滑液支原體WVU1853株熱不穩定延伸因子的表達及黏附特性分析

岳亞輝，邢小勇，武小椿，溫峰琴，張宏燕，龍翠琴，張 立，馬海云，包世俊

(甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730000)

滑液支原體(Mycoplasmasynoviae，MS)是禽類的一種重要的致病性支原體，主要感染雞和火雞，導致呼吸道病癥、腱鞘炎、關節炎及關節滑膜炎[1-2]。病禽常表現為生長遲滯、脫水、消瘦、跛行，蛋雞產蛋減少、蛋殼異常且蛋品質量差，種雞種蛋孵化率低下，肉雞胴體降級[3-4]。更為嚴重的是，MS感染雞免疫力下降，常引發繼發感染或混合感染，從而使病情加劇、診療困難，淘汰率和病死率大幅增加[5-6]。MS感染呈世界性流行，大部分地區蛋雞場中MS血清陽性率高于70%，其危害性或將超越雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum，MG)，從而給世界造成了巨大的經濟損失，并嚴重制約了全球養禽業的發展[7-9]。因此，開展MS相關的研究，將為其感染的預防、診斷和有效防治奠定理論基礎。

EF-Tu是蛋白質生物合成過程中的關鍵因子之一，在多種生物中廣泛存在[10-11]。研究表明，EF-Tu還參與細胞的多種生理和病理過程，如細胞骨架的組成、細胞信號轉導、腫瘤的發生等[12-13]。此外，EF-Tu亦是一種新型病原相關模式分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，其與其他蛋白結合后被分泌到細胞表面，從而被宿主細胞識別和捕獲[14-15]。王艷芳等[16]證實牛支原體(Mycoplasmabovis，Mb)EF-Tu為其膜表面免疫原性蛋白，并基于此建立了相關檢測方法。Yu等[17]發現豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)可通過EF-Tu與補體系統的調節劑H因子結合從而逃脫補體的殺傷。Balasubramanian等[18]研究證實肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，Mp)EF-Tu通過其羧基端區域與胞外基質成分纖連蛋白結合，促進肺炎支原體與宿主細胞的黏附，激活炎性反應。但迄今為止，尚無MS EF-Tu生物學功能相關的研究報道。因此，本研究擬在MS WVU1853 EF-Tu原核表達的基礎上，通過對rMS EF-Tu免疫原性和EF-Tu在MS內分布的分析，以及對rMS EF-Tu抗血清的補體介導殺支原體活性和MS EF-Tu細胞黏附特性的研究，為MS EF-Tu生物學功能的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株、載體、細胞與動物 MS WVU1853株購自中國獸醫微生物菌株保藏管理中心；pET-InaZN-EGFP(+)膜表面展示載體、DF-1細胞為本實驗室保存；pET-28a(+)購自寶生物工程(大連)有限公司；新西蘭兔購自蘭州獸醫研究所實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 支原體培養基基礎購自青島海博生物技術有限公司；PrimeSTAR Max Premix(2×)、T4 DNA連接酶、限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ均購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA Marker購自北京康為世紀生物科技有限公司；預染蛋白Marker購自Thermo公司；Ni-NTA His Bind購自QIAGEN公司；胎牛血清(FBS)購自BI公司；DMEM培養基、0.25%胰酶-EDTA溶液購自上海源培生物有限公司；山羊抗兔HPR-IgG、FITC-IgG、Cy3-IgG均購自北京博奧森公司；ECL化學發光試劑盒、DiI (細胞膜紅色熒光探針)、DAPI染色液購自碧云天生物技術有限公司；兔抗MS血清為本實驗室制備。

1.2 方法

1.2.1 MS基因組DNA提取 MS培養及提取其基因組DNA參照任峰等[19]所述方法。

1.2.2 MSEF-Tu基因的擴增 參考GenBank 中MS WVU1853株(NZ_CP011096.1)EF-Tu基因序列，設計引物對(Tu-F:GCGGGATCCATGGCAAAATTAGATTTTG/Tu-R：CGCCTCGAG- TTATTTAACGATTTTTGTA；分別引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點)。取MS基因組溶液4 μL，Tu-F與Tu-R溶液各1 μL，PrimeSTAR Max Premix(2×)20 μL，無菌水補足40 μL后進行PCR擴增。擴增條件：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸80 s，30個循環，72 ℃延伸7 min，產物回收備用。

