7株雞滑液囊支原體四川分離株全基因組分析

劉麗佳，王 譽，張煥容,王嘉博

(西南民族大學畜牧獸醫學院，成都 610041)

滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae，MS)是一種危害禽類和鳥類健康的重要病原，可引起滑液囊支原體病，又稱傳染性滑膜炎[1]。該病可通過直接接觸水平傳播或經卵垂直傳播，不同發育階段的雞均可感染，導致采食量下降，飼料轉化率下降，生長發育遲緩，胴體降級[2-3]；成年雞關節腫大，滑膜炎，出現呼吸癥狀，蛋雞產蛋率下降，蛋殼頂端異常，種蛋孵化率降低[4]。單一的MS感染很少導致雞死亡，但會降低雞的免疫力，導致繼發感染[5]。Olson等首次在美國發現該病，隨后在法國、意大利、澳大利亞及葡萄牙等國家相繼報道該病。近年來，國內外多個地區均存在MS感染，且該病有發展及蔓延趨勢，給養禽業帶來較大的經濟損失。馬爽等[6]對我國11個省份不同雞場進行檢測，均發現MS感染，雞群感染率超過69%[7]。MS基因組較細菌小，為750～850 kb，G+C含量為28%左右。NCBI收錄的MS全基因組有10條，包括巴西MS53株[8]、美國WVU-1853株[9]、澳大利亞86079/7 NS株[10]、中國河南HN01株[11]，以及經86079/7 NS誘導獲得的MS-H株[12]。MS-H株是MS弱毒疫苗生產用菌株，是全球通用的MS弱毒疫苗株，但研究表明，MS-H株疫苗僅對未感染MS的雞群有效，對已感染MS的雞群幾乎無效，甚至可能會加重病情[13]。全基因組測序是了解基因序列信息的一種重要手段，中國目前只有1株分離自河南的HN01全基因組序列，因此，關于我國MS的遺傳多樣性資料不全面。本實驗室于2018—2019年，從川西4個規模2 000只以上三黃雞肉雞場分離出7株MS[14]，4個場均未免疫MS弱毒疫苗，發病雞表現為跗關節腫大、胸部囊腫，剖檢時可見跗關節腔、爪墊、胸部龍骨滑膜囊有淡黃色膠凍樣分泌物，或黃色干酪樣分泌物附著。本試驗對7株MS進行全基因組測序，通過生物信息學分析，確定MS分離株的基因組成、基因島等基因組特征；并與NCBI上其他MS株的基因組序列比較分析，明確川西地區MS菌株的遺傳進化關系和差異基因，為進一步研究MS的致病機制、開發MS亞單位疫苗和建立特異性檢測技術等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 MS分離株

7株MS四川分離株由西南民族大學動物醫學實驗室分離鑒定并保存，分別命名為MS251、MS254、MS221、MS231、MS12H、MS1G、MSK1，其中MS251、MS254、MS221、MS231分離自同一雞場，MS12H、MS1G、MSK1分離自其他3個雞場。改良 Frey氏培養基購自北京中海生物科技有限公司。

1.2 MS分離株培養和DNA提取

分別將7株MS株各200 μL菌液接種到1.8 mL改良Frey氏液體培養基中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養，待培養基顏色變黃時收集菌液即為MS分離株種子菌液。經半固體培養基培養及菌落形態觀察確定是否符合MS的培養特征，并將經特異性PCR擴增鑒定的種子菌液擴大培養后提取MS基因組DNA。要求基因組DNA完整且沒有降解，在23 kb以上，OD260 nm/OD280 nm值為1.8～2.0；DNA濃度>30 ng·μL-1。

1.3 全基因組測序、原始數據質量評估和質量控制

7株MS全基因組測序由北京賽默百合生物科技有限公司完成，采用Illumina HiSeq平臺測序，構建PE 測序文庫，得到的原始圖像數據經過 Base Calling處理后，FASTQ 格式文件存儲讀長(read)的堿基及其質量信息。對原始測序數據使用 FastQC(版本 0.11.5)進行堿基質量統計，并使用 R 統計軟件對結果進行可視化。使用 Trimmomatic(版本 0.36)對序列進行修剪和去除接頭序列。

