番茄紅素對壬基酚誘導小鼠脾損傷的保護作用及機制研究

楊少青，邵春艷，周 彬，宋泉江，王曉杜*，宋厚輝*，姜 勝*

(1.浙江農林大學動物科技學院、動物醫學院，杭州 311300； 2.浙江省畜禽綠色生態健康養殖應用技術研究重點實驗室，杭州 311300； 3.動物健康互聯網檢查技術浙江省工程實驗室，杭州 311300)

壬基酚(nonylphenol，NP)是一種非離子表面活性劑，在工、農業產品中應用廣泛[1]。但其帶來的污染問題不容忽視，在多個來自世界各地區的環境樣本中都檢出較高水平的NP[2-3]，同時，大量研究發現，NP具有雌激素樣效應，除了會產生生殖毒性外，同樣會對肝、腎、神經系統等多種器官造成損傷[4-7]。番茄紅素(lycopene，LYC)是一種類胡蘿卜素家族的異戊二烯類化合物，具有極強的抗氧化活性，是迄今為止自然界存在的抗氧化性最強的類胡蘿卜素[8-10]。大量流行病學調查及試驗研究證實，LYC具有抗氧化、抗炎癥、活化免疫系統、解毒及預防和治療癌癥等功效，且至今尚未發現毒副作用[11-13]。然而，目前尚無研究評估LYC干預NP亞慢性毒性作用。因此，本試驗通過建立LYC干預小鼠NP亞慢性中毒試驗模型，探究LYC對NP造成的小鼠脾損傷的保護機制，為LYC的應用和NP中毒的防護提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥品試劑

清潔級ICR小鼠(40只，雌雄各半，體重18～23 g)購自杭州子源實驗動物科技有限公司，實驗動物合格證號為20200514Aabz0105999491。壬基酚(GR，純度≥99%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；番茄紅素(UV≥98%)和玉米油均購自北京索萊寶科技有限公司；抗氧化指標(T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px和MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；免疫細胞因子(IL-2、IFN-γ和TNF-α)ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Akt、p-Akt、p53、Bcl-2、Bax，β-actin的一抗購自北京博奧森生物技術有限公司，羊抗兔和羊抗鼠的二抗購自美國Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 藥品配置

根據課題組前期試驗結果(未發表)和參考文獻[14]，將小鼠NP亞慢性中毒劑量和番茄紅素干預劑量分別定為150 和5 mg·kg-1。按照每10 g體重0.1 mL的灌胃量，稱取適量NP溶解于相應體積玉米油中，配制成30 mg·mL-1NP溶液，番茄紅素使用玉米油配制成1 mg·mL-1溶液，現用現配。

1.3 試驗設計與分組

40只清潔級ICR小鼠隨機分為4組，每組10只，雌雄各半：對照組(control group，CON)每天8:30經口灌服玉米油0.1 mL，2 h后經口灌服玉米油0.1 mL；中毒組(nonylphenol group，NPG)每天8:30經口灌服玉米油0.1 mL，2 h后經口灌服150 mg·kg-1壬基酚溶液；番茄紅素對照組(lycopene group，LCG)每天8:30經口灌服5 mg·kg-1番茄紅素，2 h后經口灌服0.1 mL玉米油；番茄紅素干預組(lycopene+ nonylphenol group，LNG)每天8:30經口灌服5 mg·kg-1番茄紅素，2 h后經口灌服150 mg·kg-1壬基酚溶液。所有實驗動物雌雄分籠飼養，每晚21:00禁食，自由飲水，按試驗計劃連續灌胃30 d，每5 d稱重1次，根據體重變化調整各藥物灌服量。試驗結束后各組小鼠確保不少于8只。

1.4 樣品采集

各組小鼠經口灌服藥物30 d后，于第31天8:30準確稱量小鼠體重。稱重后小鼠進行頜下靜脈采血0.5 mL，用于檢測外周血免疫因子水平。安樂死后，小鼠開腹，采集脾準確稱重后將脾分為3份，分別用于脾組織顯微結構測定、抗氧化指標測定和凋亡通路蛋白水平測定。

