弓形蟲卵囊感染小鼠的急性期與慢性期的腦組織蛋白質組變化

付 明，賀君君，朱興全，叢 偉*

(1. 山東大學海洋學院，威海 264209； 2. 中國農業科學院蘭州獸醫研究所/家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046; 3. 山西農業大學動物醫學學院, 太谷 030801; 4. 云南農業大學動物醫學院，云南省高校獸醫公共衛生重點實驗室，昆明 650201)

弓形蟲是一種呈全球性分布的細胞內寄生原蟲，全世界約有三分之一的人口感染弓形蟲[1]，我國居民弓形蟲感染率約為8%，而一些歐美國家弓形蟲感染率更高[2-3]。弓形蟲可以感染幾乎所有溫血動物[4]，在宿主中速殖子是急性感染期間的標志，一旦速殖子受到來自宿主免疫反應的壓力，就會分化為緩殖子并在宿主多種組織中以包囊形式長期存在而不表現明顯的臨床癥狀,表現為慢性感染[1]。弓形蟲感染對于免疫功能低下患者或受損個體可能具有致命性[5]，潛伏感染可能被重新激活，這種再激活通常表現為弓形蟲腦炎[6]。

貓科動物是弓形蟲唯一的終末宿主，感染弓形蟲的貓科動物通過一次糞便排泄可向環境中釋放大量卵囊，在適宜條件下可發育為感染性極強的孢子化卵囊，且在不利的環境中仍能保持較長時間的感染能力[7-8]。據調查，人急性弓形蟲病與環境弓形蟲卵囊污染密切相關，主要是由孢子化卵囊污染環境水源、土壤引起[9]。與弓形蟲包囊(緩殖子)和假包囊(速殖子)相比，卵囊污染已成為水源性和食源性弓形蟲感染的主要因素[10-11]。弓形蟲感染被認為是對牲畜業造成經濟影響的一個重要原因[12-13]，尤其是豬等雜食性動物，在中國,母豬弓形蟲感染造成的流產現象比較普遍，可能會導致巨大的經濟損失[14]。而生食或食用未煮熟的被感染動物的肉類被認為是人感染弓形蟲的主要來源之一。

弓形蟲具有獨特的協調宿主基因表達與逃避宿主免疫防御機制的能力，以便更好地建立急性或慢性感染[15]，而蛋白質組學對于揭示不同階段弓形蟲感染和對宿主細胞的機制研究具有重要意義[16]，iTRAQ技術結合2D-LC-MS/MS分析已廣泛用于病原體與宿主相互作用的組學研究。采用該項技術，Yang等[17]分析了弓形蟲包囊慢性感染對野生型和CD44小鼠腦組織蛋白的表達情況；Zhou等[18]進行了弓形蟲卵囊孢子化過程的蛋白質組學研究；Wang等[19]研究了弓形蟲不同發育階段的蛋白表達情況。這也表明蛋白質組學技術可能是進一步闡明弓形蟲持續存在的許多未知因素的最佳方法[20]。

弓形蟲感染的嚴重程度與環境因素、宿主遺傳學特點、弓形蟲蟲株、感染期間蟲體所處階段以及感染途徑等有關[20]。迄今為止，對于弓形蟲蟲體本身及弓形蟲包囊以及速殖子感染宿主相關的蛋白質組學研究相對較多[17,21-22]，但缺少弓形蟲卵囊感染對宿主蛋白質組影響的研究。因此本試驗利用iTRAQ技術對弓形蟲PRU株卵囊急、慢性感染對小鼠腦組織蛋白組的影響展開研究，并對差異表達蛋白進行功能分析。這些發現將有助于了解弓形蟲腦炎的發病機制，并有助于發現弓形蟲腦病新的診斷、預防、控制和治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及蟲株

SPF級6～8周齡雌性BALB/c小鼠購自蘭州大學實驗動物中心。1只10周齡的中國貍花貓(Chinese Li Hua Mao)，購自蘭州雁灘花鳥市場，經間接血凝試驗(IHA)和改良凝集試驗(MAT)檢測[23]，呈弓形蟲抗體陰性。弓形蟲Ⅱ型PRU株系由本實驗室經小鼠傳代保存。

