葛根素緩解鎘對大鼠股骨脛骨中成骨細胞分化的抑制作用

張雪晴，仝錫帥, 3，王果帥，卞建春, 3，劉學忠，袁 燕，鄒 輝，沈小蘭，劉宗平, 3*，顧建紅*

(1.揚州大學獸醫學院，揚州225009； 2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009；3.揚州大學農業科技發展研究院(國際聯合實驗室)，揚州225009； 4.興化市合陳畜牧獸醫站，泰州 225733)

鎘(cadmium，Cd)是一種廣泛存在于自然界的重金屬，可通過消化、呼吸、皮膚等循環系統進入動物機體，半衰期長達20～30年[1]。動物攝入超過一定劑量的鎘，可導致腎、肝、肺、骨骼和生殖器官損傷，并對免疫系統、心血管系統等產生毒性效應，進而引起多種疾病[2]。骨是鎘毒性作用的靶器官之一，骨組織中的成骨細胞(osteoblast,OB)是確保骨組織Ca沉積與骨形成的關鍵細胞，而任何形式的OB損傷都可造成骨代謝穩態失衡，進而引起骨質疏松癥等疾病。

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向OB分化的過程中，存在一系列縝密的基因調控網絡。其中，RUNX2(runt related transcription factor 2，RUNX2)屬于Runt相關轉錄因子家族，不僅可以誘導BMSCs向OB分化，還可通過屏蔽與不同細胞系相關的基因區域來抑制非OB的分化；骨鈣素(osteocalcin，OCN)作為OB成熟的標志，其基因啟動子區的OB特異性順式調控元件與RUNX2結合；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)在OB和OB前體細胞(osteoblast precursor cells，OBP)中均有表達；轉錄因子osterix(OSX)是高度保守的鋅指結構域，與骨組織發育密切相關，是OB分化的重要調節因子，和RUNX2依次作用于BMSCs[3]。研究發現，鎘在一定程度上能夠促進破骨細胞前體細胞(osteoclast precursor cells，OCP)向破骨細胞(osteoclast，OC)的分化，并對BMSCs向OB的分化具有抑制作用[4-6]。

葛根素(puerarin，Pur)是從中草藥葛根中分離的異黃酮類衍生物，主要存在于豆科植物野葛或甘葛藤的根部，具有保護骨骼的作用，其治療骨質疏松癥的療效已被報道[7]。葛根素具有促進OB增殖,提高OB活性的作用[8]。Wnt/β-catenin通路對OB分化和骨形成有重要作用，鎘可通過抑制Wnt/β-catenin通路導致OB分化受損，而葛根素可通過Wnt/β-catenin通路降低骨流失[5,9-10]。葛根素對鎘所致成骨發育的影響尚未闡明。因此，本研究旨在通過體內試驗，研究鎘暴露對大鼠股骨脛骨OB分化的抑制作用和葛根素對其的緩解效應及機制，為臨床上葛根素防治鎘暴露所致的骨組織成骨發育損傷提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級21日齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，購自江蘇大學比較醫學中心。

1.2 主要試劑

葛根素(Sigma，USA)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，中國)；蛋白酶抑制劑(蘇州新賽美生物科技有限公司，中國)；Wnt3A、LEF1、TCF1鼠源單抗(Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.，USA)；β-actin、β-catenin鼠源單抗(Cell signaling technology，Lnc，USA)；羊抗鼠-HRP偶聯抗體(Jackson ImmunoResearch Ltd.，USA)；反轉錄試劑及熒光定量試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，中國)；醋酸鎘(cadmium acetate，CdAc2)及其他試劑均為國產分析純。

1.3 主要儀器

組織研磨機SN:1001682(天根生化科技有限公司，中國)；NanoDrop2000(Thermo Fisher，USA)；Milli-Q Biocel型超純水系統(Merck Millipore，USA)；電子天平；ABI7500 qRT-PCR儀(ABI，USA)；PROTEAH電泳儀(BIO-RAD，USA)；Tanon-5200全自動化學發光成像分析系統(上海天能科技有限公司，中國)；5810R高速冷凍離心機(Eppendorf，Germany)；PinAAcle 900F火焰原子吸收光譜(PerkinElmer，美國)。

1.4 鎘注射濃度及葛根素飼喂量的篩選

1.4.1 篩選鎘注射濃度 選用不同濃度CdAc2(1.25、2.5、5、10及15 mg·kg-1BW)進行預試驗。每日腹腔注射，連續注射1周，選擇不良反應較輕的劑量進行后續試驗。