1.5 平均日增重及脾體系數測定

按如下方法計算日均增重和脾體系數：日均增重(g·d-1)=(試驗后體重-試驗前體重)/試驗天數；脾體系數=脾重量/試驗后體重×100%。

1.6 脾組織顯微結構測定

取適量脾組織至于10%甲醛溶液中固定，常規脫水，石臘包埋，制備切片，HE染色后光學顯微鏡下觀察脾顯微結構變化。

1.7 外周血免疫細胞因子測定

取適量血清，按照試劑盒說明書采用ELISA法，測定血清中IL-2，IFN-γ和TNF-α的濃度。

1.8 抗氧化指標測定

取適量脾組織與冰浴生理鹽水混合后通過組織破碎儀制備成10%勻漿，3 000 r·min-14 ℃離心15 min，取上清-80 ℃備用。脾組織勻漿分別按照各抗氧化指標試劑盒的說明書進行操作，最后用酶標儀測定血清和脾中各抗氧化指標的含量。

1.9 脾中凋亡通路相關蛋白測定

蛋白提取：取-80 ℃凍存的脾組織，冰上解凍后，剪取稱重50 mg組織，放入預冷的玻璃勻漿器，加入200 μL裂解液和5 μL蛋白酶抑制劑PMSF，冰浴研磨至充分裂解，冰上靜置5 min；移入1.5 mL離心管中，超聲持續10 s 5次，間隔4次，每次10 s；4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min。離心后上清即為脾組織全蛋白提取物。

蛋白濃度測定及樣品制備：利用BCA試劑盒測定脾組織蛋白提取物濃度。根據濃度上樣體積定為20 μg每15 μL上樣液，加入3 μL蛋白上樣緩沖液(5X)和PBS。沸水浴10 min，冷卻后分裝，-80 ℃保存。

蛋白含量表達檢測：取15 μL變性蛋白樣本，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用濕轉法將目的蛋白從凝膠轉移至PVDF膜上，隨后用5%脫脂奶粉室溫孵育2 h；封閉結束后，用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。洗膜結束后，將膜置于已稀釋好相應倍數的一抗中4 ℃孵育過夜；一抗孵育結束后，再次用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。洗膜結束后，將膜置于相同種屬的二抗中室溫孵育1 h；孵育結束后，第3次用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。洗膜結束后，在膜上滴加ECL顯色液放入凝膠成像系統中曝光成像。以β-actin為內參蛋白，用Image J軟件進行蛋白條帶灰度值的分析，最終計算出目的蛋白相對表達量。

1.10 統計學方法

試驗所得數據表示為“平均值±標準誤”，使用GraphPad Prism 8.0軟件進行數據制圖，試驗數據采用單因素方差分析，運用T檢驗進行數據配對差異分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 各組小鼠體重增長系數及脾體系數

試驗過程中，各組實驗小鼠均未出現死亡，各組小鼠精神狀態、食欲、采食量以及排便等狀況未有明顯異常，但與CON小鼠比較，NPG小鼠日均增重顯著降低(P<0.05)，而與CON小鼠比較，LCG小鼠和LNG小鼠日均增重無顯著性差異(P>0.05)；與NPG小鼠比較，LNG小鼠日均增重顯著升高(P<0.05，圖1A)。各組實驗小鼠脾體系數結果顯示，與CON小鼠比較，NPG小鼠和LNG小鼠脾體系數顯著升高(P<0.05)，其余各組間無顯著性差異(P>0.05，圖1B)。

*表示與CON相比差異顯著(P<0.05)；#表示與NPG比較差異顯著(P<0.05)。下同* Means significant different versus CON; # Means significant different versus NPG. The same below圖1 番茄紅素干預對NP染毒小鼠體重增長(A)及脾體系數(B)的影響Fig.1 Effect of lycopene on body weight gain(A)and spleen/body coefficient(B)of mice exposed to NP