1.4 7株MS的基因從頭組裝、基因預測和注釋

利用Edena軟件，通過設置默認參數將所有過濾后的 reads 進行組裝，得到最終的組裝結果并統計長度信息。使用經典的OLC(overlap-layout-consensus)算法架構的組裝工具，將經過算法處理后的reads進行組裝。組裝后，得到多條Contig。使用 Prodigal對CDS進行預測，使用SignalP對信號肽進行預測，使用 infernal+Rnammer對tRNA、rRNA 進行預測。將所有的CDS序列利用blast比對到KEGG、Swissport、Nr、Nt、eggNOG 數據庫，并進行注釋，evalue 閾值統一為1×10-35。

1.5 MS全基因組比較分析

在進行全基因組比較時，引用了NCBI上收錄的8株MS的全基因組序列，分別為86079-7 NS(NZ_CP012624.1)、86079/7 NS (NZ_CP029258.1)、HN01(NZ_CP034544.1)、MS53(NC_007294.1)、MS-H(NZ_KP704286.1)、MS-H(NZ_CP021129.1)、NCTC10124(NZ_LS991953.1)、WVU1853T(NZ_CP011096.1)。使用Xshell軟件對注釋完成的7株MS四川分離株全基因組進行篩選統計，包括總基因長度、GC含量、編碼基因。使用R語言中的genoPlotR包，將7株MS四川分離株的全基因組與NCBI上記錄的8株MS全基因組比較，分析分離株與其他野毒株和疫苗株的差異。將差異區域進行線性分析。

2 結 果

2.1 提取的MS分離株DNA質量

MS分離株DNA提取結果表明MS基因組DNA完整且沒有降解，在23 kb以上， 測量的OD260 nm/OD280 nm比值為1.8～2.0；DNA濃度大于30 ng·μL-1，符合測序要求。

2.2 全基因組測序及預測

使用Xshell軟件中 shell腳本語言對全基因組篩選統計，結果顯示，7株MS全基因總長度在760～810 kb， GC含量28.2%～28.44%，編碼基因數677～725個， CDS 636～685個，rRNAs 5 個， tRNA數34個，tmRNA 1個。詳見表1。

表1 7株MS全基因組的基本信息

2.3 基因注釋

2.3.1 COG文庫注釋 將所有預測到的蛋白質與 EggNOG 4.0數據庫進行比對后，取evalue 1×10-35為閾值，取best hit one 作為映射依據進行COG 注釋。COG基因功能注釋后分類結果顯示，7株MS 四川分離株MS251、MS254、MS221、MS231、MS12H、MS1G、MSK1功能基因數分別為528、527、527、527、512、514、510個。按照功能分類又可分為三大類，第一類代謝基因，包括氨基酸的運輸和代謝、碳水化合物的運輸和代謝、輔酶的運輸和代謝、無機離子的轉運和代謝、脂質轉運與代謝、核苷酸的運輸和代謝、次生代謝產物生物合成運輸和分解代謝、能源生產與轉換；第二類信息儲存和處理基因，包括轉錄、復制重組和修復、防御機制；第三類為細胞過程和信號轉導基因，包括細胞周期控制、細胞分裂和染色體分割、細胞壁/膜/外殼起源、細胞內運輸、細胞運動性，分泌和囊泡運輸、翻譯后修飾，蛋白質轉換，伴侶、信號轉導機制、翻譯、核糖體結構和生物發生。還含有功能未知基因和預測基因，結果如表2所示。結果顯示，7株MS功能基因種類相同，來自同一雞場的4個分離株MS251、MS254、MS221、MS231，其功能基因個數幾乎相同，而分別來自其他3個雞場的MS12H、MS1G、MSK1間功能基因個數差異相對較小，但較來自同一雞場的4株MS碳水化合物的運輸和代謝基因數少8～9個，其他部分基因數差異在0～3個之間，如表2所示。