1.2 主要試劑及儀器

Bradford 蛋白定量試劑盒(Bio-Rad)、iTRAQ?Reagents Multiplex Kit(Sigma)、質譜級胰酶(Promega)、L-3000 HPLC(RIGOL)、EASY-nLCTM1200 納升級 UHPLC(Thermo)、Q ExactiveTM HF-X 質譜儀(Thermo)、C18除鹽柱(Thermo)、RT-6100 酶標儀(雷杜)、3k超濾管(Millipore)、組織研磨儀(上海凈信)、超聲波細胞破碎儀(寧波新芝)。

1.3 卵囊的制備與收集

弓形蟲PRU蟲株感染小鼠制備包囊，含100個PRU株包囊的小鼠腦組織研磨液飼喂小貓。飼喂后第3天起對貓糞便進行顯微鏡檢查，檢測到卵囊后，收集糞便，利用蔗糖浮選和氯化銫梯度離心法對卵囊進行分離純化[18，24]。將純化過的卵囊360 r·min-1離心后，置于2 mL·L-1硫酸中懸浮，室溫下搖床搖動7 d，獲得孢子化(即感染性)的卵囊。用0.85 mL·L-1生理鹽水洗滌2次，2 mL·L-1硫酸懸浮。最后，對卵囊計數，調整為每毫升PBS含100個卵囊, 4 ℃保存備用[25]。

1.4 弓形蟲卵囊感染及小鼠腦組織收集

12只SPF 6～8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機分為4組，每組3只。隨機選擇其中兩組，1 mL PBS(含100個孢子化卵囊) 灌胃感染，另外兩組為對照組，1 mL PBS緩沖液灌胃。在感染后的第11和33天[26-29]，麻醉處理后，無菌采集腦組織，使用TIANamp Genomic DNA kit (TianGenTM, Beijing, China) 提取腦組織基因組DNA，-20 ℃保存，利用弓形蟲B1基因經PCR擴增進一步證實腦組織中弓形蟲的存在，最后樣品經瞬時液氮冷凍后轉移至—80 ℃冰箱保存，用于蛋白質組學研究。

1.5 蛋白質抽提及定量

樣品低溫條件研磨成粉，迅速轉移至離心管(經液氮預冷)，加入蛋白質裂解液(50 mmol·L-1Tris-HCl、8 mol·L-1尿素、0.2 mL·L-1SDS，pH=8)，振蕩混勻，冰水浴超聲5 min。充分裂解后，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min。取上清加入終濃度2 mmol·L-1二硫蘇糖醇，56 ℃反應1 h后,加入足量碘乙酸，室溫避光反應1 h。離心管中加入4倍體積的丙酮(經-20 ℃預冷)，-20 ℃條件下進行沉淀(不少于2 h)，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min收集沉淀。再加入1 mL 經-20 ℃預冷處理過的丙酮，重新懸浮并清洗沉淀后，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，收集沉淀，風干，加入蛋白溶解液(8 mol·L-1尿素、100 mmol·L-1TEAB，pH=8.5)溶解蛋白沉淀。將抽提出來的蛋白按照Bradford 蛋白質定量試劑盒說明書的要求進行蛋白定量。

1.6 樣品的酶解、iTRAQ標記蛋白及HPLC分級

每個樣品各取100 μg蛋白，加入蛋白溶解液定容至100 μL，分別加入1 μg·μL-1胰酶2 μL和100 mmol·L-1TEAB緩沖液500 μL，混勻，37 ℃酶切過夜。再加等體積的1 mL·L-1甲酸，混勻，室溫條件下，12 000 r·min-1離心 5 min。將上清通過C18除鹽柱處理后，清洗洗脫，洗脫樣合并后凍干。加入 0.5 mol·L-1TEAB緩沖液20 μL復溶，并加入足量 iTRAQ 標記試劑(溶于異丙醇)混勻，室溫反應1 h。標記采用8-plex 標記，方法參考 iTRAQ試劑盒操作說明。配制流動相 A 液(2 mL·L-1乙腈，氨水調至 pH=10)，使用1 mL A液溶解標記后的混合樣品粉末，室溫下12 000 r·min-1離心10 min， 取1 mL體積上清進樣。使用L-3000 HPLC系統，色譜柱為XBridge Peptide BEH C18(25 cm×4.6 mm, 5 μm)，進行HPLC分級。

1.7 液相色譜-串聯質譜分析、差異蛋白篩選及生物信息學分析

每個餾分上清各取 2 μg進樣，液質檢測。使用 EASY-nLCTM1200 納升級 UHPLC 系統，按儀器說明進行液相色譜洗脫。使用 Q ExactiveTM HF-X 質譜儀進行質譜序列測定，生成質譜檢測原始數據(raw文件)。將下機后的raw文件直接導入到Proteome Discoverer2.2軟件進行數據庫檢索，譜肽、蛋白定量。按差異倍數FC(Fold Change)篩選差異表達蛋白，其中，FC≥1.5且P≤0.05為上調表達蛋白，FC≤0.83且P≤0.05為下調表達蛋白。利用Gene Ontology數據庫(http://www.geneontology.org/)對篩選到的差異表達蛋白進行GO功能富集分析。同時，利用 KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes) 數據庫進行差異蛋白通路富集分析。最后利用STRING(https://string-db.org/)獲取蛋白互作數據，使用Cytoscape3.7.2進行蛋白互作分析。

2 結 果

2.1 差異表達蛋白的篩選

依據FC≥1.5 或者≤0.83 倍，P≤0.05 的篩選條件，在急性感染階段，共篩選出85個差異表達蛋白，其中,30個上調表達，55個下調表達。在慢性感染階段，共篩出51個差異表達蛋白，其中47個上調表達，4個下調表達。而慢性感染階段與急性感染階段相比，共有114個差異表達蛋白，其中,71個上調表達，43個下調表達(圖1)。相關蛋白組數據已通過iProX[30]上傳ProteomeXchange，獲得的接收編號為IPX0002989000/PXD025815。

2.2 差異蛋白的GO功能富集分析

對弓形蟲卵囊急慢性感染小鼠腦組織鑒定到的差異蛋白進行GO分析(圖2)可以發現，在弓形蟲卵囊急性感染期，差異表達蛋白在生物過程排在首位的為運輸(transport)，差異蛋白主要表現為下調表達；而慢性感染中免疫系統過程(immune system process)排在首位，表現上調表達。在細胞組分中，排在首位的均為生物膜(membrane)，分別表現為下調和上調。在分子功能中，排在首位的分別為離子跨膜轉運蛋白活性(ion transmembrane transporter activity)和小分子結合(small molecule binding)，分別表現為下調和上調。

與急性感染相比，慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白在生物過程、細胞組分和分子功能主要在調節細胞內信號轉導(regulation of intracellular signal transduction)、質膜蛋白復合物(plasma membrane protein complex)、半胱氨酸型肽酶活性(cysteine-type peptidase activity)方面表現出差異。

2.3 差異表達蛋白的KEGG通路分析

對于弓形蟲卵囊急性感染小鼠，在85個差異表達蛋白中，有59個蛋白被注釋，共涉及115條通路。慢性感染小鼠的51個差異表達蛋白中，有38個蛋白被注釋，共涉及56條通路。弓形蟲慢性感染與急性感染相比，在114個差異表達蛋白中，有79個蛋白被注釋，共涉及103條通路。

對差異表達蛋白進行KEGG通路分析(圖3)，相同的路徑富集主要集中在同種異體移植排斥(allograft rejection)、抗原處理和呈遞(antigen processing and presentation)、自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid disease)、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)、單純皰疹病毒感染(herpes simplex infection)、弓形蟲病(toxoplasmosis)、Ⅰ型糖尿病(Type I diabetes mellitus)、病毒性心肌炎(viral myocarditis)，這些通路多與機體免疫應答過程相關。在弓形蟲急性感染期，其他路徑包括鈣信號通路(calcium signaling pathway)、系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus)等通路相關蛋白也表現差異性表達。在慢性感染期，與原發性免疫缺陷(primary immunodeficiency)、肺結核(tuberculosis)等相關通路蛋白表現出特異性表達。急慢性感染相比多種信號通路相關蛋白表達呈現特異性，如甲狀腺激素信號通路(thyroid hormone signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)。

