FliC蛋白R91S突變對腸炎沙門菌鞭毛形態和小鼠體內定植的影響

王 俊，李 軍，崔國林

(1. 嘉興職業技術學院，嘉興 314036；2. 河北工程大學 生命科學與食品工程學院，邯鄲 056038)

鞭毛是沙門菌重要的運動器官，幫助其在液體環境中改變運動狀態和運動方向[1]。正常情況下，當細菌所處周圍環境的pH、溫度、鹽離子濃度等條件發生變化時，細菌細胞膜受體蛋白感應刺激，信號蛋白磷酸化結合至C環結構蛋白FliM、FliN等，引起C環構象改變，質子流向鞭毛馬達，向其施加扭轉力導致細菌鞭毛形態改變從而切換運動狀態，這一過程是由鞭毛形態控制細菌的運動狀態[2-4]。

沙門菌鞭毛蛋白FliC由末端的保守區域D0、D1和中間的高變區域D2、D3構成[5]。D0和D1區域參與TLR5識別和鞭毛絲結構組成，D2和D3區域參與體液免疫應答[6]。FliC蛋白的氨基酸序列與鞭毛形態和細菌運動性之間存在相關關系。Kanto等[7]發現部分鼠傷寒沙門菌菌株FliC蛋白的單個或兩個氨基酸突變導致鞭毛產生多種形態，氨基酸序列分析表明，突變位點均位于N端和C端的α螺旋結構。Smith等[8]通過比對鼠傷寒沙門菌與大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌、枯草芽胞桿菌、單核細胞增生李斯特菌等fliC基因的TLR5識別區域，將其中高度保守的氨基酸依次置換成丙氨酸后發現部分位點替換后僅能降低TLR5識別，而部分位點替換能夠導致細菌運動性的完全喪失。由此可見，鞭毛蛋白氨基酸序列與鞭毛運動性密切相關。Hayashi等[9]分離4株突變株，鞭毛形態由鈍直轉變為超螺旋，涉及7個新鑒定的氨基酸突變位點均位于D1區域。Wang等[10]鑒定鼠傷寒沙門菌FliC蛋白D108A、N133A和D152A突變導致鞭毛蛋白亞基之間的氫鍵作用力破壞從而改變鞭毛形態和細菌運動性。目前關于腸炎沙門菌的FliC蛋白氨基酸位點與鞭毛形態及細菌運動性之間相關性尚不明確。

本研究通過比對分析D群的腸炎沙門菌、雞傷寒沙門菌和雞白痢沙門菌的FliC蛋白氨基酸序列發現存在第91位、第339位、第431位3個氨基酸位點差異，進一步序列比對結果揭示，僅雞白痢沙門菌第91位點為絲氨酸，腸炎沙門菌、雞傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌等23個血清型均為精氨酸。運動性試驗、鞭毛形態結構觀察、細胞感染試驗和動物感染試驗揭示了腸炎沙門菌第91位精氨酸是維持鞭毛形態結構和運動性的關鍵氨基酸，第91位精氨酸突變為絲氨酸能夠減弱腸炎沙門菌黏附入侵細胞和小鼠體內定植能力。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和細胞

腸炎沙門菌CICC10467購自中國工業微生物菌種保藏中心，雞白痢沙門菌ATCC13036購自美國菌株保藏中心(ATCC)。pKD3質粒、pKD46質粒和pCP20質粒由中國農業大學動物醫學院吳文學研究員惠贈；pBR322質粒由中國農業大學動物醫學院吳清民教授惠贈。RAW264.7和HCT116細胞購自國家實驗細胞資源共享服務平臺。

