綿羊miR-127/FOXO4反饋環(huán)路及其對卵泡顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

付 強(qiáng)，岳巧嫻，錫建中，宋鵬琰，陳曉勇，周榮艷

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，保定 071001)

綿羊產(chǎn)羔數(shù)的遺傳力較低[1]，易受環(huán)境、季節(jié)、營養(yǎng)等條件影響[2]。卵泡的生長、發(fā)育與綿羊產(chǎn)羔數(shù)密切相關(guān)，即當(dāng)綿羊排卵率上升時產(chǎn)羔數(shù)增加[3]。顆粒細(xì)胞為哺乳動物卵泡的發(fā)育、成熟提供物質(zhì)保障[4]。miRNA是由18～24個核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA分子，通過堿基互補(bǔ)配對的方式作用于靶基因，進(jìn)而降解mRNA或阻礙其翻譯，在調(diào)控卵泡發(fā)育、閉鎖和顆粒細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮作用[5]。

FOXO4屬于FOXO家族成員，此家族成員在生物體中參與的調(diào)節(jié)通路基本相同，F(xiàn)OXO4參與了機(jī)體的糖脂代謝過程，體內(nèi)高表達(dá)FOXO4的小鼠，糖異生受到抑制[6]，細(xì)胞中膽固醇的合成量減少、葡萄糖的攝入量增加[7]，經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)和胰島素等多因素刺激后，誘導(dǎo)FOXO4乙酰化而使其活化, 促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8-9]。FOXO4參與了能量代謝過程，在生物體代謝穩(wěn)定過程中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，廣泛影響細(xì)胞的生理過程[10]。

顆粒細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞自主發(fā)生的模式[11-12]，在卵泡發(fā)育過程中扮演著重要角色。卵泡發(fā)育、成熟過程中，顆粒細(xì)胞凋亡則通常被認(rèn)為是引起卵泡閉鎖的“誘因”[13]。miRNA調(diào)控動物卵泡顆粒細(xì)胞凋亡[14]。綿羊miR-150通過靶向STAR基因，抑制孕酮合成相關(guān)基因表達(dá)減少孕酮合成，促進(jìn)體外顆粒細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖[15]。miR-26b通過靶向SMAD4基因促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞凋亡[16]。miR-181a-5p通過靶向SIRT1抑制鵝顆粒細(xì)胞凋亡[17]。近年來研究表明，miRNAs在動物卵泡顆粒細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用。

本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH顯著降低了綿羊卵泡顆粒細(xì)胞oar-miR-127和FOXO4的表達(dá)水平，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平上升。根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，推測oar-miR-127可能靶向FOXO4基因，且在細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中發(fā)揮作用，目前oar-miR-127在綿羊顆粒細(xì)胞中的研究未見報道，本研究擬明確oar-miR-127對綿羊顆粒細(xì)胞凋亡的影響及其與靶基因FOXO4之間的互作關(guān)系，為闡明其在綿羊卵泡發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 綿羊卵泡顆粒細(xì)胞分離培養(yǎng)及293T細(xì)胞培養(yǎng)

將復(fù)蘇后的293T細(xì)胞(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，轉(zhuǎn)移到含有2 mL DMEM完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗)的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中。

采集綿羊卵巢，去除卵巢周圍多余的脂肪，割開卵泡皮質(zhì)層后將液體收集于離心管中，1 000 r·min-1離心10 min，去上清，重復(fù)3次。加入適量DMEM/F12完全培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基+10%胎牛血清+0.1%丙酮酸鈉+1%雙抗)，吹打混勻后接種于培養(yǎng)瓶中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 引物設(shè)計

以綿羊FOXO4、Casp3和Bax基因為模板設(shè)計qRT-PCR引物，以oar-miR-127成熟體序列為模板設(shè)計莖環(huán)引物；利用Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)預(yù)測綿羊miR-127基因啟動子，設(shè)計啟動子擴(kuò)增引物(Primer 3, https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)，測序引物由擎科生物公司合成(表1)。