1.4.2 篩選葛根素飼喂量 葛根素的飼喂量參考張年寶等[11]研究中的注射劑量，根據大鼠體重進行換算，在當前研究中以每千克體重200 mg進行計算，并作為本研究中葛根素的飼喂量。

1.5 實驗動物分組與染毒

將大鼠籠養于清潔與安靜的實驗動物飼養室，飼養溫度(22±1)℃。自由飲食1 周后隨機分為4組，每組10只，分別為對照組(CON)、鎘(Cd)組、葛根素(Pur)組及鎘+葛根素(Cd+Pur)組。葛根素組、鎘+葛根素組大鼠每日灌服葛根素(200 mg·kg-1BW)，對照組、鎘組大鼠每日灌服相同劑量的純凈水，連續處理5周。從第5周開始，對照組與葛根素組大鼠每日腹腔注射生理鹽水，鎘組、鎘+葛根素組大鼠每天腹腔注射醋酸鎘(2.5 mg·kg-1BW)，連續處理1周。飼喂5周后，對所有大鼠禁食禁水6 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液1 mL，麻醉后頸椎脫臼法處死大鼠，分離股骨與脛骨。

1.6 原子吸收光譜法測定大鼠骨骼鎘、鈣、磷含量

取各組大鼠骨骼樣品500 mg(濕重)，60 ℃烘干過夜，微波消解法對樣品進行消解[12]，用超純水定容至5 mL，按照標準參照物質(SRM、1598及NIST)，使用火焰原子吸收光譜測定骨組織中鎘、Ca及P含量。

1.7 免疫印跡法檢測大鼠股骨脛骨中相關蛋白含量

1.7.1 大鼠股骨脛骨總蛋白制備 取各組大鼠股骨脛骨500 mg，液氮研磨至小塊狀后用組織研磨機、RIPA裂解蛋白法制備總蛋白樣品。股骨脛骨呈粉末狀后加入RIPA裂解液冰上裂解30 min(RIPA中添加蛋白酶抑制劑，終濃度為1 mmol·L-1)。4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，BCA法測定總蛋白濃度，將各組蛋白樣品濃度調為一致，添加5×SDS Loading Buffer，混勻，煮沸10 min，-20 ℃保存。

1.7.2 Western blot檢測相關蛋白表達量 將蛋白樣品加入凝膠泳道110V恒壓電泳90 min。使用250 mA恒流，濕轉法轉PVDF膜90 min。將膜轉移至5%脫脂乳溶液(TBST溶液稀釋)，室溫封閉2 h。按照蛋白大小剪條帶，分別加入β-catenin抗體、Wnt3A抗體、LEF1抗體、TCF1抗體、GAPDH抗體于搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，再加入相應二抗室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，每次10 min。利用ECL化學發光試劑顯影于Tanon-5200全自動化學發光成像分析系統。Image J軟件分析相關條帶灰度值。

1.8 qRT-PCR檢測大鼠成骨相關基因表達量

1.8.1 引物設計 根據NCBI查詢到的基因全序列，用Blast設計引物，序列如表1，GAPDH為內參。

表1 目的基因引物序列

1.8.2 qRT-PCR檢測相關基因表達 取各組大鼠股骨脛骨500 mg，用組織研磨機結合TRIzol法提取RNA樣品。每組樣品加入1 mL TRIzol，靜置5 min后加入0.2 mL三氯甲烷，劇烈震蕩15 s，室溫靜置5 min；4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，將上層無色水相轉移至含有0.5 mL異丙醇的1.5 mL EP管，混勻，室溫靜置10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min；各管底出現的白色沉淀即RNA，棄去上清并加入1 mL 75%乙醇輕輕搖晃，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min；棄去上清，晾干至RNA透明，加無酶水溶解，根據Prime ScriptTMRT Reagent Kits試劑盒說明進行反轉錄，SYBR premix EX TapTMKits試劑盒通過ABI 7500實時熒光定量PCR儀進行qRT-PCR反應，采用2-△△CT法計算基因相對表達量。

1.9 數據與分析

應用SPSS 21.0軟件對數據進行顯著性t-檢驗和單因素方差(one-way ANOVA)分析，結果以“平均值(Mean)±標準差(SD)”表示，*P<0.05表示差異顯著，**P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 鎘濃度篩選

各濃度醋酸鎘(CdAc2)腹腔注射大鼠結果顯示，1.25 mg·kg-1BW組無明顯不良反應，2.5 mg·kg-1BW組大鼠精神沉郁、飲食欲下降，個別大鼠出現腹瀉癥狀，5 mg·kg-1BW組精神沉郁且飲食欲下降，被毛粗亂，不良癥狀較2.5 mg·kg-1BW組嚴重，10 mg·kg-1BW組飲食欲下降且所有大鼠于第3日死亡，15 mg·kg-1BW組所有大鼠于第2日死亡。選擇輕微不良反應組(2.5 mg·kg-1BW)進行后續試驗。

2.2 鎘暴露及葛根素處理對大鼠股骨脛骨中鎘含量的影響

由大鼠股骨脛骨鎘含量檢測結果顯示(圖1)，對照組與葛根素組鎘含量較低，兩組間無明顯差異。與對照組相比，鎘組股骨脛骨中鎘含量極顯著升高(P<0.01)；與鎘組相比，鎘+葛根素組中鎘含量極顯著降低(P<0.01)。

2.3 鎘暴露及葛根素處理對大鼠股骨脛骨中Ca和P含量的影響

大鼠股骨脛骨中Ca和P含量檢測結果顯示(圖2)，各組大鼠股骨脛骨中Ca和P含量無顯著性差異(P>0.05)。

*差異顯著(P<0.05);**差異極顯著(P<0.01)；ns表示無顯著差異，下同* Indicate significant difference (P<0.05);** Indicate extremely significant difference (P<0.01); ns indicate no significant difference, the same as below圖1 SD大鼠股骨脛骨中鎘含量Fig.1 Content of cadmium in femur and tibia of SD rats

圖2 鎘與葛根素對SD大鼠股骨脛骨中Ca和P含量的影響Fig.2 Effects of Cadmium and puerarin on Ca and P content in femur and tibia of SD rat

2.4 鎘暴露及葛根素處理對大鼠股骨脛骨中成骨相關基因的影響

qRT-PCR檢測大鼠股骨脛骨中成骨相關基因RUNX2、ALP、OCN和OSX的mRNA水平。結果如圖3，與對照組相比，鎘組大鼠股骨脛骨中RUNX2、OCN、OSXmRNA轉錄水平極顯著降低(P<0.01)，ALPmRNA轉錄水平顯著降低(P<0.05)；葛根素組大鼠股骨脛骨中RUNX2、ALP、OCNmRNA轉錄水平極顯著升高(P<0.01)，OSXmRNA表達水平無顯著差異(P>0.05)。與鎘組相比，鎘+葛根素組大鼠股骨脛骨中RUNX2、OCN、OSX和ALPmRNA轉錄水平均極顯著升高(P<0.01)。

2.5 鎘暴露及葛根素處理對大鼠股骨脛骨中Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達的影響

蛋白免疫印跡結果顯示(圖4)，與對照組相比，鎘組大鼠股骨脛骨中Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達水平極顯著降低(P<0.01)；葛根素組大鼠股骨脛骨中Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達水平極顯著升高(P<0.01)。與鎘組相比，鎘+葛根素組大鼠股骨脛骨中Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達水平均極顯著升高(P<0.01)。

圖3 鎘與葛根素對SD大鼠股骨脛骨中成骨相關基因轉錄的影響Fig.3 Effects of cadmium and puerarin on the transcription of osteogenic-related genes in femur and tibia of SD rat

圖4 鎘與葛根素對SD大鼠股骨脛骨中Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達的影響Fig.4 Effects of cadmium and puerarin on the expression of Wnt/β-catenin pathway related proteins in femur and tibia of SD rats

3 討 論

鎘是廣泛存在于環境中的有毒重金屬，可對腎產生損傷作用，致腎小管對Ca和(或)P重吸收障礙，血清中Ca和(或)P缺乏，繼而動員骨中Ca和(或)P進入血液，造成骨丟失及骨質疏松[13-15]。張翔[16]研究發現，低劑量鎘暴露20周，可導致骨中的Ca和(或)P沉積下調。本研究顯示，與對照組相比，鎘組大鼠股骨脛骨Ca和P沉積減少，但無顯著性差異，這可能與鎘作用時間較短有關。