2.2 LYC對NP亞慢性中毒小鼠脾組織結構的影響

如圖2所示，NPG小鼠脾小結中可見生發中心擴張(黑色箭頭)，伴有大量淋巴細胞凋亡，核碎裂(黃色箭頭)；紅髓中可見較大量的髓外造血細胞(紅色箭頭)(圖2B)，損傷嚴重；LNG小鼠脾小結邊緣帶增厚(黑色箭頭)；紅髓中可見較多髓外造血細胞(黃色箭頭)，伴有多核巨細胞數量少量增多(紅色箭頭)(圖2C)，損傷輕微；LCG小鼠脾紅髓白髓分界清晰，脾小結形狀規則、淋巴細胞數量豐富；紅髓中可見少量髓外造血細胞(黑色箭頭)(圖2D)與CON小鼠脾結構無明顯差異。

A～D分別為CON、NPG、LNG和LCG小鼠脾組織切片圖Histological section of mouse spleen: A. CON; B. NPG; C. LNG; D. LCG圖2 番茄紅素干預對NP染毒小鼠脾組織結構的影響(100×)Fig.2 Effect of lycopene on spleen tissue structure of NP exposed mice(100×)

2.3 LYC對NP亞慢性中毒小鼠血清中細胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的影響

如圖3所示，與CON比較，NPG小鼠血清中細胞因子IL-2顯著降低(P<0.05)，細胞因子IFN-γ和TNF-α極顯著降低(P<0.01)；經過LYC干預后，與NPG小鼠比較，LNG小鼠血清中細胞因子IL-2極顯著升高(P<0.01)，細胞因子IFN-γ和TNF-α顯著升高(P<0.05)。

A.各組小鼠血清IL-2濃度；B.各組小鼠血清IFN-γ濃度；C.各組小鼠血清TNF-α濃度。**表示與CON比較差異極顯著(P<0.01)；##表示與NPG比較差異極顯著(P<0.01)。下同A. Serum IL-2 contents of mice in different group; B. Serum IFN-γ contents of mice in different group; C. Serum TNF-α contents of mice in different group. ** Means extremely significant different versus CON; ## Means extremely significant different versus NPG. The same below圖3 番茄紅素干預對NP染毒小鼠血清中細胞因子IL-2(A)、IFN-γ(B)和TNF-α(C)的影響Fig.3 Effect of lycopene on serum IL-2(A), IFN-γ(B) and TNF-α(C) of NP exposed mice

2.4 LYC干預對NP亞慢性中毒小鼠脾氧化損傷的影響

由圖4可知，與CON比較，NPG小鼠脾GSH-Px、CAT、SOD活性及總抗氧化能力(T-AOC)均顯著下降(P<0.05)；與CON比較，LNG小鼠脾GSH-Px、SOD活性均顯著下降(P<0.05)，而CAT活性和總抗氧化能力(T-AOC)無顯著性差異(P>0.05)；與NPG比較，LNG小鼠脾CAT、SOD活性及總抗氧化能力(T-AOC)均顯著升高(P<0.05)，但NPG小鼠脾GSH-Px活性與LNG比較則無顯著性差異(P>0.05)；與CON比較，LCG小鼠脾SOD活性顯著升高(P<0.05)。與CON比較，NPG小鼠脾MDA含量顯著升高(P<0.05)；與NPG相比，LNG小鼠脾MDA含量顯著下降(P<0.05)；LCG和LNG小鼠脾MDA含量與CON比較無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 番茄紅素干預對NP染毒小鼠脾氧化應激的影響Fig.4 Effects of lycopene on oxidative stress in spleen of NP exposed mice

2.5 LYC干預對NP亞慢性中毒小鼠凋亡相關蛋白表達的影響

由圖5可知，與CON比較，NPG小鼠脾p53、Bax蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2、Akt、p-Akt蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)，LCG小鼠脾p53、Bax蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2、p-Akt、Akt蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)；與NPG比較，LNG和LCG組小鼠脾p53、Bax表達水平顯著降低(P<0.05)，LNG和LCG組小鼠Bcl-2、p-Akt、Akt蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。