2.4 差異表達蛋白的互作分析

急性感染小鼠腦組織差異蛋白互作分析(圖4)發現，信號傳導及轉錄激活蛋白1(Stat1)處于作用網絡中心，與干擾素-γ(IFN-γ)誘導的GTP酶(Igtp、Iigp1)、免疫相關的GTP酶(Irgm1、Irgm2)、鳥苷酸結合蛋白(Gbp2、Gbp6)、β-2-微球蛋白(B2 m)等上調表達蛋白及血清白蛋白(Alb)等下調表達蛋白具有相互作用。慢性感染期間，絕大多數蛋白均表現出上調表達，蛋白酶體亞基(Psmb8)處于網絡中心，除與Stat1、Igtp、Irgm1、Irgm2、Gbp2等具有相互作用外，還與泛素蛋白(Isg15)、干擾素-γ誘導蛋白(Ifi47、Ifit3)等具有相互作用。

慢性與急性感染小鼠腦組織差異蛋白互作分析發現，干擾素-γ誘導蛋白(Ifi47)處于作用網絡中心，與Stat1、Isg15、Irgm2、Irgm1、Iigp1、Psbm10、B2m、胞嘧啶單磷酸激酶2(Cmpk2)等上調表達蛋白及囊泡相關蛋白(Vta1)等下調表達蛋白具有相互作用。

3 討 論

作者應用iTRAQ技術結合2D-LC-MS/MS，對弓形蟲PRU株卵囊感染后11和33 d的小鼠大腦差異表達的蛋白進行了GO功能富集、KEGG通路分析以及蛋白質相互作用(PPI)網絡分析。多數差異表達蛋白都參與代謝、細胞結構、信號轉導和免疫反應等過程。KEGG路徑分析表明，多數差異表達蛋白與機體免疫應答過程相關。

A. 急性感染；B. 慢性感染；C. 慢性vs 急性感染A. Acute infection; B. Chronic infection; C. Chronic infection vs Acute infection圖2 弓形蟲卵囊急慢性感染階段腦組織差異蛋白進行GO分類富集分析Fig.2 The GO classification enrichment analysis of all DEPs of mouse brain infected with Toxoplasma gondii oocysts

A. 急性感染 B.慢性感染 C. 慢性vs 急性感染A. Acute infection; B. Chronic infection; C. Chronic vs Acute infection圖3 弓形蟲卵囊急慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白KEGG通路分析(top20)Fig.3 KEGG pathway analysis of all DEPs of mouse brain infected with Toxoplasma gondii oocysts (top20)

A. 急性感染 B.慢性感染 C. 慢性vs 急性感染A. Acute infection; B. Chronic infection; C. Chronic vs Acute infection圖4 弓形蟲卵囊急慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白互作網絡Fig.4 Interaction network of all DEPs of mouse brain infected by Toxoplasma gondii oocysts

與弓形蟲PRU株包囊感染相比，卵囊感染有多種蛋白呈現相同的表達趨勢，如包囊感染14 d泛素C末端水解酶L1(Uchl1)與卵囊慢性感染中均表現下調表達，包囊感染21 d鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α-1亞基與卵囊急性感染中鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α-2亞基均呈現上調表達[26]。而卵囊急性感染期絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin A3k)(見圖4A)下調表達，在包囊感染7、14以及21 d，該蛋白呈現持續上調表達[26]。多種絲氨酸蛋白酶抑制劑具有免疫調節特性，如阻止核因子(NF-κB)激活來抑制炎癥反應[31]，可見Serpin A3k在卵囊急性感染期的低表達與誘導宿主免疫增強來抵抗弓形蟲感染有關。此外蛋白酶體活化復合物3(Psme3)在包囊感染7及14 d均下調表達，而在卵囊慢性感染期psme1呈上調表達。此外在包囊感染中有多種差異表達蛋白在卵囊感染中未檢測到，如蛋白Lmnb1、Eif1a、Cops4等[26]?？梢姽蜗x包囊感染與卵囊感染具有差異性。