1.2 實驗動物

7日齡SPF雛雞購自勃林格殷格翰維通生物技術(北京)有限公司，6～8周雌性BALB/c小鼠購自斯貝福(北京)有限公司。

1.3 fliC基因序列比對

從GenBank數據庫下載腸炎沙門菌部分菌株基因組序列、雞白痢和雞傷寒沙門菌全部菌株基因組序列，截取fliC基因序列進行氨基酸序列比對。

1.4 腸炎沙門菌fliC基因突變株及回補株構建

參考Yang等[11]構建沙門菌基因缺失株和回補株方法，運用λ-Red同源重組方法刪除腸炎沙門菌CICC10467fliC基因，以pBR322質粒為骨架構建反式回補株，分別命名為腸炎沙門菌fliC基因回補株(ΔfliC::S. EnteritidisfliC)和7個以腸炎沙門菌FliC蛋白為骨架僅置換雞白痢沙門菌FliC蛋白差異位點的回補株，包括第91位突變回補株(ΔfliC::R91S)、第339位突變回補株(ΔfliC::Q339K)、第431位突變回補株(ΔfliC::A431T)、第91和第339位雙突變回補株(ΔfliC::R91S/Q339K)、第91和第431位雙突變回補株(ΔfliC::R91S/A431T)、第339和第431位雙突變回補株(ΔfliC::Q339K/A431T)和第91位、第339位及第431位突變回補株(ΔfliC::R91S/Q339K/A431T)。

1.5 腸炎沙門菌野生株、缺失株和回補株的生長特性分析

分別將野生株和回補株的過夜培養物濃度調整至OD600 nm約為1.0，以1∶100接種至25 mL新鮮TSB培養基中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養，每2 h測定培養物OD600 nm值。

1.6 運動性試驗

將過夜培養菌液濃度調整至OD600 nm=1.0，移液器吸取2 μL滴加至LB肉湯(0.3%瓊脂)，37 ℃培養6 h，測量細菌運動圈直徑并拍照。

1.7 透射電鏡觀察

向過夜培養的平板中加入3 mL無菌水放置5 min，將銅網置于無菌水液面上靜置5 min，取出銅網置于干凈濾紙上吸取多余水分，放置于100 μL 2%磷鎢酸中負染5 min，迅速用濾紙吸去磷鎢酸，透射顯微鏡觀察。

1.8 細胞黏附和入侵試驗

1.8.1 細胞準備 將RAW 264.7細胞以4×105個·孔-1接種至24孔板，37 ℃、5% CO2培養過夜使細胞密度達到80%。PBS洗滌過夜培養的細菌培養物1次，預熱的RMPI-1640基礎培養液稀釋菌液濃度至3×107CFU·mL-1，然后進行黏附和入侵試驗。

1.8.2 細胞黏附試驗 1 μg·mL-1Cytochalasin D 37 ℃預處理細胞1 h，無菌PBS徹底洗去Cytochalasin D。以MOI=10感染細胞，37 ℃繼續孵育60 min。冰水裂解細胞10 min，收取裂解液進行梯度稀釋，取100 μL涂布于TSA平板，37 ℃培養18 h后計數。將HCT116細胞以5×105個·孔-1接種至24孔板，37 ℃、5% CO2條件培養過夜使細胞密度達到90%。將細胞置于4 ℃預處理30 min。PBS洗滌過夜培養的細菌培養物1次，預熱的RMPI-1640基礎培養液稀釋菌液濃度至4.5×107CFU·mL-1。以MOI=10感染細胞，4 ℃條件孵育30 min。PBS洗滌細胞3次。冰水裂解細胞10 min，將細胞裂解液梯度稀釋，取100 μL涂布于TSB平板，37 ℃培養16 h后計數。

1.8.3 細胞入侵試驗 以MOI=10感染細胞，37 ℃、5% CO2條件孵育50 min。PBS洗滌細胞3次。加入含100 μg·mL-1慶大霉素的RMPI-1640培養液繼續培養2 h，冰水裂解細胞，對裂解細胞液進行梯度稀釋，取100 μL涂布于TSB平板，37 ℃培養16 h后計數。HCT116細胞感染過程同RAW264.7細胞[12]。

1.9 間接免疫熒光試驗

將RAW264.7細胞以4×105個·孔-1接種至24孔板，37 ℃、5% CO2條件培養過夜使細胞密度達到90%。將細胞置于4 ℃預處理30 min。PBS洗滌過夜培養的細菌培養物1次，預熱的RMPI-1640基礎培養液稀釋菌液濃度至4.5×107CFU·mL-1。以MOI=10感染細胞，4 ℃孵育30 min。PBS洗滌細胞3次。固定液室溫固定細胞20 min；PBS溫和洗滌3次；將鴨源抗腸炎沙門菌陽性血清1∶200稀釋，室溫孵育1 h后，PBS溫和洗滌3次；將FITC標記山羊抗鴨二抗1∶100稀釋，室溫孵育1 h；PBS溫和洗滌3次；DAPI孵育10 min后PBS溫和洗滌3次；熒光顯微鏡觀察。