表1 引物信息表

1.3 綿羊卵泡顆粒細(xì)胞總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

利用TRIzol試劑對收集的細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取。采用NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific, 美國)進(jìn)行濃度測定。將RNA稀釋至200 ng·μL-1，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa, Code No.RR047A)說明書進(jìn)行cDNA合成。反轉(zhuǎn)錄體系包含10.0 μL去除基因組DNA的反應(yīng)液，1.0 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，1.0 μL RT Primer Mix(反轉(zhuǎn)錄oar-miR-127時，換成oar-miR-127反轉(zhuǎn)錄引物)，4.0 μL 5×PrimeScript Buffer 2，4.0 μL RNase Free Water，反轉(zhuǎn)錄條件為42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.4 miR-127啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子FOXO4結(jié)合位點預(yù)測和重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.4.1 miR-127啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子FOXO4結(jié)合位點預(yù)測 利用Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)預(yù)測綿羊miR-127啟動子(NCBI，Gene ID: 102466274)，并利用JASPAR在線數(shù)據(jù)庫 (http://jaspar.genereg.net/) 預(yù)測oar-miR-127和轉(zhuǎn)錄因子FOXO4的結(jié)合位點，以分?jǐn)?shù)為評判依據(jù)進(jìn)行結(jié)合位點的篩選。

1.4.2FOXO4過表達(dá)載體構(gòu)建 在Ensembl中下載綿羊FOXO4的CDS區(qū)序列，利用重組臂技術(shù)將目的片段(完整編碼區(qū))連接至pcDNA3.1(+)質(zhì)粒。利用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切pcDNA3.1(+)過表達(dá)載體，膠回收純化，使用T4連接酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)在4 ℃條件下將目的條帶與酶切產(chǎn)物連接10 min，目的片段與酶切產(chǎn)物質(zhì)量比為1∶6，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Trans5α，過夜培養(yǎng)，利用SalⅠ酶切和測序篩選陽性克隆。

1.4.3 miR-127啟動子區(qū)熒光素酶報告載體構(gòu)建 選取miR-127啟動子區(qū)包含轉(zhuǎn)錄因子FOXO4結(jié)合位點長度為600 bp的目的片段(-1 401～-2 000 bp)。 利用MluⅠ和Hind Ⅲ酶切pGL3-basic載體，膠回收純化，將目的條帶與酶切產(chǎn)物用T4連接酶在4 ℃條件下連接10 min，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Trans5α，過夜培養(yǎng)，利用酶切(HpaⅠ、HindⅢ)和測序篩選陽性克隆。

1.5 靶基因FOXO4的3′-UTR miR-127結(jié)合位點預(yù)測與熒光素酶報告載體構(gòu)建

利用TargetScan在線預(yù)測靶基因結(jié)合位點，選取包含miR-127結(jié)合位點長度為70 bp的FOXO4基因序列，在序列兩端添加SacⅠ、XbaⅠ酶切位點(表2)。將兩條鏈按照如下體系進(jìn)行退火：FOXO4 3′-UTR正義鏈、反義鏈各10 μL，反應(yīng)條件為95～25 ℃溫度梯度，每個梯度相差5 ℃，反應(yīng)時間為2 min。利用SacⅠ酶和XbaⅠ酶對pmir-GLO質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，利用膠回收試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物。利用T4連接酶在4 ℃條件下連接10 min， 轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后挑選菌落，利用PCR擴(kuò)增和測序篩選陽性克隆。

1.6 293T和綿羊卵泡顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶活性檢測

1.6.1 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選取對數(shù)期的293T細(xì)胞，按1.6×105個·孔-1接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。共轉(zhuǎn)染miR-127 mimic、mimicNC和FOXO4野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒、缺失型質(zhì)粒(0.5 μg DNA，1.0 μL P3000TM，1.5 μL LipofectamineTM 3000)，每組設(shè)3個重復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶的活性檢測。pcDNA3.1-FOXO4重組質(zhì)粒與pGL3-basic(miR-127)的共轉(zhuǎn)染方法同上。

1.6.2 綿羊卵泡顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將在體外培養(yǎng)的綿羊卵泡顆粒細(xì)胞按1.6×105個·孔-1接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)。細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時，利用HiPerFect Transfection Reagent將miR-127 mimic(50 nmol·L-1)、mimic NC(50 nmol·L-1) 轉(zhuǎn)染綿羊顆粒細(xì)胞(30 μL Optim-MEM，1.25 μL mimic/2.5 μLmimic NC，3 μL HiPer- Fect Transfection Reagent)，每組設(shè)3個重復(fù)孔，處理48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子FOXO4 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染綿羊卵泡顆粒細(xì)胞步驟同“1.6.1”。

