種蛋孵化死胚及孵化廳環境樣本中銅綠假單胞菌的分離鑒定及其耐藥性分析

余 蘊，向 勇，李慶缽，劉 鵬，黎麗珍，廖 明，曹偉勝, 3, 4, 5, 6*

(1. 華南農業大學獸醫學院，廣州 510642；2. 嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室，廣州 510642；3. 農業農村部人獸共患病重點實驗室，廣州 510642；4. 廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣州 510642；5. 人獸共患病防控制劑國家地方聯合工程實驗室，廣州 510642；6. 農業農村部獸用疫苗創制重點實驗室，廣州 510642)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是一種分布廣泛的人獸共患條件致病菌，可以在人、動物、環境中循環傳播[1-2]，嚴重影響著人類健康和畜禽養殖生產。研究人員對PA耐藥性的關注度從未降低，它是醫院臨床高度關注并愈發棘手的問題，作為對抗PA最后一道有效防線的亞胺培南和美羅培南等碳青霉烯類抗菌藥也逐漸失去其作用[3-4]。近年來，有研究發現雞及其養殖環境當中的PA中一些重要耐藥基因的檢出率逐漸升高，如金屬β內酰胺酶(metallo-β-lactamases，MBLs)的相關耐藥基因MBLVIM-2和MBLSPM-1等[5-6]。張艷等[7]對從醫院分離到的100株PA進行耐藥性分析，數據顯示，亞胺培南耐藥基因oprD2的檢出率為93.0%，顯著高于其他耐藥基因的檢出率，提示PA的耐藥性日漸嚴重，極大的危害臨床抗感染治療，在全球范圍內均構成極大的威脅[8-10]。但目前對種禽場孵化廳中PA的感染情況和耐藥性的相關報道仍然較少。因此，本研究旨在對廣東省種禽場孵化廳中PA的流行情況進行調查，為預防和控制該病原菌提供理論依據；其次，對分離到的PA進行抗菌藥物敏感性分析及耐藥基因的檢測，為種禽場的合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

LB瓊脂培養基、LB液體培養基、MH瓊脂培養基、MH培養基、銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸桿菌ATCC25922均為廣東環凱微生物科技有限公司產品。NAC瓊脂培養基、NAC液體培養基、無菌均質袋等均為青島海博生物技術有限公司產品。rTaqPCR Premix為上海翌圣生物科技有限公司產品；藥敏紙片為OXOID公司產品。SQ Tissue組織DNA提取試劑盒為OMEGA公司產品。

1.2 樣品采集

2018年3月—2019年1月，從廣東省5個不同規模化種禽場收集孵化廳內21日齡仍未出殼且外殼完好的種蛋孵化死胚共655份，以及孵化機灰塵、污垢等環境樣本共24份，總計樣本679份。環境樣本用滅菌棉拭子采集并放入裝有適量的滅菌NAC液體培養基的15 mL離心管中，從樣品采集到運送至實驗室不超過8 h。

1.3 PA的分離與鑒定

用75%酒精將死胚外殼充分消毒3次，無菌操作取出胚體并剪碎，尤其使胸腔、腹腔和卵黃囊充分暴露，隨后將整個胚體放入無菌均質袋。接著加入適量的無菌NAC液體培養基到裝有樣品的無菌均質袋中，37 ℃、120 r·min-1條件下選擇性增菌8 h， 增菌后移取1 mL增菌液轉種于10 mL新的無菌NAC液體培養基內，37 ℃、120 r·min-1進行二次選擇增菌12～16 h。接著用接種環蘸取菌液劃線接種于NAC瓊脂培養基，37 ℃培養18～24 h，挑取疑似PA的綠色單菌落，參考文獻[11-12]進行菌種16S rRNA基因和特異性基因oprI的PCR鑒定，并送至廣州擎科生物有限公司測序，引物序列見表1。

表1 PA的16S rRNA和oprI基因的PCR引物序列及產物片段大小

1.4 藥物敏感性試驗

根據世界衛生組織 (World health organziatio, WHO)推薦的 K-B 紙片擴散法和美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)推薦的操作規程，以銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸桿菌ATCC25922為藥敏試驗質控菌株，嚴格參照CLSI2019標準對試驗結果進行判定，測定所有PA分離株對22種抗菌藥物的敏感性。抗菌藥物：氨芐西林(ampicillin，AMP)、復方新諾明(complex sulfamethoxazole，SXT)、萘啶酸(naphthyridic acid，NA)、卡那霉素(kanamycin，K)、四環素(tetracycline，TE)、氯霉素(chloramphenicol，C)、哌拉西林(piperacillin，PRL)、頭孢噻肟(cefotaxime，CTX)、頭孢吡肟(cefepime，FEP)、頭孢他啶(ceftazidime，CAZ)、頭孢哌酮(cefoperazone，CFP)、亞胺培南(imipenem，IPM)美羅培南(meropenem，MEM)、氨曲南(aztreonam，ATM)、哌拉西林/他唑巴坦(piperacillin/tazobactam，TZP)、頭孢哌酮/舒巴坦(cefoperazone/sulbactam，SCF)、妥布霉素(tobramycin，TOB)、阿米卡星(amikacin，AK)、慶大霉素(gentamicin，CN)、環丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、左氧氟沙星(levofloxacin，LEV)和多黏菌素B(polymyxin B，PB)。