1.10 動物感染試驗

菌株準備步驟同“1.8”。75只6～8周齡雌性BALB/c小鼠隨機分成5組，A組(WT)、B組(ΔfliC)、C組(ΔfliC::S. EnteritidisfliC)、D組(ΔfliC::R91S)為試驗組，E組為空白對照組，每組15只。試驗組小鼠每只腹腔注射1×105CFU沙門菌，對照組注射無菌PBS，分別在感染后的6、24、48 h每組處死5只，取肝和脾，制成20%組織懸液，梯度稀釋后涂布至XLD瓊脂平板，37 ℃培養18 ～24 h后計數。

1.11 數據統計與分析

氨基酸序列比對分析使用DNASTAR Lasergene 軟件包Megalign 7.0軟件，同源建模使用在線軟件SWISS-model，遺傳進化分析使用MEGA 7.0軟件，其他數據分析使用GraphPad Prism 7.0軟件。差異顯著性檢驗采用One-way ANOVA和Two-way ANOVA，ns.P≥0.05; *.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001; ****.P<0.000 1。

2 結 果

2.1 FliC第91位氨基酸差異在腸炎和雞白痢沙門菌血清型間高度保守

比對分析GenBank數據庫中存在的腸炎、雞白痢和雞傷寒沙門菌FliC蛋白氨基酸序列，結果表明腸炎和雞傷寒沙門菌的序列完全一致，腸炎和雞白痢沙門菌存在兩種差異位點類型，分別命名為雞白痢沙門菌Type Ⅰ型和Type Ⅱ型，氨基酸位點差異分別是位于ND1區域的第91位、D3區域的第339位和CD2區域的第431位(表1)。進一步比對部分鞭毛型不同的沙門菌血清型FliC蛋白的氨基酸序列發現第91位精氨酸在腸炎沙門菌、雞傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌等23個血清型間高度保守，僅雞白痢沙門菌為絲氨酸(表2)。

表1 D群3個沙門菌血清型FliC蛋白氨基酸序列比對

表2 部分沙門菌血清型FliC蛋白氨基酸序列比對

(轉下頁 Carried forward)

2.2 腸炎沙門菌fliC基因缺失株和突變回補株構建

PCR擴增結果表明，運用同源重組技術成功刪除腸炎沙門菌CICC10467fliC基因，通過pBR322質粒成功構建8個反式回補株，Western blot分析表明，各回補株的FliC蛋白表達量與野生株基本一致，fliC基因缺失株不表達FliC蛋白(圖1A)。體外生長試驗結果顯示，野生株、fliC基因缺失株和各突變回補株在TSB培養基中生長速度無顯著差異(P≥0.05)(圖1B)。

A. 野生株、缺失株和反式回補株的PCR和Western blot鑒定；B. 野生株、缺失株和反式回補突變株生長特性分析，菌株之間生長差異顯著性檢驗采用 One-way ANOVA, ns. 差異不顯著(P≥0.05)。WT.腸炎沙門菌CICC10467野生株；ΔfliC. 腸炎沙門菌CICC10467 fliC基因突變株；ΔfliC::S. Enteritidis fliC. 腸炎沙門菌CICC10467 fliC基因回補株；ΔfliC::R91S/Q339K/A431T. R91S、Q339K和A431T反式回補突變株；ΔfliC::R91S. R91S反式回補突變株；ΔfliC::Q339K. Q339K反式回補突變株；ΔfliC::A431T. A431T反式回補突變株；ΔfliC::R91S/Q339K. R91S和Q339K反式回補突變株；ΔfliC::R91S/A431K. R91S和A431K反式回補突變株；ΔfliC::Q339K/A431K. Q339K和A431K反式回補突變株，下圖同A. PCR and Western blot identification for wild type, mutant and complements; B. Growth analysis of wild type, mutant and trans-complemented strains. Growth characteristic of wild type, fliC mutant and trans-complemented strains was analyzed by One-way ANOVA, ns. No significant (P≥0.05). WT, ΔfliC, ΔfliC::S. Enteritidis fliC, ΔfliC::R91S/Q339K/A431T, ΔfliC::R91S, ΔfliC::Q339K, ΔfliC::A431T, ΔfliC::R91S/Q339K, ΔfliC::R91S/A431K, ΔfliC::Q339K/A431K denoted S. Enteritidis CICC10467 wild type, fliC mutant, S. Enteritidis fliC trans-complemented strain, R91S/Q339K/A431T trans-complemented strain, R91S trans-complemented strain, Q339K trans-complemented strain, A431T trans-complemented strain, R91S/Q339K trans-complemented strain, R91S/A431K trans-complemented strain, Q339K/A431K trans-complemented strain, respectively, the same as below圖1 沙門菌野生株、fliC缺失株和反式回補突變株鑒定Fig.1 Identification of wild type, fliC mutant and trans-complemented strains