1.6.3 熒光素酶活性檢測 轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞收集于EP管中，用GloMax Multi Jr單管多功能檢測儀(Promega，美國)檢測熒光素酶活性，每管添加100 μL Stop & Glo Reagent，檢測海腎熒光素酶活性，重復(fù)檢測3次，計算螢光蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性比值。

1.7 qPCR檢測miR-127及相關(guān)基因表達(dá)

miR-127及mRNAs均按以下反應(yīng)體系和條件進(jìn)行設(shè)置，每個樣品設(shè)3個技術(shù)重復(fù)。qRT-PCR擴(kuò)增體系為：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.4 μL (10 pmol·L-1)， Super Evagreen?qPCR Master Mix(Biotium，美國) 10 μL，ROX(100×) 3 μL，水5.2 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。利用2-△△Ct方法計算目的基因的相對表達(dá)量，miRNA表達(dá)量計算以U6為內(nèi)參，mRNAs表達(dá)量計算以GAPDH為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism8軟件進(jìn)行作圖分析，采用獨立樣本t檢驗比較兩組間基因表達(dá)量的差異，利用單因素方差分析相對熒光素酶活性，使用Duncan’s多重極差檢驗法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 載體的構(gòu)建

2.1.1 轉(zhuǎn)錄因子FOXO4過表達(dá)載體的酶切驗證 利用SalⅠ酶對轉(zhuǎn)錄因子FOXO4與過表達(dá)載體(pcDNA3.1+)的重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，如圖1所示，酶切片段大小均符合目的片段的長度；將測序結(jié)果與目的片段序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)序列一致并無突變，說明質(zhì)粒可進(jìn)行下一步試驗。

2.1.2 miR-127啟動子區(qū)熒光素酶報告載體酶切驗證 利用HpaⅠ和Hind Ⅲ酶對miR-127啟動子區(qū)片段與pGL3-basic的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切片段大小與目的片段長度相符(圖2)，將測序結(jié)果與目的片段序列比對發(fā)現(xiàn)序列完全一致，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.1.3FOXO4基因3′-UTR區(qū)結(jié)合位點熒光素酶報告載體構(gòu)建 在線預(yù)測的綿羊miR-127與FOXO4基因3′-UTR二者的結(jié)合位點見圖3。依據(jù)該結(jié)合位點利用pmir-GLO載體構(gòu)建FOXO4基因3′-UTR野生型、突變型和缺失型重組質(zhì)粒。分別培養(yǎng)其單克隆菌，利用PCR鑒定陽性菌落，挑選符合目的片段大小的菌落擴(kuò)增后進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果與原序列進(jìn)行比對(圖4)，序列無突變，表明載體構(gòu)建成功。

1.未酶切的pGL3-basic質(zhì)粒；2.使用Hpa Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切重組質(zhì)粒1. Undigested pGL3-basic plasmid; 2. Double digested recombinant plasmid with Hpa Ⅰand Hind III圖2 miR-127啟動子區(qū)熒光素酶報告載體重組質(zhì)粒酶切電泳圖Fig.2 Enzyme digestion electrophoresis diagram of the recombinant plasmid of the luciferase reporter vector in the promoter region of miR-127

2.2 綿羊miR-127與FOXO4基因的相互作用

2.2.1 轉(zhuǎn)錄因子FOXO4對miR-127啟動子轉(zhuǎn)錄活性及其表達(dá)水平的影響 利用JASPAR軟件預(yù)測并通過評分篩選，miR-127啟動子區(qū)與轉(zhuǎn)錄因子FOXO4的結(jié)合位點為GTGAACA，詳見表3。轉(zhuǎn)錄因子FOXO4過表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和miR-127啟動子區(qū)重組質(zhì)粒pGL3-miR-127共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。如圖5所示，pGL3-miR-127+pcDNA3.1-FOXO4組熒光素酶活性值顯著低于pGL3-miR-127+ pcDNA3.1組(P<0.05，圖5A)，表明轉(zhuǎn)錄因子FOXO4負(fù)調(diào)控miR-127的表達(dá)。將FOXO4過表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞，pcDNA3.1-FOXO4組 miR-127的表達(dá)水平顯著低于pcDNA3.1組(P<0.05，圖5B)，表明轉(zhuǎn)錄因子FOXO4抑制了miR-127的表達(dá)。