表2 7株MS分離株 COG注釋結果

2.3.2 GO文庫注釋 將所有基因序列比對到Swissport數據庫，并使用 blast2 GO進行GO Mapping。所有的GO根據GO的有向無環圖向上回溯，直到第3層，而后統計第3層GO的分析結果。結果顯示，功能基因包括分子功能、生物過程、細胞成分3大部分。分子功能基因包括催化活性、結構分子活性、轉運蛋白活性、翻譯調節活性、分子功能調節因子、結合因子；生物過程基因包括細胞過程、生物調節、對刺激的反應、代謝過程、生物間相互作用、定位、復制；細胞成分基因包括細胞解剖實體、含蛋白質的復合物。分析結果表明，7株MS四川分離株功能基因種類相同，同場內分離的MS251、MS254、MS221、MS231，功能基因數幾乎相同，分別來自3個雞場的MS分離株MS12H、MS1G、MSK1間在部分功能基因數上差異相對較小，但較同場內分離的4株MS的催化活性基因數少7～8個、細胞過程基因數少4～6個，其他部分基因數差異在0～3個之間，如表3所示。

表3 7株MS分離株GO文庫注釋結果

2.3.3 KEGG 文庫注釋 將所得的序列比對到 KEGG數據庫并進一步映射到 KO(KEGG orthology)，并通過 KO 映射到 Pathway，對KEGG 每一個功能模塊的 Pathway 映射到的基因數進行統計的結果如下，細胞過程：細胞群落-原核生物、細胞生長和死亡、細胞運動性、運輸和分解代謝；環境信息處理：膜運輸、信號傳導；遺傳信息處理：翻譯、復制和修復、折疊、分類和降解、轉錄；新陳代謝：碳水化合物代謝、核苷酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素的代謝、氨基酸代謝、類脂物代謝作用、其他氨基酸的代謝、生物降解和代謝、萜類和多酮的代謝、其他次生代謝產物的生物合成、糖的生物合成和代謝。結果顯示，7株MS四川分離株功能基因種類相同，MS251、MS254、MS221、MS231各種功能基因數目幾乎相同，MS12H、MS1G、MSK1間部分功能基因數差異相對較小，較4株同場分離MS的膜運輸基因少6～9個、碳水化合物代謝基因少12～13個，氨基酸代謝基因少3～6個，能量代謝基因數少2～5個，其他部分基因數相差異在0～3個之間。詳見表4。

2.3.4 Nr 和Nt文庫注釋結果 將所有的基因序列比對到 Nr和Nt 數據庫,結果顯示，7株MS分離株測序基因99.69%以上來源于MS基因，但有少部分基因可能來源于雞毒支原體。證明7株分離株為MS。

2.4 專業數據庫分析

2.4.1 PHI-base 數據庫分析 PHI-base數據庫(pathogen host interactions database)從文獻中收集了大量致病基因和效應基因的序列。根據數據庫中病原基因表型對照分析7株MS分離株的基因表型結果顯示，導致病原菌致病能力喪失的基因為3個；導致病原菌致病能力減弱的基因MS251、MS221、MS231為44個，其余菌株45個；對病原菌致病性沒有影響的基因均為10個；導致病原致病能力增強的基因MS1G 8個，其余菌株有9個；致病效應基因7株MS均為2個，致死因子基因MS251、MS254、MS221、MS231為3個，MS12H、MS1G、MSK1為2個，抗藥和感藥基因在各分離株均1個。詳見表5。

表4 7株MS分離株KEGG 文庫注釋結果

2.4.2 VFDB 數據庫分析 使用 blastp將所有預測出的蛋白質序列比對到 VFDB 數據庫中，以1×10-35作為閾值進行篩選。VFDB記錄了大量毒力因子序列信息，結果顯示分離的7株MS含有25種毒力因子，msbA、sugC、oppF基因拷貝數均為2，tnp其拷貝數MS251、MS254、MS221、MS231、MS12H、MS1G、MSK1分別為6、5、5、5、3、3、2，VlhA基因高拷貝存在各菌株中，其拷貝數分別為17、16、17、13、14、25、13個，表明VlhA是MS主要的毒力因子，對MS的致病性具有重大作用，剩余毒力基因7株MS拷貝數均為1。詳見表6。

2.5 全基因組比較

2.5.1 全基因組進化圖 用MEGAX軟件將7株MS分離株與NCBI上收錄的8株MS全基因組比較，發現7株MS四川分離株與NCBI上收錄的HN01基因組最接近，而與NCBI上其余7株MS遺傳距離較遠，7株MS分離株間基因組存在差異，MS251、MS221和MSK1聚為一小支，MS231、MS12H和MS254、MS1G與HN01聚為另一小支。詳見圖1。