2.3 FliC第91位精氨酸突變減弱腸炎沙門菌鞭毛運動性

運動性試驗結果顯示，S. EnteritidisfliC回補株和R91S/Q339K/A431T回補株的運動性恢復至野生株的80%，fliC基因缺失株運動能力喪失，R91S、R91S/Q339K、R91S/A431T回補株與缺失株的運動能力基本一致，并且顯著低于野生株(P<0.000 1)(圖2)。結果表明，FliC第91位精氨酸置換為絲氨酸后導致腸炎沙門菌運動性喪失。

2.4 FliC第91位精氨酸突變改變腸炎沙門菌鞭毛形態

研究表明，細菌鞭毛形態與運動性密切相關，為進一步探究FliC第91位精氨酸突變為絲氨酸是否通過改變腸炎沙門菌的鞭毛形態從而改變其運動性，通過透射電鏡觀察發現，S. EnteritidisfliC和R91S/Q339K/A431T(Type Ⅱ)回補株的鞭毛形態與野生株基本一致，Q339K、A431T和Q339K/A431T回補株鞭毛形態基本一致，彎曲程度大，柔韌性較強，R91S、R91S/Q339K和R91S/A431T回補株均存在第91位精氨酸突變，鞭毛形態與野毒株明顯不同，形態鈍直柔韌性較低，表明FliC蛋白R91S突變導致鞭毛的形態發生改變從而影響其運動性(圖3)。同時揭示了腸炎沙門菌運動性、鞭毛形態和氨基酸位點三者之間密切相關性，第91位、第339位和第431位3個氨基酸位點存在結構互作使得沙門菌鞭毛形態得到一定程度恢復。

菌株之間運動性的差異顯著性檢驗采用 One-way ANOVA, ****.P<0.000 1Comparisons of colony diameter was analyzed by One-way ANOVA, ****.P<0.000 1圖2 野生株、fliC基因突變株和反式回補突變株的運動性分析Fig.2 Motility analysis of wild type, fliC mutant and trans-complemented strains

圖3 野生株、fliC基因突變株和反式回補突變株鞭毛的透射電鏡圖(Bar=2 μm)Fig.3 Transmission electron micrograph of flagellum on wild type, fliC mutant and trans-complemented strains (Bar=2 μm)

2.5 FliC第91位氨基酸突變降低腸炎沙門菌黏附和入侵細胞能力

為探究FliC第91位精氨酸突變為絲氨酸對細菌的細胞黏附和入侵能力的影響，通過結腸癌細胞HCT116和小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7的感染試驗證實S. EnteritidisfliC回補株和R91S/Q339K/A431T回補株的細胞黏附和入侵能力顯著強于fliC缺失株(P<0.01)，R91S、R91S/Q339K、R91S/A431T回補株與fliC基因缺失株的黏附和入侵細胞能力無顯著差異(P≥0.05)并且均顯著低于親本毒株(P<0.001)(圖4)。間接免疫熒光試驗獲得相似的結果(圖5)。以上結果揭示R91S突變能夠顯著減弱腸炎沙門菌對HCT116和RAW264.7細胞的黏附和入侵能力。

黏附試驗：分別將HCT116(A)和RAW264.7 細胞(B)4 ℃預冷 30 min，以MOI=10感染細胞后 4 ℃繼續孵育30 min，裂解細胞收集裂解液，稀釋后進行平板計數；入侵試驗：以MOI=10菌量分別感染 HCT116(C)和RAW264.7細胞(D)，37 ℃孵育2 h 后，裂解細胞收集裂解液，稀釋后進行平板計數；采用One-way ANOVA進行顯著性檢驗(ns.P≥0.05; *.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001)For adhesion assay, HCT116 (A) and RAW 264.7 (B) cells were precooled at 4 ℃ for 30 min, cells were lysed after infecting with strains (MOI=10) at 4 ℃ for 30 min, then inoculated TSA plate for bacteria mount; For invasion assay, HCT116 (C) and Raw2647 (D) cells were lysed after infecting with strains (MOI=10) at 37 ℃ for 2 h, followly inoculated TSA plate for bacteria amount, comparison of bacterial load were analyzed by One-way ANOVA (ns. P≥0.05; *.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001)圖4 野生株、fliC基因突變株和反式回補突變株對HCT116細胞和RAW264.7細胞的黏附和入侵Fig.4 Adhesion and invasion assay of wild type, fliC mutant and trans-complemented strains in HCT116 cells and RAW264.7 cells