圖3 miR-127與FOXO4基因3′-UTR的結(jié)合位點Fig.3 The binding sites of miR-127 and FOXO4 3′-UTR

圖4 FOXO4重組質(zhì)粒序列比對圖Fig.4 Alignment of recombinant plasmid sequence of FOXO4

表3 miR-127啟動子區(qū)與轉(zhuǎn)錄因子FOXO4預(yù)測結(jié)合位點

A.FOXO4過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后熒光素酶活性值；B.FOXO4過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染綿羊卵泡顆粒細(xì)后miR-127的相對表達(dá)量。*. P<0.05，下同A. Luciferase activity value after FOXO4 overexpression vector transfected into 293T cells; B. Relative expression level of miR-127 after FOXO4 overexpression vector transfected into ovine follicular granulosa cells. *. P<0.05, the same as below圖5 相對熒光素酶活性和miR-127的相對表達(dá)量Fig.5 Relative luciferase activity and relative expression of miR-127

2.2.2 綿羊miR-127與基因FOXO4間的靶向關(guān)系驗證 綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中過表達(dá)miR-127后，F(xiàn)OXO4的表達(dá)量極顯著降低(P<0.01，圖6A)。為進(jìn)一步驗證FOXO4與miR-127的靶向關(guān)系，進(jìn)行了雙熒光素酶報告試驗。結(jié)果顯示，與共轉(zhuǎn)染mimic NC+FOXO4-WT野生型載體組相比，共轉(zhuǎn)染miR-127 mimic+FOXO4-WT野生型載體組的293T細(xì)胞中熒光素酶活性顯著降低(P<0.05，圖6B)，表明miR-127可以靶向結(jié)合FOXO4 3′-UTR序列，抑制FOXO4基因的表達(dá)；分別與共轉(zhuǎn)染mimic NC+FOXO4-MUT突變型和共轉(zhuǎn)染mimic NC+FOXO4-DEL缺失型載體組相比，共轉(zhuǎn)染miR-127 mimic+FOXO4-MUT突變型和共轉(zhuǎn)染miR-127 mimic+FOXO4-DEL缺失型載體組的熒光素酶活性均無顯著差異(P>0.05，圖6B)，表明FOXO4 3′-UTR序列的突變和缺失均能消除miR-127對FOXO4基因的抑制作用，進(jìn)一步表明miR-127可以靶向結(jié)合FOXO4基因3′-UTR序列，并抑制FOXO4基因的表達(dá)。

A. miR-127 mimic 或mimic NC轉(zhuǎn)染綿羊卵泡顆粒細(xì)胞后FOXO4基因的相對表達(dá)量；B. miR-127 mimic、mimic NC分別與FOXO4野生、突變、缺失型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后相對熒光素酶活性A. Relative expression of FOXO4 gene after miR-127 mimic or mimic NC transfected into sheep follicular granulosa cells; B. The relative luciferase activity of miR-127 mimic, mimic NC and FOXO4 wild, mutant, and deletion plasmids transfected into 293T cells圖6 相對熒光素酶活性和FOXO4基因的相對表達(dá)量Fig.6 Relative luciferase activity and relative expression of FOXO4 gene

2.3 oar-miR-127對凋亡基因Casp3和Bax表達(dá)水平的影響

為探究miR-127對綿羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的影響，轉(zhuǎn)染miR-127后檢測凋亡基因Casp3和Bax的mRNA表達(dá)變化。結(jié)果如圖7所示，與mimic NC組相比，miR-127 mimic能極顯著上調(diào)Casp3和Bax基因的表達(dá)(P<0.001)。

2.4 過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FOXO4對細(xì)胞凋亡基因表達(dá)水平的影響