2.5.2 全基因組比較圈圖 用MEGAX軟件將7株MS分離株與NCBI上收錄的8株MS全基因組進行圈圖比較(圖2)，發現7株MS四川分離株與巴西分離株MS53、美國分離株WVU-1853、澳大利亞分離株86079/7 NS以及疫苗株MS-H差異較大，而與中國河南分離株HN01最相近，但在37～50、190～220、490～500、530～560、680～780、790～820 kb 6處片段區域與HN01存在差異(圖2)。

表5 7株MS分離株PHI 文庫分析結果

表6 7株MS分離株毒力因子種類及數量

圖1 7株MS和8株NCBI登錄菌株進化圖Fig.1 Evolution diagram of 7 MS and 8 NCBI registered strains

2.5.3 與HN01差異區域線性分析 使用R語言中的genoPlotR作圖，將分離株與HN01株6處差異片段區域進行線性比較。比較37～50 kb片段區域,發現HN01上存在的3個基因lepB、NA和fusA在7株MS四川分離株上分布不一致。lepB基因在MS251、MS254、MS221、MS12H呈長片段對應，但是片段倒位，與HN01方向相反，且位置也發生改變，而在MS231、MS1G和MSK1上呈小片段對應。NA和fusA對應片段都是散射性地分布在7株MS四川分離株間，且片段較短(圖3)。

RuvB. Holliday_junction_ATP-dependent_DNA_helicase_RuvB; Pa. Phosphate_acyltransferase; R3. Ribonuclease_3; aRlmCD. 23S_rRNA_(uracil-C(5))-methyltransferase_aRlmCD; MnmA. tRNA-specific_2-thiouridylase_MnmA; Lld. L-lactate_dehydrogenase; RecO. DNA_repair_protein_RecO; A. DNA_topoisomerase_4_subunit_A; Pgdp1. Putative_glycerophosphoryl_diester_phosphodiesterase_1; IV. DNA_polymerase_IV; Cop1. ComE_operon_protein_1; Ef4. Elongation_factor_4; FtsH. ATP-dependent_zinc_metalloprotease_FtsH; PcrA. ATP-dependent_DNA_helicase_PcrA; RR. Ribonuclease_R; Gtl. Glycine--tRNA_ligase; NrnA. Bifunctional_oligoribonuclease_and_PAP_phosphatase_NrnA紅色線段和紅色邊框線段代表與HN01的基因方向相反，藍色線段代表與HN01的基因方向相同，下圖同The red line segment and the red border line represent the opposite direction to the HN01 gene, the blue line represents the same direction as the HN01 gene, the same as below圖3 37～50 kb間線性比較圖Fig.3 Linear comparison between 37-50 kb

比較190～220 kb序列，發現HN01上的rumC在MS251、MS254、MS221、MS12H上都有對應長片段分布，片段倒位，與HN01方向相反，存在移位。NA在MS251、MS254、MS221上有對應長片段，倒位，有移位。secDF、obgE、trpS則在7株MS四川分離株上呈散在分布的小片段，既有同向的，也有反向的。在7株MS分離株上此基因片段間都有OPPF和sugC2個毒力因子片段(圖4)。

490～500 kb間，HN01上的5個基因與7株MS分離株分布不一致。efp在MS231上有長片段對應，在MS251、MS254、MS221、MS12H上有部分片段對應，長度相同，位置對應，基因片段倒位，與HN01株方向相反，有移位。dcm在MS231和MS1G分離株上有長片段對應，倒位，在其余5株上對應片段散在分布，片段較短，方向與HN01上既有相同的也有相反的。NA、aspS和hisS基因在7株MS四川分離株上對應片段散在分布，片段較短(圖5)。

RecO. DNArepair_protein_RecO; RuvB. Holliday_junction_ATP-dependent_DNA_helicase_RuvB; RibF. Putative_riboflavin_biosynthesis_protein_RibF; OppF. Oligopeptide_transport_ATP-binding_protein_OppF; MnmG. tRNA_uridine_5-carboxymethylaminomethyl_modification_enzyme_MnmG; SugC. Trehalose_import_ATP-binding_protein_SugC; NrnA. Bifunctional_oligoribonuclease_and_PAP_phosphatase_NrnA圖4 190～220 kb間線性比較圖Fig.4 Linear comparison between 190-220 kb