A.番茄紅素干預對NP染毒小鼠脾凋亡相關蛋白p53/Bcl-2/Bax表達的影響；B、C、D、F、G.各蛋白表達情況灰度分析；E.番茄紅素干預對NP染毒小鼠脾凋亡相關蛋白Akt/p-Akt表達的影響A. Effects of LYC on apoptotic-related proteins p53/Bcl-2/Bax expression in NP-exposed mice; B-D, F, G. Quantitative analysis of protein expression; E. Effects of LYC on apoptotic-related proteins Akt/p-Akt expression in NP-exposed mice圖5 番茄紅素干預對NP染毒小鼠脾Akt/p53/Bcl-2通路相關蛋白表達的影響Fig.5 Effects of lycopene on expression of related protein in Akt/p53/Bcl-2 signaling pathway in spleen of NP exposed mice

3 討 論

NP是一種典型的內分泌干擾物，具有抗雄激素和雌激素樣作用[7]。關于NP毒性的研究主要集中在生殖毒性方面[10-11]，但有研究表明，NP還可以引起氧化應激，并在多器官中產生具有高度活性的膜毒性中間產物[5-6]。番茄紅素是一種天然類胡蘿卜素抗氧化劑，是β-胡蘿卜素的異構體，其在細胞培養和動物模型中清除自由基的能力已被證實[15]。因此，番茄紅素能夠降低氧化應激介導的多種疾病風險[16]，而且有研究證實，番茄紅素可以保護黃曲霉毒素誘導的小鼠脾損傷[14]。盡管NP在環境中分布廣泛，對人和動物的健康危害極大，但LYC對NP毒性保護作用的具體機制尚未闡明。本研究旨在探討NP對脾損傷和氧化應激的影響，以及應用LYC能否逆轉NP誘導的小鼠脾組織氧化應激和組織病理學改變及其變化機制。

本研究通過HE染色方法檢測了脾組織病理學變化，結果顯示，NP亞慢性中毒后小鼠脾出現病理學損傷，而經過番茄紅素干預的小鼠脾組織病理學變化輕微，這一結果與小鼠日增重和脾體系數變化結果相關聯且保持一致，說明番茄紅素干預對NP導致的小鼠脾損傷具有保護作用。雖然對NP亞慢性暴露后小鼠日增重和脾體系數變化的檢測屬于非功能性評估，但日增重和脾體系數變化可以直觀體現出外源性毒物的毒性作用[17]。脾體系數變化結果顯示，NP亞慢性染毒小鼠相對于對照小鼠和LYC干預小鼠均有顯著性降低，說明亞慢性中毒劑量的NP對小鼠產生毒性效應，而LYC可以對亞慢性中毒劑量NP暴露的小鼠產生保護作用。脾是機體最大的免疫調節器官，有研究表明NP能夠導致鯉魚脾組織損傷[18]。本研究中，脾組織HE染色結果表明，NP亞慢性中毒導致小鼠脾小結中可見生發中心擴張，伴有大量淋巴細胞凋亡，核碎裂，紅髓中可見較大量的髓外造血細胞，損傷嚴重。而經過LYC干預處理的小鼠在NP亞慢性暴露后，脾邊緣帶增厚伴有多核巨細胞數量少量增多，損傷輕微。這一結果與小鼠體重增長率和脾體系數變化保持一致，兩組數據相互佐證說明LYC預處理可以保護小鼠抵抗NP亞慢性毒性效應。

細胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α與機體免疫狀態密切相關。脾是機體內最重要的免疫器官，是淋巴細胞產生、成熟和存儲的場所，具有清除衰老紅細胞和參與免疫反應等功能。脾中T細胞數量多少和活性可反映出細胞的免疫狀態，根據細胞表面蛋白表達情況，脾中T淋巴細胞可分為CD3+、CD4+和CD8+[19]。CD4+和CD8+T細胞可分泌細胞因子IFN-γ和TNF-α，促進淋巴細胞的增殖和分化，破壞胞內病原入侵，調節細胞免疫應答[20-21]。因此T淋巴細胞亞群和細胞因子水平被認為是細胞免疫的標志。本研究發現，小鼠經過NP灌胃后血清細胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α濃度顯著降低，提示CD4+和CD8+T細胞的活化和增殖受到了抑制。CD4+和CD8+T細胞是介導機體細胞免疫的主要細胞，所以提示小鼠NP亞慢性中毒后機體的細胞免疫功能受到抑制。本研究中LYC預處理可在一定程度上減輕NP誘導的小鼠血清IFN-γ濃度降低，提示LYC能夠有效減輕NP對小鼠脾免疫功能的抑制作用。此外單獨應用LYC可不同程度提升小鼠血清中免疫細胞因子的水平，表明LYC具有較強的免疫增強活性。

MDA是氧化應激引起脂質過氧化的生化標志物[22]，是指示機體氧化平衡狀態的最常用指標。本研究顯示，NP亞慢性中毒劑量暴露的小鼠脾組織MDA顯著升高，說明小鼠在給予NP亞慢性中毒劑量后，體內的氧化與抗氧化平衡狀態已經被破壞。NP是親脂性化合物，因此細胞可能是脂質過氧化的靶點。研究發現，NP暴露可對機體產生毒性，增加氧自由基和脂質過氧化，抑制抗氧化酶活性，氧自由基的增加導致細胞發生膜脂過氧化，導致細胞損傷或死亡，并損害其周圍組織的細胞結構和功能[23]。經LYC預處理小鼠給予NP亞慢性中毒劑量后，脾MDA水平比NPG小鼠顯著降低，說明LYC可以糾正機體氧化與抗氧化的失衡。試驗中，LNG小鼠MDA水平降低的同時，脾總抗氧化能力(T-AOC)和抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-Px)活性增強，說明抗氧化作用是LYC抵抗NP毒性作用機制之一。此外，LYC分子結構中含有開鏈多烯或富電子芳香環結構，使得LYC能有效地清除超氧陰離子自由基，具備極強的抗氧化能力[24-25]。因此，LYC對NP毒性的保護作用可能與其直接清除自由基和增強抗氧化系統的抗氧化能力有關。

生理狀態下的細胞凋亡是細胞程序性死亡，這一過程在控制細胞數量和維持細胞增殖活動中起著重要作用[26]。p53通路是經典的內源性細胞凋亡通路，p53蛋白是凋亡通路中關鍵蛋白，可以調節下游分子抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表達。Bcl-2可以阻止細胞色素C從線粒體中釋放，從而阻止半胱氨酸蛋白酶活化和啟動細胞凋亡[27]，Bax是一種促凋亡蛋白，在正常情況下以單體形式存在于細胞質中，松散地附著在線粒體外膜上，受到刺激后，Bax進入線粒體中促進細胞色素C從線粒體中釋放，加速細胞凋亡[28]。因此Bcl-2和Bax平衡狀態的破壞可以促進凋亡。除了p53通路蛋白外，Akt信號蛋白在細胞凋亡過程中也發揮關鍵作用，磷酸化的Akt可以抑制p53的表達[29]，此結果與本研究相吻合。本研究發現，NP暴露后磷酸化水平降低，而凋亡通路中關鍵分子p53蛋白的表達水平升高，說明NP可能抑制Akt的活化，上調p53蛋白表達水平，從促進脾細胞凋亡發揮毒性效應。在給予LYC處理后，檢測凋亡通路蛋白表達水平發現，與NPG小鼠相比，LNG小鼠的p53和Bax蛋白表達下調，而Bcl-2蛋白表達水平和Akt磷酸化水平上調，說明LYC可能通過激活Akt磷酸化，抑制p53/Bcl-2信號通路調節脾細胞的過度凋亡發揮保護作用。

4 結 論

LYC對NP誘導的小鼠脾損傷具有保護作用，這與LYC增強脾抗氧化能力，抑制脾細胞凋亡有關。