實時熒光定量PCR檢測過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FOXO4的綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中凋亡基因Casp3、Bax和BCL2的mRNA表達(dá)水平(圖8)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FOXO4后，Casp3和Bax基因相對表達(dá)量與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1相比沒有顯著差異(P>0.05)，但BCL2基因相對表達(dá)量與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1相比顯著降低0.4倍(P<0.05)。

A. 凋亡基因Casp3相對表達(dá)量；B. 凋亡基因Bax相對表達(dá)量。***.P<0.001A. Relative expression of apoptosis gene Casp3; B. Relative expression of apoptosis gene Bax. ***.P<0.001圖7 轉(zhuǎn)染miR-127顆粒細(xì)胞凋亡基因Casp3和Bax的表達(dá)水平Fig.7 Relative expression level of apoptosis genes Casp3 and Bax in granulosa cells

3 討 論

綿羊卵泡的發(fā)育與顆粒細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)[18]。卵泡的成熟過程中，大約99%的卵泡被淘汰而產(chǎn)生閉鎖，卵巢顆粒細(xì)胞是影響卵泡發(fā)育的重要“中介”，顆粒細(xì)胞凋亡會直接導(dǎo)致卵泡閉鎖，進(jìn)而影響生殖功能[19]。miRNA在調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[15]。對oar-miR-127進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子FOXO4與miR-127的啟動子區(qū)結(jié)合，抑制了miR-127的表達(dá)；miR-127與靶基因FOXO4的3′-UTR區(qū)結(jié)合，抑制綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中FOXO4基因的表達(dá)，并促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，明確了miR-127在卵泡顆粒細(xì)胞中的作用，間接表明miR-127通過靶向FOXO4可能促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡，為闡明miR-127和FOXO4調(diào)控卵泡閉鎖機(jī)理提供了一定的理論依據(jù)。miR-127是內(nèi)源性具有調(diào)控功能的非編碼RNA[20]，不同組織中miR-127的表達(dá)量不同，其在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于正常軟骨細(xì)胞，miR-127靶向下調(diào)adipoR1基因的表達(dá)，促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的增殖[21]。miR-127-3p可直接靶向于Ddit3基因的CDS區(qū)域，調(diào)控靶基因表達(dá)，顯著促進(jìn)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞分化[22]；miR-127-5p特異性結(jié)合IRAK4，負(fù)調(diào)控其表達(dá)，誘導(dǎo)了肺炎鏈球菌肺泡上皮細(xì)胞凋亡[23]，miR-127-3p靶向下調(diào)MAPK4基因表達(dá)來抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]。miR-96-5p通過靶向FOXO4抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖[10]，表明了miRNA可以通過靶向FOXO4調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡。FOXO4是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一[25-26]，能夠加速細(xì)胞集落的衰老，通過抑制細(xì)胞的凋亡進(jìn)而維持人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的活力和功能[27]。miR-421通過抑制FOXO4基因的表達(dá)進(jìn)而抑制致鼻咽癌細(xì)胞的增殖和凋亡[28]；FOXO4在人黃素化的壁顆粒細(xì)胞中表達(dá)[29]，表明其參與卵泡發(fā)育和黃體生成過程，在卵泡顆粒細(xì)胞凋亡過程中起著重要的調(diào)控作用，但有關(guān)FOXO4在卵泡顆粒細(xì)胞中作用的相關(guān)報道較少，其對綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的作用機(jī)理和卵泡閉鎖的影響還需要深入研究。miR-128-3p通過抑制FOXO4和MMP9的表達(dá)來抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[30]。

A、B、C.表示過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FOXO4后凋亡基因Casp3、Bax和BCL2相對表達(dá)量A, B, C. Represent the relative expression levels of apoptosis genes Casp3, Bax and BCL2 after overexpression of transcription factor FOXO4, respectively圖8 過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FOXO4顆粒細(xì)胞中凋亡基因的表達(dá)水平Fig.8 The expression level of apoptotic genes in granulosa cells with overexpressed transcription factor FOXO4

4 結(jié) 論

本試驗證實了綿羊miR-127與轉(zhuǎn)錄因子FOXO4之間存在反饋抑制環(huán)路。此外，F(xiàn)OXO4通過下調(diào)抑凋亡基因BCL2的表達(dá)，miR-127通過上調(diào)促凋亡基因Casp3和Bax的表達(dá)，促進(jìn)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡。