基于16S rDNA測序分析腹腔注射苦參堿的昆明小鼠腸道菌群結構

曹志剛，王 弘，張 華，孫盼盼，李宏全，孫耀貴，楊惠珍，王建中，尹 偉，范闊海，孫 娜*

(1. 山西農業大學動物醫學學院，太谷 030801； 2. 山西農業大學體育部，太谷 030801；3.山西農業大學實驗動物管理中心，太谷 030801)

苦參堿(matrine，MT)具有抗炎[1-2]、抗氧化[3-4]、抗腫瘤[5-6]、鎮痛[7]等藥理作用，其治療新冠肺炎的臨床療效已經得到了證實[8]，且初步揭示了苦參堿通過TNF信號通路調控病毒復制、細胞凋亡以及炎癥反應以發揮其抗病毒作用[9]。實驗室前期研究發現，苦參堿具有抗腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus，EMCV)[10]、豬圓環病毒(porcine circovirus type 2，PCV2)[11]、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)[12]的作用。并對PRRSV/PCV2共感染誘發的間質性肺炎有緩解作用[13]。

大量研究表明，腸道菌群與多種疾病密切相關，深刻影響著糖尿病[14-15]、腸道疾病[16]、炎癥[17-18]和神經系統[19]等疾病的治療與臨床研究。研究結果表明，PCV2、PRRSV感染可以引起腸道菌群的改變[20-21]。Iddir等[22]研究發現，腸道菌群與新冠病毒誘發的炎癥高度相關。李蘭娟院士的“四抗二平衡”救治模式也證明了從腸道菌群治療新冠肺炎的有效性[23]。PCV2、PRRSV及新冠病毒感染均可以導致肺部病變及腹瀉等癥狀，中醫臟腑理論有“肺與大腸相表里”、“肺病治腸”等說法，2018年，Mj?sberg和Rao[24]提出了腸-肺軸理論，提示腸道菌群可能是苦參堿發揮藥理作用的靶標。

因此本研究基于16S rDNA高通量測序技術，分析腹腔注射苦參堿的昆明小鼠腸道菌群的結構，為后續苦參堿的抗病毒、抗炎、緩解肺損傷等藥理作用的研究及苦參堿的進一步開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

清潔級昆明小鼠，雌性，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0006。動物試驗遵循山西農業大學動物倫理委員會規定，試驗動物飼養于山西農業大學實驗動物管理中心(飼養環境溫度：20～25 ℃，飼養環境相對濕度：40%～70%)，許可證號SYXK(晉)2020-0003。

1.2 藥物和試劑

苦參堿購買于南京澤朗生物科技有限公司，其純度為98.7%；2×SYBR Green qPCR Master Mix(Low ROX，Biotool，美國)。

1.3 試驗設計

將20只昆明小鼠隨機分為2組，每組10只，分別是陰性對照組(NC組)和苦參堿組(MT組)，適應性飼養1周后，按照0.02 mL·g-1劑量，腹腔注射40 mg·kg-1的苦參堿，連續給藥5 d，每日2次。NC組等劑量腹腔注射生理鹽水。給藥第6天，收集各組糞便及各腸段組織，糞便樣品進行16S rDNA腸道菌群結構譜測序分析。提取各腸段組織總RNA，利用qPCR技術測定差異菌種的表達量。

1.4 小鼠糞便及腸道組織的收集

給藥第6天，對小鼠腹部按摩，促使其排便，迅速將糞便收集至無菌管中，液氮速凍后-80 ℃保存，干冰運輸；按照山西農業大學動物倫理委員會規定，解剖小鼠，分別將各腸段組織收集至對應的凍存管，液氮速凍后-80 ℃保存。

1.5 16S rDNA腸道菌群結構譜測序分析

16S rDNA腸道菌群結構譜測序分析基于Illumina HiSeq測序平臺，利用雙末端測序(Paired-End)的方法，構建小片段文庫進行測序。通過對原始測序序列進行過濾、雙端拼接，得到優化序列(Tags)。將優化序列進行聚類，劃分OTU，并根據OTU的序列組成得到其物種分類；基于OTU分析結果，進一步進行α多樣性分析(alpha diversity)、β多樣性分析(beta diversity)和顯著物種差異分析等，可以挖掘樣品之間的差異。

稀釋曲線是α多樣性分析的其中一種，可以衡量所測樣本數據量是否充足，以反映樣品中的物種多樣性。使用QIIME軟件進行β多樣性分析，通過β多樣性分析可以比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度。ANOSIM分析是β多樣性分析的一種，ANOSIM分析通過4種不同算法計算樣本間β多樣性的距離，其中Unweighted unifrac與Jaccard是非加權算法，Weighted unifrac與Bray-curtis是加權算法，非加權算法反映的是物種的有無，而加權算法不僅考慮物種的有無，而且考慮物種的豐度。通過Lefse(Line Discriminant Analysis (LDA) Effect Size)分析在不同組間尋找具有統計學差異的標記性質物種，本試驗中設定篩選標準為|LDA score|>4。Metastats分析通過Metastats軟件對組間的物種豐度數據進行t檢驗，KEGG分析通過PICRUSt軟件完成。擴增所用引物為細菌16S rDNA (V3+V4)區域引物：338F：5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R：5′- GGACTAC-HVGGGTWTCTAAT-3′，DNA提取、PCR擴增及測序均由百邁客生物技術公司協作完成。

1.6 qPCR檢測嗜酸乳桿菌在各腸段的表達量

利用SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR相對定量法驗證測序結果，選用β-actin作為內參基因，目的基因引物和內參基因引物序列如下：嗜酸乳桿菌F：5′-GAAAGAGCCCAAACCAAGTGATT-3′，嗜酸乳桿菌R：5′-CTTCCCAGATAATTCAA-CTATCGCTTA-3′；β-actinF：5′-AGGGAAATC-GTGCGTGACAT-3′，β-actinR：5′-GGAAAA-GAGCCTCAGGGCAT-3′。qPCR反應采用ABI 7500 Real-Time PCR系統，采用20 μL體系：F-Primer 1 μL，R-Primer 1 μL，Template≤100 ng，2× SYBR Green qPCR Master Mix with ROX 10 μL， H2O補至20 μL，按照兩步法PCR擴增標準程序進行試驗。然后經過95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s及60 ℃ 15 s進行熔解曲線分析。嗜酸乳桿菌基因相對表達量的計算是根據內參基因和目的基因的CT值，采用2-△△CT法進行計算。

1.7 統計分析

16S rDNA腸道菌群結構譜測序數據基于Illumina HiSeq測序平臺分析所得。所有數據以“平均值±標準差”表示，通過Graphpad Prism 5.0軟件處理，采用t檢驗進行組間差異性分析，分析結果以P<0.05 表示為差異顯著，以P<0.01表示為差異極顯著。

2 結 果

2.1 稀釋曲線衡量測序數據量

稀釋曲線結果顯示，MT、NC組的稀釋曲線均逐漸平緩，表明腸道中的物種并不會隨測序數量的增加而增加，本試驗中所測的樣本數量足以反映樣本的菌群特征(圖1)。

2.2 苦參堿調節小鼠腸道菌群結構

ANOSIM分析結果顯示，通過加權算法所得P值均小于0.01，通過非加權算法所得P值均大于0.05(表1)，該結果表明，苦參堿可以對腸道菌群物種豐度造成顯著影響(P<0.01)。

2.3 苦參堿對小鼠腸道菌群豐度的影響

Lefse分析結果顯示，苦參堿顯著增加了擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、擬桿菌目(Bacteroidales)、Muribaculaceae、ML635 J 40 aquatic group、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)的豐度，而顯著減少了厚壁菌門(Firmicutes)、梭菌綱(Clostridia)、梭菌目(Clostridiales)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)的豐度(圖2)。

圖1 稀釋曲線衡量測序數據量Fig.1 Rarefaction curve measures the amount of sequencing data

表1 苦參堿對小鼠腸道菌群β多樣性的影響

2.4 Metastats分析苦參堿對小鼠腸道菌群的影響

為了進一步分析苦參堿對腸道菌群物種豐度的影響，分別從門、綱、目、科、屬、種水平對各組進行Metastats分析，結果顯示，苦參堿顯著增加了擬桿菌門(Bacteroidetes)(P<0.01)、擬桿菌綱(Bacteroidia)(P<0.01)、擬桿菌目(Bacteroidales)(P<0.01)、Muribaculaceae(P<0.01)、Faecalibaculum(P<0.01)、杜氏桿菌屬(Dubosiella)(P<0.01)、Muribaculum(P<0.05)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)(P<0.05)的豐度；苦參堿顯著減少了厚壁菌門(Firmicutes)(P<0.05)、變形菌門(Proteobacteria)(P<0.05)、梭菌綱(Clostridia)(P<0.05)、 梭菌目(Clostridiales)(P<0.05)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)(P<0.05)、Marvinbryantia(P<0.05)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)(P<0.05)的豐度(表2)。

2.5 苦參堿促進嗜酸乳桿菌在各腸段的定植

qPCR結果顯示(圖3)，與NC組相比，MT組十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸及糞便中嗜酸乳桿菌基因相對表達量均顯著增加(P<0.05)，該結果與Lefse及Metastats分析結果一致，且進一步發現苦參堿可以增強嗜酸乳桿菌在各腸段的定植。

2.6 KEGG分析苦參堿對代謝途徑的影響

基于上述腸道菌群結構的改變，通過KEGG預測分析兩組之間代謝途徑的差異，觀測兩組樣品之間微生物群落的功能基因在代謝途徑上的差異和變化。結果顯示，NC組與MT組腸道微生物測序信息均被映射到氨基酸代謝、內分泌系統及免疫疾病等39個代謝途徑(圖4)，通過比對分析發現MT組的聚糖生物合成與代謝、運輸與分解代謝、其他氨基酸代謝水平顯著高于NC組(P<0.05)，MT組的異生素生物降解與代謝、脂質代謝與信號轉導、碳水化合物代謝水平顯著低于NC組(P<0.05)(圖5)。