RibF. Putative_riboflavin_biosynthesis_protein_RibF; Smc. Chromosome_partition_protein_Smc; EcfA1. Energy-coupling_factor_transporter_ATP-binding_protein_EcfA1; DnaA. Chromosomal_replication_initiator_protein_DnaA; OppF. Oligopeptide_transport_ATP-binding_protein_OppF圖5 490～500 kb線性比較圖Fig.5 Linear comparison between 490-500 kb

530～560 kb 間差異片段基因比較結果表明：HN01只有1個基因NA在MS231和MS1G上有長片段對應，倒位，且有位移。在MS251、MS254、MS221、MS12H上有NA基因對應小片段，且位置相同(圖6)。

在680～780 kb間，HN01上有1個基因pyk在MS251、MS221、MS12H上有該基因長片段對應，但都倒位，MS251和MS221位置相同，而MS12H位置不同，其他4株MS只有小片段對應，且方向不同(圖7)。

790～820 kb之間，HN01上有3個基因，其中rnc在MS251和MS12H上有大片段對應，倒位，且基因位置不同。NA在MS251、MS254、MS221、MS12H上有基因片段對應，位置相似，但倒位，如圖8所示。

以上結果表明6段基因線性比較，MS251、MS254、MS221、MS12H結構相似，MS231和MS1G相似，MSK1較短，與其他6株MS差異較大。7株MS分離株中除了HN01的基因外，在6個區域中，還含有其他的基因，包括一些酶、生長因子、毒力因子。其中圖4中，7株MS上都有毒力基因OPPF和sugC。這6個區域的差異對于四川分離株生物學特性及理化性質可能具有影響。

OpuBA. Transport_ATP-binding_protein_OpuBA; LolD. Lipoprotein-releasing_system_ATP-binding_protein_LolD; SecY. preprotein_translocase_subunit_SecY; BceA. Bacitracin_export_ATP-binding_protein_BceA; YbeY. Endoribonuclease_YbeY圖7 680～780 kb線性比較圖Fig.7 Linear comparison between 680-780 kb

DnaK. Chaperone_protein_DnaK; YcfH. putative_deoxyribonuclease_YcfH; CysA. Sulfate/thiosulfate_import_ATP-binding_protein_CysA; SecA. preprotein_translocase_subunit_SecA; MnmE. tRNA_modification_GTPase_MnmE圖8 790～820 kb線性比較圖Fig.8 Linear comparison between 790-820 kb

3 討 論

近年來，四川地區雞群MS感染較為嚴重。本試驗前期從四川地區4個暴發MS的雞場分離出7株MS，并對其致病性和耐藥性等生物學特性進行了研究。MS感染對雞和火雞的養殖影響嚴重[15]。MS-H株是世界上唯一的MS弱毒疫苗株[16]。研究發現MS-H對國內雞群MS的預防有的有效，有的效果差，甚至無效[17]。因此MS流行毒株全基因組測序分析對MS疫苗株的篩選、亞單位疫苗的開發和特異性檢測技術的建立是一項基礎性的工作。

本研究對7株MS四川分離株進行全基因組測序，eggNOG 根據序列的相似性尋找直系同源基因，基因編碼蛋白序列功能的注釋有COG、GO、KEGG等多數據庫形式，多數據庫比對保證了基因注釋的全面性，各數據庫比對結果相似，確定7株分離菌株均為MS，其中來自同一雞場的4株MS在基因數量及種類上差異較小，而與分離自另外3個雞場的3株MS差異較大，表明MS四川分離株存在豐富的遺傳多樣性。

PHI數據庫是研究病原與機體相互作用的專業數據庫，用于研究致病菌與宿主間的相互作用[18]。PHI數據庫分析7株MS導致病原菌致病能力降低的基因，除了共有基因，MS251、MS254、MS221、MS231還含有MoDeam基因，MS254特有glcA基因，MS12H、MS1G、MSK1含有FgTRR(FGSG_00871)和CaNAG1基因。致死因子中，MS251、MS254、MS221、MS231只含有GzOB009、GzOB006，而MS12H、MS1G、MSK1還含有TRR1基因。這些基因的差異可能與各MS分離株的致病性有關，推測MS251、MS254、MS221可能比MS12H、MS1G、MSK1有更強的致病性。TRR1基因表達硫氧還蛋白還原酶，Trr1可以降低Trx2-5，從而控制細胞內的氧化還原狀態，深刻影響球孢白僵菌對節肢動物的殺滅潛力。這些基因對MS致病性的影響還需要進一步的試驗驗證。藥敏試驗中發現7株分離株對土霉素、大觀霉素、泰樂菌素、替米考星等敏感，對紅霉素的MIC值較高，但基因庫分析7株MS只有1個抗藥基因GyrA具有抗氟喹諾酮類藥物的能力。

