運輸、發育性色素沉著和黑色素生物合成過程有關。Xiong等[28]使用Illumina NovaSeq測序平臺對波爾和麻城山羊毛囊的黑色和白色區域的皮膚進行了轉錄組測序，在黑色和白色區域的皮膚中共鑒定出165個差異表達基因，認為TYR、DCT、TYRP1、GPR143、SLC45A2等可能與雜交山羊黑色素沉著有關，Agouti可能在顏色模式的形成中起著關鍵的發育調控作用。Li等[29]使用轉錄組技術對白色和黑色蒙古馬進行了表達譜分析，鑒定出了231 個調控蒙古馬毛色的差異表達基因，其中 119 個為下調基因、112 個為上調基因。Fan等[17]以蘇尼特綿羊皮膚樣本為研究對象，通過 Illumina HiSeqTM2000 測序平臺開展了皮膚組織 RNA-seq 研究，發現在已知45 個毛色基因中，13 個在黑色被毛綿羊皮膚中顯著高表達，包括TYRP1、TYR、MLPH、MATP和Silver基因等。而本研究中通過差異表達分析篩選到了109個基因在黑色皮膚組織中表達。包括TYR、TYRP1、DCT基因，預示蒙古斑點馬斑點表型的形成與這3個基因具有直接的聯系。

4 結 論

本試驗以蒙古斑點馬為研究對象，分別對蒙古斑點馬體軀白色區域和黑色區域皮膚的表型和差異表達基因進行分析并驗證。經HE染色發現白色區域和黑色區域皮膚毛囊組織表型上并沒有顯著差異，但其中的黑色素分布有明顯的差異，黑色素細胞主要分布于黑色皮膚組織表皮和毛囊毛球部位，而白色皮膚組織相對應的位置未發現有黑色素沉積。其次對白色和黑色區域皮膚進行轉錄組測序，測序結果中得到了324個基因的表達量在黑、白兩個不同區域皮膚組織中存在顯著差異，其中109個基因在蒙古斑點馬黑色皮膚組織表達量較高，215個基因在蒙古斑點馬白色皮膚組織表達量較高。差異表達的mRNAs主要富集到了黑色素生成通路(主要參與基因包括TYR、TYRP1、DCT、PAX3、DAPL1等)。通過免疫組化試驗發現，TYR和TYRP1蛋白在毛囊的毛球部位不表達，DCT在毛囊毛球的毛母質部位表達。從而得知，蒙古斑點馬的毛色形成主要由黑色素形成相關基因的表達量所決定，與其他表型相近的哺乳動物未有太大的差距。