1.2.3 pET-EF-Tu原核表達載體的構建 回收產物與pET-28a(+)質粒分別經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接，連接產物轉化大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)感受態細胞DH5α，37 ℃過夜培養后挑取單菌落經PCR和酶切鑒定，陽性克隆測序，正確質粒命名為pET-EF-Tu。

1.2.4 重組蛋白的原核表達 重組質粒pET-EF-Tu轉化E.coliBL21(DE3)，以終濃度1.0 mmol·L-1的IPTG誘導16 h后8 000 r·min-1離心10 min，棄上清，菌體經超聲裂解后按Ni-NTA His Bind試劑盒說明純化重組蛋白(rMS EF-Tu)并用SDS-PAGE分析。

經SDS-PAGE分離的rMS EF-Tu轉印至NC膜，依次經5%的脫脂乳4 ℃過夜封閉、1∶1 000稀釋的MS 抗血清室溫孵育2 h、1∶5 000稀釋的羊抗兔HRP-IgG室溫孵育1.5 h，ECL試劑盒顯色。

1.2.5 rMS EF-Tu抗血清的制備 取純化的重組蛋白rMS EF-Tu適量，參考Bao等[20]方法免疫新西蘭兔以制備多克隆抗體。按0.5 μg·孔-1MS菌體蛋白包被酶標板，應用間接ELISA 檢測抗血清效價。

1.2.6 MS EF-Tu在MS中分布的分析 取培養至對數生長后期的MS菌液 100 mL，參考劉佳等[21]所述的方法提取MS細胞膜蛋白及細胞質蛋白。將提取的MS菌體蛋白、胞膜蛋白和胞質蛋白分別包被酶標板，以1∶400稀釋的rMS EF-Tu抗血清為一抗，應用ELISA方法分析EF-Tu在MS中的分布。同時，將提取的MS細胞膜、細胞質及其菌體蛋白制樣后取15 μL上樣，按“1.2.4”所述進行Western blot分析，一抗為1∶1 000稀釋的rMS EF-Tu抗血清，牛血清白蛋白(BSA)為陰性對照，純化的rMS EF-Tu為陽性對照。

以免疫熒光試驗分析EF-Tu在MS表面的分布，步驟如下：取對數生長期的MS液體培養物1 mL， 8 000 r·min-1離心10 min，棄上清，沉淀用50 μL無菌PBS重懸后取適量涂片，自然風干后用4%多聚甲醛固定，PBST洗滌后用1∶1 000稀釋的rMS EF-Tu抗血清室溫孵育2 h，經PBST洗滌后用1∶500稀釋的羊抗兔FITC-IgG 于37 ℃避光孵育1 h，PBST充分洗滌后封片觀察。

1.2.7 補體殺菌試驗 試驗所用血清56 ℃滅活30 min。取2 mL對數生長期的MS菌液(1.5×108CFU·mL-1) 經8 000 r·min-1離心10 min后棄上清，沉淀用無菌PBS懸浮洗滌3次后重懸于1 mL PBS。取血清60 μL與180 μL MS菌體懸液混合，37 ℃孵育30 min后加入60 μL的補體，充分混勻，37 ℃孵育1 h后10倍比稀釋，選取103、104、105稀釋度的懸液按分別涂布60 mm固體培養基(100 μL·板-1)，每個稀釋度平行重復3個。37 ℃、5% CO2的溫箱中培養3～5 d后計數菌落。試驗設rMs EF-Tu抗血清組、MS菌體抗血清組、免疫前血清組、補體對照組(用60 μL PBS替代血清)，重復3次后按照以下公式計算殺支原體率(%)：