VFDB數據庫是記錄大量毒力因子序列信息的數據庫[19]，毒力因子是微生物代謝產生的具有侵襲力和毒力的分子，幫助微生物逃避或抑制宿主免疫反應。本研究將MS四川分離株序列信息導入VFDB數據庫分析，發現MS含有25種毒力因子，大多數毒力因子為單拷貝數，但msbA、sugC、oppF、VlhA、tnp為多拷貝數。MS中主要的毒力因子基因大多數與黏附和侵襲力有關。如VlhA在7株MS四川分離株中以多拷貝形式存在，拷貝數最小13，最大25，該基因編碼蛋白包含變脂蛋白(MSPB)和可變血凝素蛋白(MSPA)，介導MS黏附、侵襲和免疫逃避，是重要的毒力因子[20-21]。除VlhA外，pdhb、eno、CT396、MG-301等毒力基因，都已證明與支原體的黏附有關。前期初步研究顯示7株MS分離株對紅細胞具有吸附能力，以及對雞胚和雛雞有感染能力，但未對菌株間致病力強弱進行比較，因此需要在后續試驗中，驗證菌株毒力基因差異對致病力的影響。

用MEGAX軟件，將7株MS四川分離株與NCBI上收錄的8株MS全基因組比較，發現7株MS與中國河南HN01株基因組最近，且與世界各國流行株差異較大，說明中國MS流行株有其獨特性[11]。進一步通過全基因組圈圖比較，發現7株MS四川分離株和HN01株在全基因組上共有6個差異區域，在6個差異區域內，既包含HN01上的同源基因，還含有其他的差異基因，且同源基因長度相似，但有的出現倒位，這可能對MS的生物學特性產生影響。支原體DNA復制和修復功能的部分缺失可以阻止大的基因組倒位的形成[22]，已有研究發現MS-H基因組中存在55 kb的倒位，而MS-H親本株86079/7 NS的全基因組中也存在相同的倒位，證實基因組倒置不是由化學誘變引起的，而是自然發生的[10,23]。因此7株MS基因組中基因的倒位也可能是自然發生的。

在與HN01差異區域190～220 kb，7株MS四川分離株都存在毒力基因OppF和sugC，OppF為細胞質ATP酶，為肽的轉運提供能量[24-25]，對MS在氣管黏膜上皮細胞的定殖必不可少[26]。在MS-H疫苗株中oppF的移碼突變，導致其編碼蛋白的改變，最終導致該蛋白正常功能的喪失[23]，而在測序結果中顯示OPPF提前終止，沒有表達出完整的蛋白。sugC在結核分枝桿菌中編碼一種ABC轉運蛋白，參與海藻糖的輸入，ABC轉運蛋白的一個功能是作為ATPase的結構域[27]。除了毒力因子基因片段外，差異區域也包括一些編碼酶和其他各種因子的基因，這些差異可能影響MS的生物學特性。比較7株MS四川分離株之間6個差異區域發現，總體上，MS251、MS254、MS221基因結構相似；MS1G和MS231相近；MSK1單獨一支，且每個差異區域片段均較短。表明四川分離株在同場和不同場間，都存在遺傳多樣性。

4 結 論

目前，中國各個地區均存在MS感染。四川地區MS分離株全基因組比較分析發現，分離株與我國河南分離株HN01相近，與世界上主要MS流行株不同，可稱為中國流行株。四川地區MS分離株與HN01株基因組的6個差異基因區域編碼基因片段長度和方向倒位等變化，說明四川分離株發生了變異。而7株MS四川分離株間6個差異基因區域的不同，表明四川分離株不僅在不同場間，而且在同場間也存在遺傳多樣性。