圖2 苦參堿對小鼠腸道菌群物種的影響Fig.2 Effects of matrine on the species of intestinal flora in mice

表2 NC與MT組存在顯著差異的菌屬

A. 十二指腸嗜酸乳桿菌相對表達量；B. 空腸嗜酸乳桿菌相對表達量；C. 回腸嗜酸乳桿菌相對表達量；D. 盲腸嗜酸乳桿菌相對表達量；E. 結腸嗜酸乳桿菌相對表達量；F. 直腸嗜酸乳桿菌相對表達量；G. 糞便嗜酸乳桿菌相對表達量。*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001A. Relative expression of Lactobacillus acidophilus in the duodenum; B. Relative expression of Lactobacillus acidophilus in the jejunum; C. Relative expression of Lactobacillus acidophilus in the ileum; D. Relative expression of Lactobacillus acidophilus in the cecum; E. Relative expression of Lactobacillus acidophilus in the colon; F. Relative expression of Lactobacillus acidophilus in the rectum; G. Relative expression of Lactobacillus acidophilus in the feces. *. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001圖3 苦參堿對嗜酸乳桿菌基因相對表達量的影響Fig.3 Effect of matrine on relative expression of Lactobacillus acidophilus genes

圖4 NC與MT組代謝通路組成柱狀圖Fig.4 Histogram of the composition of NC and MT groups metabolic pathways

圖5 NC與MT組差異代謝通路柱狀圖Fig.5 Histogram of the difference between NC and MT groups metabolic pathways

3 討 論

通過β多樣性、Lefse及Metastats分析，發現腹腔注射苦參堿顯著增加了擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌目(Bacteroidales)、Muribaculaceae、Faecalibaculum和嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)的豐度，而顯著降低了厚壁菌門(Firmicutes)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)等的豐度，說明苦參堿對昆明小鼠腸道菌群結構有調控作用。

研究表明，擬桿菌門(Bacteroidetes)可以抑制致病菌在腸道的定植[25]及增強宿主對病毒的抵抗力[26]；擬桿菌目(Bacteroidales)對于保證腸道屏障的完整性至關重要，腸道屏障的完整性是其發揮防御作用的基礎[27]，Muribaculaceae通過對單糖的競爭利用，可抑制同樣需要單糖的腸道致病菌[28]，Faecalibaculum在結直腸癌小鼠模型中具有抗腫瘤的作用[29]。Chen等[30]研究發現，益生元長鏈菊粉可以調整腸道菌群結構，與苦參堿類似，長鏈菊粉可以抑制厚壁菌門/擬桿菌門的比值，增加乳酸桿菌等有益菌，從而改善腸道屏障功能。瘤胃菌科(Ruminococcaceae)與脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)均與機體的炎癥反應相關，瘤胃菌科(Ruminococcaceae)豐度降低可以抑制炎癥反應[31]，而脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)豐度增加是潰瘍性結腸炎疾病的一個重要特征[32]。綜上，苦參堿可通過改變腸道菌群的結構，增強小鼠腸道菌群抗病毒、抗炎、抑制致病菌等方面的功能。

嗜酸乳桿菌是腸道最重要的益生菌之一，研究表明，嗜酸乳桿菌可促進腸道緊密連接蛋白Occludin的表達[33]，口服乳桿菌可以保護宿主動物免受流感病毒感染，增強機體抗病毒免疫反應[34-35]，同時，乳桿菌可以緩解病毒感染引起的肺炎等一般臨床癥狀[36-38]。在抗腫瘤[39-40]、抗氧化[41-42]等方面乳桿菌也有顯著效果。綜上，苦參堿通過增加小鼠腸道菌群中嗜酸乳桿菌的豐度，增強其在各腸段的定植能力，繼而發揮抗病毒、抗肺炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用。

“肺與大腸相表里”最早出自《靈樞·本輸》：“肺合大腸，腸者，傳導之腑”。這一理論立足于中醫“臟腑理論”，對新冠病毒等疾病的防控具有重要意義。本試驗中，苦參堿導致了嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)等具有抗肺炎、抗腫瘤、抗氧化功能腸道菌群的增多，基于“肺與大腸相表里”理論，腸道菌群結構的改變會導致肺變化，因此推測，苦參堿可能通過改變腸道菌群繼而發揮抗肺炎等藥理作用。

通過腹腔注射給予苦參堿，苦參堿并未與腸道菌群直接接觸，但其仍然可以對腸道菌群造成影響，推測苦參堿可能通過對機體代謝水平造成影響進而改變機體腸道菌群，后續將對苦參堿影響腸道菌群的機理進一步探究。綜上所述，苦參堿可以改變昆明小鼠腸道菌群的結構，增強有益菌嗜酸乳桿菌在各腸段的定植，并造成代謝途徑的差異，且苦參堿抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用的發揮可能與其對腸道菌群的影響有關。

4 結 論

腹腔注射苦參堿可以顯著改變昆明小鼠腸道菌群的結構，增加有益菌嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)在腸道中的定植，并造成了聚糖生物合成與代謝、運輸與分解代謝等代謝途徑的差異，為進一步揭示苦參堿發揮藥效作用的機理奠定了基礎。