100%

1.2.8 黏附及抑制試驗 黏附及抑制試驗參考Bao等[22]所述：構建重組質粒pET-InaZN-EGFP-EF-Tu后轉化E.coliBL21(DE3)并誘導表達，表達菌經無菌PBS洗滌后以無抗無血清DMEM重懸。按100 MOI的量取樣，無抗無血清DMEM定容至1 mL后加入六孔板中單層DF-1細胞，于37 ℃、5% CO2的培養箱中孵育2 h后用37 ℃預熱的PBS洗滌，除去未黏附菌體，用4%多聚甲醛固定后應用細胞膜紅色熒光探針和DAPI染色液分別對細胞膜和細胞核染色，最后經PBST洗滌后封片觀察。黏附抑制試驗時于表達菌中加入50 μL血清(1∶20)，混勻并于37 ℃孵育1 h后加入 DF-1細胞，按前述步驟完成黏附試驗。以pET-InaZN-EGFP轉化E.coliBL21(DE3)的菌株作為陰性對照。試驗重復3次。

2 結 果

2.1 MS EF-Tu基因的擴增及pET-EF-Tu載體的構建

MSEF-Tu基因經PCR擴增、產物回收、雙酶切后與pET-28a(+)連接，轉化至E.coliDH5α后涂布卡那霉素抗性平板，挑取長出的單菌落菌液PCR鑒定后以BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，目的條帶約1 185 bp(圖1)，測序結果均與MS WVU1853株EF-Tu序列一致，表明pET-EF-Tu載體構建成功。

M. DNA相對分子質量標準；1. pET-EF-Tu經BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切的產物M. DNA marker; 1. Product from pET-EF-Tu digested with BamHⅠ and XhoⅠ圖1 pET-EF-Tu雙酶切鑒定Fig.1 Identification of pET-EF-Tu by double endonucleases digestion

2.2 rMS EF-Tu的原核表達

pET-EF-Tu轉化E.coliBL21(DE3)后以IPTG誘導表達，SDS-PAGE結果表明，重組蛋白在大腸桿菌中成功表達，大小約為43 ku(圖2)；經Western blot分析，重組蛋白rMS EF-Tu可與MS菌體抗血清發生特異性反應，說明其具備反應原性(圖3)。

M. 蛋白質相對分子質量標準；1. IPTG誘導pET-28a (+) 表達菌；2. IPTG誘導pET-EF-Tu表達菌；3. IPTG誘導pET-EF-Tu表達菌上清；4. IPTG誘導pET-EF-Tu表達菌沉淀；5. 純化的重組蛋白rMS EF-TuM. Protein molecular weight marker; 1. Expression from pET-28a (+) after IPTG induction; 2. Expression from pET-EF-Tu after IPTG induction; 3. Supernatant of product from pET-EF-Tu after IPTG induction; 4. Sediment of product from pET-EF-Tu after IPTG induction; 5. Purified recombinant protein rMS EF-Tu圖2 原核表達pET-EF-Tu的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis about prokaryotic expression of pET-EF-Tu

M. 蛋白質相對分子質量標準；1. IPTG誘導pET-28a (+) 表達菌；2. 純化的重組蛋白rMS EF-TuM. Protein molecular weight marker; 1. Expression from pET-28a (+) after IPTG induction; 2. Recombinant protein rMS EF-Tu圖3 Western bolt分析rMS EF-TuFig.3 Western bolt analysis of rMS EF-Tu

2.3 rMS EF-Tu多克隆抗體的制備

以純化的重組蛋白免疫新西蘭白兔，經四次免疫，間接ELISA檢測rMS EF-Tu抗血清效價高于1∶16 000，表明重組蛋白具有免疫原性。

2.4 EF-Tu在MS細胞中的分布

將提取的MS細胞膜蛋白、細胞質蛋白以及菌體蛋白等體積包被酶標板后應用ELISA分析EF-Tu在MS的分布，同時將其等體積上樣后進行Western blot分析。結果表明，EF-Tu在MS細胞膜、細胞質蛋白中均有分布(圖4、圖5)，免疫熒光試驗亦證實EF-Tu在MS膜表面有分布(圖6)。

圖4 ELISA檢測EF-Tu在MS細胞中的分布Fig.4 Determination of the distribution of EF-Tu in MS cell by ELISA

M. 蛋白質相對分子質量標準；1. BSA；2. MS菌體蛋白；3. MS細胞膜蛋白；4. MS細胞質蛋白；5. 純化的重組蛋白rMS EF-TuM. Protein molecular weight marker; 1. BSA; 2. Total cellular proteins of MS; 3. The membrane proteins of MS; 4. The cytosolic proteins of MS; 5. Purified recombinant protein rMS EF-Tu圖5 Western blot檢測EF-Tu在MS細胞中的分布Fig.5 Determination of the localization of EF-Tu in MS cell by Western blot

2.5 補體殺菌試驗

補體殺菌試驗中，殺菌率計算結果顯示，MS菌體抗血清補體介導的殺支原體率為48.4%，而rMS EF-Tu抗血清補體介導的殺支原體率為16.15%，表明rMS EF-Tu抗血清具有補體介導的殺支原體活性(表1)。

表1 rMS EF-Tu抗血清的殺菌率

A. 陰性對照(免疫前血清)；B. 陽性對照(MS菌體抗血清)；C. 試驗組(rMS EF-Tu抗血清)A. Negative control (Pre-immune serum); B. Positive control (Anti-MS serum); C. Experimental group (Anti-rMS EF-Tu serum)圖6 免疫熒光試驗驗證EF-Tu在MS細胞膜表面的分布Fig.6 Verification of the distribution of EF-Tu on MS cell membrane surface by immunofluorescence tests

2.6 黏附及黏附抑制試驗

pET-InaZN-EGFP-EF-Tu轉化E.coliBL21(DE3)誘導表達的SDS-PAGE結果顯示，重組蛋白約為96 ku(圖7)；免疫熒光試驗結果顯示，經rMS EF-Tu抗血清處理的大腸桿菌能被紅色熒光標記的二抗特異性結合(圖8)，表明MS EF-Tu成功展示在大腸桿菌膜表面，即獲得E.coli-InaZN-EGFP菌株；黏附及抑制試驗結果表明，E.coli-InaZN-EGFP-EF-Tu可有效黏附至DF-1細胞(圖9A)，E.coli-InaZN-EGFP菌株對DF-1無黏附作用(圖9B)，且E.coli-InaZN-EGFP-EF-Tu對DF-1細胞的黏附可被rMS EF-Tu抗血清或MS菌體抗血清有效抑制(圖9C、D)，表明EF-Tu是MS的一種黏附相關蛋白。

M. 蛋白質相對分子質量標準；1、2. IPTG誘導pET-InaZN-EGFP、pET-InaZN-EGFP-EF-Tu表達菌M. Protein molecular weight marker; 1,2. Expression from pET-InaZN-EGFP, pET-InaZN-EGFP-EF-Tu after IPTG induction圖7 原核表達pET-InaZN-EGFP-EF-Tu的SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis about prokaryotic expression of pET-InaZN-EGFP-EF-Tu

A. 通過GFP觀察的E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu；B. rMS EF-Tu抗血清和Cy3-IgG偶聯物標記的E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu；C. E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu熒光圖像的合并；D. 通過GFP觀察的E. coli-InaZN-EGFP；E. rMS EF-Tu抗血清和Cy3-IgG偶聯物標記的E. coli-InaZN-EGFP；F. E. coli-InaZN-EGFP熒光圖像的合并A. The E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu was observed by GFP; B. E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu labeled with anti-rMS EF-Tu serum and Cy3-IgG conjugate; C. Fluorescence images of E. coli-InaZN-EGFP were merged; D. The E.coli-InaZN-EGFP was observed by carried GFP; E. E. coli-InaZN-eGFP marked with anti-rMS EF-Tu serum and Cy3-IgG conjugate; F. Fluorescence images of E. coli-InaZN-EGFP were merged圖8 免疫熒光試驗檢測pET-InaZN-EGFP-EF-Tu在大腸桿菌膜表面的表達Fig.8 The expression of pET-InaZN-EGFP-EF-Tu displayed on the E.coli surface was detected by immunofluorescence tests