1.5 耐藥基因檢測

參照SQ Tissue組織DNA提取試劑盒(OMEGA)說明書提取PA總DNA。參考文獻[13-14]中的PCR引物及反應體系和條件對相應28個耐藥基因(TEM、SHV、CTX、VEB、VIM、IMP、SPM、GIM、oprD2、NDM、DHA、OXA-10、OXA-23、qnrA、qnrD、qnrS、aac(3)-I、aac(3)-II、aac(6′)-Ib、aac(6′)-II、ant(3″)-I、tetA、tetB、catB、cmlA、qacE△1-sul1、mcr-1和NDM-1)進行PCR檢測。PCR產物大于500 bp時反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min， 35個循環；72 ℃后延伸8 min。PCR產物小于500 bp時反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃后延伸8 min，退火溫度可根據引物合成的Tm值作適當調整。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，通過凝膠成像分析系統觀察并拍照保存。

2 結 果

2.1 PA的分離與鑒定

PA在NAC瓊脂培養基及LB瓊脂培養基上均呈現出圓形、光滑、濕潤的綠色菌落，并帶有特殊芳香氣味，生化分析結果顯示其均符合PA的生化特性(表2)。對分離到的疑似PA菌株的16S rRNA及oprI基因進行PCR擴增，結果顯示其擴增出大小約為470和214 bp左右的片段(圖1)，結合測序結果確認為PA。本研究分離鑒定出PA共77株(77/679，11.3%)，其中,2株來源于環境樣本中的孵化機污垢(2/24，8.3%)，75株來源于死胚(75/655，11.5%)(表3)。

表2 PA分離株的生化鑒定

M. DNA相對分子質量標準；1. PA分離株；2. 陽性對照；3. 陰性對照M. DNA marker; 1. PA isolates; 2. Positive control; 3. Negative control圖1 PA的16S rRNA和oprI基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product for 16S rRNA and oprI gene

2.2 抗菌藥物敏感性

藥物敏感性試驗結果顯示，除天然耐藥的AMP、K和NA之外，PA對TE、SXT、C的耐藥性較強，耐藥率分別為100%、100%、75.4%，其次為CTX(11.7%)、CIP(9.1%)、LEV(9.1%)、CN(7.9%)、TOB(7.8%)；另外，PA對PRL、CFP和AK也表現出了較低的耐藥率；未檢測到對FEP、CAZ、IPM、MEM、ATM、TZP、SCF和PB耐藥的PA菌株。除天然耐藥外，耐3類或3類以上抗菌藥的PA占比為74.1%(57/77)，表現出多重耐藥性，其中，耐3類抗菌藥的菌株數量最多，占62.3%(48/77)；耐4類抗菌藥的菌株占比為3.9%(3/77)；耐6類抗菌藥的菌株占比為7.8%(6//77)。耐藥譜分析顯示(表4)，所有分離菌株100%表現出耐4種及以上抗菌藥，最廣耐14種抗菌藥，其中6耐菌株最多。

2.3 耐藥基因檢測

77株PA的28種耐藥基因檢測結果顯示，18種耐藥基因檢測陽性(表5)，其中磺胺類的qacE△1-sul1檢出率最高，對應的耐藥表型是SXT；而碳青霉烯類耐藥基因oprD2的檢出率達到11.7%，對應的耐藥表型主要是IPM；質粒介導誘導產生氟喹諾酮類耐藥的qnr基因qnrA、qnrD和qnrS的檢出率均為9.1%；氨基糖苷類的aac(3)-II和ant(3″)-I耐藥基因檢出率最高；氯霉素類耐藥基因檢出率最高為cmlA(2.6%)；四環素類耐藥基因以tetA(3.9%)為主。磺胺類的耐藥基因qacE△1-sul1陽性率為13.73%，而5種常見的MBLs耐藥基因(VIM、IMP、SPM、GIM、NDM)及氨基糖苷類的aac(3)-I和mcr-1檢測結果均為陰性。