藍色熒光表示RAW264.7細胞核，綠色熒光表示腸炎沙門菌Blue fluorescence and green fluorescence represented nucleus of RAW264.7 cells and Salmonella Enteritidis, respectively圖5 間接免疫熒光試驗鑒定各菌株對RAW264.7細胞的黏附能力(400×)Fig.5 Adhesion ability of each Salmonella strain to RAW264.7 cells identified by indirect immunofluorescence assay (400×)

2.6 FliC第91位氨基酸突變減弱腸炎沙門菌在動物體內定植能力

BALB/c小鼠腹腔注射感染各菌株后，評估各組肝和脾中細菌載量，細菌計數結果顯示，感染后6、24、48 h，fliC缺失株和R91S回補株感染的小鼠器官載量無顯著差異，野生株和S. EnteritidisfliC回補株感染的小鼠器官載量無顯著差異，野生株和S. EnteritidisfliC回補株入侵小鼠肝和脾能力顯著高于fliC缺失株和R91S回補株(P<0.001或P<0.000 1)(圖6)，以上結果提示fliC基因缺失影響腸炎沙門菌在BALB/c小鼠肝和脾的定植能力，R91S突變能夠減弱腸炎沙門菌的體內定植能力。

細菌感染后24 h肝和脾載菌量整體均呈現下降趨勢，48 h時組織中的細菌載量高于24 h，并且fliC缺失株和R91S回補株的器官載量顯著低于野生株和S. EnteritidisfliC回補株(P<0.000 1)，表明感染后48 h細菌出現增殖，fliC基因缺失株和R91S突變株的黏附和入侵能力減弱直接影響其胞內增殖(圖6)。

105CFU腸炎沙門菌野生株或突變株腹腔感染BALB/c小鼠，感染后6、24、48 h測定肝和脾的載菌量；顯著性檢驗采用Two-way ANOVA，ns. P≥0.05; *.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001; ****.P<0.000 1BALB/c mice were intraperitoneally infected with 1×105CFU Salmonella Enteritidis wild type and mutations. At 6, 24, 48 h post infection, the bacterial load were assessed on liver and spleen； Comparison of bacterial load was analyzed by Two-way ANOVA with: ns. P≥0.05; *.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001; ****.P<0.000 1圖6 FliC第91位精氨酸突變對腸炎沙門菌體內定植能力的影響Fig.6 The effect of 91 arginine mutation in FliC protein on colonization of Salmonella Enteritidis in vivo