A. E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu黏附DF-1細胞；B. E. coli-InaZN-EGFP黏附DF-1細胞；C. rMS EF-Tu抗血清對E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu黏附DF-1細胞的抑制；D. MS菌體抗血清對E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu黏附DF-1細胞的抑制A. The E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu adhered to the DF-1 cells; B. The E. coli-InaZN-EGFP adhered to the DF-1 cells; C. The E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu adhered to the DF-1 cells were inhibited by anti-rMS EF-Tu serum; D. The E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu adhered to the DF-1 cells were inhibited by anti-MS serum圖9 表面展示MS EF-Tu的大腸桿菌對DF-1細胞的黏附及黏附抑制Fig.9 The adhesion and adhesion inhibition of MS EF-Tu displayed E. coli to DF-1 cells

3 討 論

支原體對宿主細胞的黏附是其感染宿主的先決條件[1]。研究表明，MS膜表面蛋白與其致病性和免疫應答有關。報道最多的有膜表面可變脂蛋白血凝素(variable lipoprotein haemagglutinin，VlhA)，VlhA經核糖體翻譯后被切割成羧基端(MSPA)和氨基端(MSPB)兩部分，其中MSPA 主要參與MS對宿主細胞的黏附，MSPB是高頻可變性抗原，重點參與MS對免疫的逃避[23-25]。而烯醇化酶(enolase，Eno)[26]，丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase，PDC)α、β亞基[20]，NADH 氧化酶(NADH oxidase，NOX)[27]，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)[19]和二硫辛酸脫氫酶(dihydrolipoamide dehydrogenase，DLD)[28]等的黏附功能和抗原性亦陸續被證實。

EF-Tu是細菌中最豐富的蛋白之一，在一些病原侵入機體后引起的宿主免疫應答等生物過程中發揮重要作用[29]。研究發現，牛支原體、布魯氏菌(Brucella)、綿羊支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，Mo)、肺炎球菌(Streptococcuspneumoniae)、葡萄球菌(Staphylococcus)等病原菌的EF-Tu可作為相關疾病預防的候選抗原和診斷靶標[16,30-34]。本研究在MS EF-Tu基因克隆及原核表達的基礎上，利用Western blot和間接ELISA證實了rMS EF-Tu具有良好的免疫原性和抗原性，為MS的血清學診斷及亞單位疫苗研制提供理論依據。補體殺菌試驗證實了rMs EF-Tu抗血清的補體介導殺支原體活性，表明MS EF-Tu在宿主對其免疫應答中發揮作用。

EF-Tu在病原菌生物被膜形成及與細胞外基質結合等發揮著重要作用[35-37]。Yu等[38]發現rMhp EF-Tu能夠黏附于豬氣管上皮細胞(STEC)，rMhp EF-Tu 抗血清可以有效地抑制其對STEC的黏附。Ramiah等[39]在對植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的研究過程中發現去除EF-Tu等3個表面蛋白后，其黏附性下降了40%。本研究結果證實EF-Tu在MS胞膜和胞質均有分布，且在MS膜表面有定位。因此，該蛋白可能參與MS對宿主的感染與免疫應答。本研究通過黏附及抑制試驗，證實rMS EF-Tu能夠有效介導大腸桿菌黏附DF-1細胞，確證MS的EF-Tu是其黏附相關蛋白。

4 結 論

本研究在構建熱不穩定延伸因子(EF-Tu)原核表達載體pET-EF-Tu的基礎上，證實EF-Tu是具有免疫原性的MS膜表面相關蛋白，rMS EF-Tu產生的抗體具有補體介導的殺支原體作用，且EF-Tu可介導大腸桿菌黏附宿主細胞DF-1，表明其與MS感染宿主細胞和引起免疫應答有關。這一研究結果對進一步探究 EF-Tu在MS甚至其他支原體等胞內寄生致病菌侵入及其致病機理的研究意義重大。