表3 種雞場中PA分離株的數量及分離率

表4 PA的耐藥譜及相應數量

表5 PA耐藥基因的檢出率

3 討 論

當前，PA是醫院內重要的條件致病菌，常引起免疫力低下或有外傷傷口患者的嚴重感染，而且是導致重癥病房患者死亡的罪魁禍首[15-16]。關于醫院及其環境中PA的流行情況有太多的文獻報道，相比之下，關于動物源PA的流行情況卻較少報道，缺乏該方面的流行病學數據。本研究共分離到77株PA，總體分離率為11.3%，其中,2株來源于環境樣本(2/24，8.3%)，75株來源于死胚(75/655，11.5%)；數據表明，不僅在死胚中發現有不同程度的PA感染，而且種禽場周圍環境中也有一定比例的PA污染。有研究表明，種禽場環境當中的PA是污染種蛋的一個重要因素，尤其是孵化箱內環境[17-19]。而在G場的死胚和環境樣本中均分離到了PA，因此作者推斷環境中的PA可能是導致種蛋感染的重要原因，即胚胎可能被孵化箱內的PA污染，并侵入蛋殼，致其死亡；另一方面，即便是在死胚和環境樣本中均分離到了PA，但也不能將雞胚死亡或孵化率較低的結果全部歸因于PA的感染，因為在個別養殖場的死胚中也分離到了沙門菌[20]；所以，孵化率受影響是多種因素共同作用的結果。但在F場中并未分離到PA，說明其飼養管理和生物安全措施實施得較好，推測這也是該場孵化率稍高于其他養殖場的原因。所以在家禽養殖過程中，不應該繼續忽視PA的存在，應當重視起來，需要加強飼養管理及生物安全措施，防止PA污染種蛋，避免損失。

本研究選取了常用的22種抗菌藥進行藥物敏感性試驗，其中,IPM、PRL、FEP、CAZ等都是醫院臨床治療PA感染性疾病的一線藥物[21-22]，但部分PA分離株也對其表現出了耐藥現象，即便其耐藥率較低，但也應當引起重視，特別是醫院臨床抗感染的一線藥物亞胺培南。而在所調查的11個養殖場中，均未使用上述抗菌藥，這也從側面反映出PA在群體遺傳進化過程中，其耐藥性越來越強，推測與全球范圍內醫院中多重耐藥PA菌株的暴發流行有關；反觀AMP、K、NA這3種抗菌藥，在養殖場中的使用率極高，但PA對其天然耐藥，因此不具備預防治療意義。而PA對SXT、TE、C三者的耐藥率也很高，因此養殖場需要更換其他抗菌藥使用。另外，耐藥譜分析顯示,最廣耐14種抗菌藥；其中多重耐藥PA占比高達為62.3%，這些數據表明禽源PA的耐藥情況同樣不容樂觀，且日漸嚴重。耐藥基因oprD2對應的耐藥表型是亞胺培南，且醫院內的PA分離株對IPM表現出較強的耐藥性[23-24]。而在本研究中，雖然未檢測到對IPM耐藥的菌株，但其oprD2基因的陽性率高達11.7%，推斷可能是因為oprD2耐藥基因沒有表達或表達量不夠，不足以引起對應的耐藥表型，同時也提示種禽場PA分離株對IPM的耐藥性轉移風險水平較高。雖然本研究中分離到的PA并未被檢測到MBLs耐藥基因，但仍然不能掉以輕心，畢竟已表現出對碳青霉烯類耐藥性轉移的風險，并且有必要進行動物源PA耐藥基因的監測。

PA目前的流行情況(尤其是醫院內的流行情況)已經十分嚴峻，而醫院中PA的流行在某種程度上對動物源PA的流行造成了一定的威脅，醫院內的PA傳播至ICU病人，病人將PA帶入到家庭環境，最終導致其寵物感染PA并發病，這都是有依據可言的。另一方面，由于PA強大的耐藥性和對環境的適應性，使其本身就具有較強的流行性。在面對動物源PA的逐漸流行時，應該趁早將其扼殺在搖籃里。

4 結 論

通過對5個不同種雞場中的種蛋孵化死胚和環境樣本進行銅綠假單胞菌的分離鑒定，發現其死胚中均存在不同程度的感染，且個別種雞場的死胚和環境樣本中均分離到了該菌。這些PA分離株具有多重耐藥性，提示種雞場一方面應做好生物安全措施，加強飼養管理，及時對種蛋、孵化機及其周邊環境進行清潔和消毒；另一方面應定期進行藥敏試驗，根據結果合理選擇并交替使用抗菌藥，如阿米卡星、哌拉西林、頭孢哌酮等可作為銅綠假單胞菌較好的預防或治療藥物。