研究發現，鎘可以促進人BMSCs向成脂細胞分化，抑制其向OB分化，間接造成骨密度下降，導致骨質疏松癥等疾病[17]。骨代謝平衡是OC行使的骨吸收和OB行使的骨重建共同維持[18]，其中，OB具有形成骨骼、調節細胞外骨基質成分的構成和使Ca及P沉積的功能。OB起源于BMSCs，在轉錄因子RUNX2和OSX的調控下向成骨祖細胞定向分化，最終分化為骨細胞[3]。RUNX2是促進骨形成的關鍵調控因子，為OB分化的早期標志物，并在骨形成中起關鍵作用[19]。ALP是BMSCs向OB分化的早期標志物，可分解磷酸酯維持礦化所需的無機磷酸鹽，其活性水平可以反映OB分化的程度[20-21]。OCN參與胚胎骨形成，并在骨重建過程中被激活，是OB成熟的重要標志[22]。此外，OSX是RUNX2調控OB分化過程中的下游靶點，可激活COL1A1(collagen type I alpha 1 chain，COL1A1)和OCN的轉錄，實現骨形成[23]。骨質疏松癥主要是由BMSCs向OB分化失調所致。本研究結果顯示，與對照組相比，鎘組大鼠OB相關基因RUNX2及OCN的表達極顯著降低，與Ma等[6]研究結果一致；OSX表達極顯著降低，ALP顯著降低，與Wu等[5]結果一致。此外，王怡等[24]研究發現，低濃度鎘對體外OB有一定的毒性作用。Al-Ghafari等[25]研究發現，鎘可直接作用于人OB，主要通過降低ATP含量，抑制線粒體活性和有氧呼吸來破壞細胞生物功能。這些研究表明，鎘可對體內外OB的分化及骨礦化產生一定的抑制作用。

葛根素是一種從野葛的根中提取的植物激素，其化學結構和雌激素類似，具有一定的抗骨質疏松作用。為防止雌性大鼠體內不同水平雌激素的干擾，本研究選用了雄性SD大鼠。研究發現，葛根素具有促進OB分化的作用，可通過ERK1/2和p38-MAPK通路促進BMSCs向OB的分化[26]。葛根素和鋅可抑制骨髓基質細胞成脂分化，間接促進其向OB分化，從而發揮抗骨質疏松作用[27]。此外，葛根素亦可與雌二醇協同作用，增加骨質疏松性骨折大鼠的骨密度[28]。本試驗中，與對照組相比，葛根素組大鼠OB相關基因(RUNX2、OCN和ALP)的表達極顯著升高；與鎘組相比，鎘+葛根素組骨中鎘含量顯著下降，且成骨相關基因(RUNX2、OCN、OSX與ALP)表達極顯著升高，表明葛根素可促進OB分化，并減輕鎘在股骨脛骨中的沉積。

另外，研究表明，Wnt/β-catenin信號通路可參與骨骼的生長，調控成骨祖細胞向OB分化[19,29-30]。Wnt家族由許多高度保守的基因組成，其中Wnt3A可與卷曲蛋白結合后激活Wnt/β-catenin信號通路，在脊椎動物中，β-catenin可發揮核轉錄激活因子作用，在胞質內聚集發生核位移后，與TCF1和LEF1互作并介導Wnt信號傳導及其下游基因轉錄[31-32]。在臨床應用研究方面，葛根素可通過Wnt/β-catenin信號通路減輕來曲唑(一種非甾體芳香化酶抑制劑)引起的大鼠骨流失[10]，葛根素可通過Wnt/β-catenin信號通路抑制人BMSCs成脂分化[33]。本研究中，與對照組相比，鎘組大鼠股骨脛骨中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白(β-catenin、LEF1、TCF1與 Wnt3A)的表達均極顯著下調，與Wu等[5]報道一致。且本研究中葛根素組大鼠股骨脛骨中Wnt/β-catenin信號通路蛋白的表達極顯著升高；與鎘組相比，鎘+葛根素組可使大鼠股骨脛骨中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達均極顯著上調，說明葛根素通過Wnt/β-catenin通路緩解鎘暴露對大鼠股骨脛骨中OB分化的抑制作用。

4 結 論

綜上所述，鎘暴露可增加大鼠股骨脛骨中的鎘沉積，并對OB分化造成一定的損傷，該過程涉及Wnt/β-catenin信號通路。此外，葛根素對鎘抑制大鼠股骨脛骨中OB分化具有一定的緩解效應。