3 討 論

細菌的鞭毛是復雜的運動器官，形成過程需要多個結構基因和調控基因參與[13]。雞白痢沙門菌不表達鞭毛，從而能夠有效避免引發宿主的促炎反應[14]。本研究前期通過功能基因序列分析揭示flgK基因在373 bp處堿基突變形成終止子，導致FliC蛋白翻譯過程提前終止[15]，flhB基因存在197 bp的片段缺失，推測這兩個基因的突變可能導致雞白痢血清型不能形成鞭毛。進一步的氨基酸序列比對發現雞白痢FliC蛋白與腸炎沙門菌也存在2～3個不同的氨基酸位點。以鼠傷寒沙門菌FliC蛋白同源建模發現3個氨基酸位點分別位于D1和D2區域。Vonderviszt等[16]研究揭示鼠傷寒沙門菌D1區域是影響鞭毛絲穩定性和多態性構象的主要位置。結構預測顯示相鄰兩個鞭毛單體的D1區域和D2小部分區域形成的凸面和凹面圍繞中心軸相互作用形成鞭毛原絲結構[17]。Smith等[8]將D1區域的第84位谷氨酸、第91位精氨酸和第95位亮氨酸突變為丙氨酸后，鼠傷寒沙門菌的運動性基本喪失，而第90位谷氨酰胺、第101位天冬酰胺等突變后并不影響細菌運動性，可見D1區域中存在參與鞭毛空間結構形成的關鍵氨基酸位點。本研究經氨基酸序列比對發現僅雞白痢沙門菌FliC蛋白第91位為絲氨酸并且在血清型內高度保守，其他23個不同鞭毛抗原型沙門菌血清型均為精氨酸。將腸炎沙門菌第91位精氨酸置換為絲氨酸后，腸炎沙門菌運動性基本喪失，此結果與Smith等[8]將精氨酸置換位丙氨酸所獲得的結果一致，表明第91位精氨酸是維持腸炎沙門菌運動性的關鍵氨基酸。進一步的透射電鏡觀察鞭毛形態明確表明R91S突變引起鞭毛形態發生顯著變化，揭示鞭毛絲形態和細菌運動性之間存在相關性，鞭毛形態變得鈍直，柔韌性下降可能是導致其運動性丟失的主要原因，這與Kanto等[7]的研究結果基本符合，FliC蛋白部分氨基酸位點改變能夠直接影響鞭毛絲的形態。沙門菌鞭毛絲由11根鞭毛原絲(protofilament)構成，約3 000個鞭毛蛋白亞基參與組成，鞭毛原絲形態分為L型和R型兩種，通過相互切換改變鞭毛形態從而改變運動狀態[9]。Wang等[10]解析鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白結構揭示呈縱向排列的兩個鞭毛蛋白亞基之間的接觸面均位于FliC蛋白N端的α螺旋結構，通過氫鍵相互作用，參與氫鍵構成的氨基酸殘基突變導致R型鞭毛原絲轉變為L型，從而改變鞭毛形態。鼠傷寒沙門菌FliC第91位精氨酸殘基參與氫鍵構成，同源建模揭示腸炎沙門菌FliC第91位精氨酸與鼠傷寒沙門菌具有相似的空間結構位置，R91S突變改變鞭毛形態和細菌運動性可能與鞭毛原絲構象發生變化有關。Zhang等[18]研究表明，鼠傷寒沙門菌FliC蛋白氨基酸序列89—96 aa區域缺失導致TLR5無法識別，至于腸炎沙門菌第91位精氨酸突變為絲氨酸是否影響TLR5受體識別和體液免疫應答反應還需要進一步研究。Hayashi等[9]鑒定了多個新的第2突變位點能夠幫助沙門菌的鞭毛絲形態從鈍直轉變為超螺旋結構，并且第2突變位點均位于D1區域。本研究中發現的第2位點(339位)和第3位點(431位)也是首次鑒定的參與鞭毛形態從鈍直轉變為螺旋型過程的兩個氨基酸位點，3個位點空間結構相互作用使得鞭毛轉變為螺旋型。本研究中鑒定出雞白痢沙門菌fliC基因存在兩種形式，遺傳進化分析表明，兩個基因型雞白痢菌株位于相關的兩個進化分枝，Ⅱ型雞白痢菌株較Ⅰ型菌株可能發生適應性進化，全基因組序列分析表明，雞白痢沙門菌毒力和代謝基因可能從祖代菌株914CE產生多樣性變異[19]。Ⅰ型和Ⅱ型雞白痢菌株產生兩種不同的運動表型，這與鞭毛形態差異密切相關[20]。沙門菌的鞭毛參與細菌的腸道定植和感染過程[21-22]，這與本研究結果揭示的細菌運動性丟失導致腸炎沙門菌對HCT116細胞和RAW264.7細胞的黏附和入侵能力顯著下降現象基本符合，BALB/c小鼠的感染試驗結果也充分揭示這一現象。綜上，本研究揭示了FliC第91位精氨酸是維持腸炎沙門菌鞭毛形態和細菌運動性的關鍵位點，精氨酸突變改變鞭毛形態，減弱腸炎沙門菌在小鼠體內的定植能力。鞭毛參與細菌的致病過程同時又作為抗原刺激機體產生免疫應答[23-24]。

4 結 論

腸炎沙門菌FliC蛋白第91位精氨酸在雞傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌等23個血清型內高度保守，R91S突變能夠改變腸炎沙門菌的鞭毛形態，減弱腸炎沙門菌的運動性，細胞黏附入侵能力及小鼠體內定植能力，為腸炎沙門菌的疫苗研發提供理論基礎。