弓形蟲卵囊急慢性感染期間免疫應答效應顯著增強。IFN-γ是弓形蟲感染后產生的重要細胞因子[32]，在感染弓形蟲的細胞中強烈刺激細胞引發自主免疫，其誘導的效應物如IFN誘導的GTP酶、誘導型一氧化氮合酶等在抑制弓形蟲生長及其在細胞自主免疫反應中起重要作用[33]。IFN-γ誘導宿主防御弓形蟲的效應機制是研究熱點之一，從感染初期直到慢性感染，多種與IFN-γ相關的蛋白表達量隨之增加以應對感染，如Gbp2、Gbp2b、Gbp5、Gbp6、Gbp7等均上調表達，這與Hu等[25]的結果一致。p65鳥苷酸結合蛋白(GBPs) 是GTP酶家族四個成員之一[34]，其中小鼠鳥苷酸結合蛋白家族(mGBPs)是由炎癥細胞因子IFN-γ誘導的，并已被證明是誘發自主免疫抵抗弓形蟲感染的重要物質[35]。Degrandi等[36]證實mGBP2是介導寄生蟲抗性的基本免疫效應分子，能積聚在寄生蟲的質膜上進而破壞了寄生蟲的完整性。相關研究結果表明mGBPs對弓形蟲的抗性可能與其在納空泡膜(PVM)中積累和破壞囊泡完整性有關[37-38]。

作為GTP酶的Irgm1、Irgm2、Igtp、ligp1、Tgtp1等蛋白在小鼠腦組織中上調表達，這與Hu等[25]的試驗結果一致。GBP含有一個保守的GTP酶結構域，儲存于正常細胞中，一旦受到弓形蟲感染便可迅速定位到囊泡上，并在囊泡上形成聚合體對弓形蟲囊泡結構造成破壞。GTP的水解為這一聚合過程及這一過程的化學修飾提供能量，這可以解釋GBP與GTP酶同時表達上調的現象。

卵囊急性感染階段小鼠腦組織細胞能量供代謝受抑制。肌酸激酶(Ckm)在所有脊椎動物中都存在，可催化肌酸和ATP的可逆反應，形成磷酸肌酸和ADP[39]，在能量傳導以及間歇性高能量需求細胞的能量平衡中起著重要作用[40]。在弓形蟲急性感染階段，肌酸激酶呈下調表達，這與周永華等[41]的研究結果一致。此外急性感染小鼠腦組織中血紅蛋白(Hbb-b1和Hba-a2)的合成受抑制，這將導致氧氣從肺部到腦組織的輸送效率降低，導致腦部組織能量供應受阻以及腦組織細胞內環境pH的改變。碳酸酐酶 8 (Car8) 是三磷酸肌醇受體 1 (ITPR 1) 的變構抑制劑，可調節細胞內鈣的釋放，對關鍵細胞功能如線粒體能量產生中至關重要[42]，在急性感染中Car8呈下調表達。

免疫相關基因的轉錄水平在弓形蟲卵囊急、慢性感染中被顯著上調。Stat1和IFN-γ的活性對于調控弓形蟲急、慢性感染是必不可少的[43]。IFN-γ主要通過JAK/STAT1信號通路激活基因表達[44]，Stat1可以在IFN-γ存在的條件下被磷酸化，進而形成二聚體遷移至細胞核，在細胞核中激活抗病原體相關基因的轉錄[45]。弓形蟲效應體TgIST運輸到宿主細胞核后通過將抑制性Mi-2/NuRD復合物募集到染色質上的Stat1來阻斷Stat1的轉錄來適時抵抗宿主的防御[46-47]。試驗結果表明在弓形蟲卵囊急慢性感染中Stat1均上調表達，這也與弓形蟲急性和慢性感染GO富集及KEGG通路富集結果相吻合。

4 結 論

對弓形蟲PRU株卵囊急慢性感染小鼠后腦組織差異表達蛋白進行分析，在急性感染期小鼠腦組織能量代謝受到明顯抑制，慢性感染期小鼠免疫應答變得十分強烈，這與Ckm 的下調及mGbp2、Irgm1、Irgm2、Igtp的上調表達相關。結果表明多種與免疫相關的蛋白顯著上調，可見機體抗弓形蟲的生理過程是在多種蛋白協同下完成的，本研究將為弓形蟲腦病的研究及弓形蟲卵囊感染的致病機制研究提供重要的參考數據。