精氨酸對熱應激處理的奶牛原代小腸上皮細胞增殖和凋亡的影響

豆夢瑩，張 才，李元曉*，邵 琦，朱佳麗，李 旺，曹志軍

(1. 河南科技大學動物科技學院，洛陽 471023； 2. 中國農業大學動物科技學院，北京 100193)

熱應激是造成畜禽養殖業經濟損失的主要原因之一，而奶牛對熱尤為敏感，熱應激是全球奶業面臨的重要挑戰[1-2]。熱應激不僅會導致奶牛生產性能下降，而且還會引起奶牛機體免疫機能下降和繁殖功能障礙等[3-4]。當發生熱應激時，機體會啟動散熱機制，流經腸道的血流量減少，導致腸道缺血、缺氧，營養物質供應不足，造成腸上皮細胞損傷且增殖受到影響，使腸道黏膜屏障通透性增加，機體產生炎癥反應甚至死亡[5-7]。可見，腸道損傷是熱應激奶牛的重要病理變化。腸道不僅是奶牛營養物質消化吸收的器官，也是在奶牛免疫防御的重要屏障，改善熱應激狀態下奶牛的腸道健康對奶牛的健康和生產性能具有重要的意義。利用營養調控來緩解或修復腸道損傷已成為研究者關注的熱點，其中，氨基酸營養(如谷氨酸、色氨酸等)緩解動物腸道損傷的研究也多有報道[8-9]。

精氨酸是一種條件性必需氨基酸，也是動物機體細胞內功能最多的氨基酸，不僅是合成蛋白質的原料以及多種生物活性物質(如一氧化氮、多胺、肌酸等)的前體物質，而且還具有抗炎、抗氧化、促進腸道功能發育等生理功能[10-13]。在微生物改變、熱應激、膿毒血癥等應激或疾病狀態下[14-16]，動物機體對精氨酸的營養需求量還會增加。研究發現，精氨酸恢復細胞正常生長的作用是其他氨基酸不可替代的[17]。通過體外模型研究精氨酸對腸道上皮細胞熱應激損傷的保護作用和機制，對生產實踐中合理使用精氨酸以減少熱應激造成的損失具有重要的意義。而體外培養小腸上皮細胞熱應激模型在鼠、豬、雞、山羊的熱應激研究中得到了廣泛應用[18-21]。因此，本研究在建立奶牛原代小腸上皮細胞熱應激損傷模型的基礎上，通過觀察細胞形態、檢測細胞增殖以及線粒體介導的細胞凋亡通路中關鍵基因Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9(cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)mRNA和蛋白的表達，探究精氨酸對熱應激奶牛腸道上皮細胞損傷修復效果，以期為精氨酸修復奶牛腸道屏障損傷提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

精氨酸(L-Arginine，純度>99%)購自北京鼎國生物技術有限責任公司，DMEM培養基、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚鹽酸核苷酸染料(DAPI)以及Ⅰ型膠原酶購自Gibco公司。胎牛血清(FBS)購自德國PAN-Biotech GmbH。磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、青霉素與鏈霉素混合液(100×)以及Cell Counting Kit(CCK-8)活力檢測試劑盒購自Solarbio公司。乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(型號A020-2-2)購自南京建成生物工程研究所。牛Bax、Bcl-2、Caspase-3以及Caspase-9檢測試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司。PrimeScriptTMRT reagent kit(反轉錄試劑盒)以及SYBR?Fast qPCR Mix(熒光定量試劑盒)購自TaKaRa公司。細胞培養箱(德國Thermo公司)，Scientific Multiskan FC型酶標儀及超微量核酸蛋白濃度測定儀(美國Thermo公司)，Axio Observer A1倒置熒光顯微鏡(德國蔡司公司)，CFX96熒光定量PCR儀(Bio-RAD公司)，流式細胞儀CytoFLEXS(美國貝克曼公司)。

1.2 奶牛原代小腸上皮細胞分離培養

將1日齡荷斯坦犢牛安樂死后，剪取15 cm長的十二指腸放到預冷的含4%雙抗的生理鹽水中，盡快轉移至實驗室。采用膠原酶消化法獲取奶牛小腸上皮細胞[22]。根據成纖維細胞和上皮細胞貼壁時間不同[20]，將細胞懸液接種到培養瓶培養1 h后，將細胞上清液吸出，接種到新的培養瓶繼續培養，以上步驟重復3次，此時小腸上皮細胞純度可達90%左右。將分離得到的小腸上皮細胞于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養箱中培養。每2 d換1次液，細胞鋪滿90%時進行傳代培養。用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化第2代奶牛小腸上皮細胞，細胞出現皺縮變圓時加培養基終止消化，離心后加培養基重懸細胞并將細胞吹打均勻，取少量細胞懸液用細胞計數板計數，并計算細胞懸液的總細胞數，加培養基稀釋細胞懸液，調整細胞密度，接種于96孔板(1×105個·mL-1)或6孔板(1×106個·mL-1)，用于后續試驗。試驗用的是第3代奶牛小腸上皮細胞。

1.3 試驗分組和處理

1.3.1 精氨酸添加濃度的篩選 將奶牛小腸上皮細胞分為空白對照組(Con組)和試驗組，試驗組包括熱應激組(HS組)和不同濃度精氨酸組(L-Arg組)，每組6個重復。處理過程如下：1)對照組、試驗組均用無血清培養基培養，Con組于37 ℃、試驗組于42 ℃、5%CO2培養箱中培養6 h[9,23]。2)棄去培養基用PBS洗兩次，Con組、HS組繼續用無血清培養基培養，L-Arg組更換成不同濃度(2、4、6、8、10 mmol·L-1) 的精氨酸培養基培養，所有處理組均于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，12 h后檢測細胞活力，篩選出最佳的精氨酸添加濃度，用于后續試驗。

1.3.2 精氨酸對熱應激奶牛小腸上皮細胞增殖和凋亡的影響 將奶牛小腸上皮細胞分為對照組(Con組)、熱應激組(HS組)和6 mmol·L-1精氨酸組(6 mmol·L-1L-Arg組)，每組6個重復。處理過程如下：1)3組細胞均用無血清培養基培養，Con組于37 ℃、HS組和6 mmol·L-1L-Arg組于42 ℃、5%CO2培養箱中培養6 h。2)棄去培養基用PBS洗兩次，Con組、HS組繼續用無血清培養基培養，6 mmol·L-1L-Arg組更換成6 mmol·L-1精氨酸培養基培養，3個處理組均于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，12 h后收集培養上清和細胞。

1.4 CCK-8檢測細胞活力

按照“1.3.1”試驗步驟對奶牛小腸上皮細胞進行培養和處理后，棄去培養基，用PBS溶液清洗1遍，每孔加入100 μL不含血清的培養基和10 μL的CCK-8試劑在37 ℃中孵育2 h，用酶標儀450 nm測OD值以計算細胞活力。選擇細胞活力最高的精氨酸濃度作為后續試驗的濃度。

1.5 DAPI染色觀察細胞的核形態變化

按照“1.3.2”試驗步驟對奶牛小腸上皮細胞進行培養和處理后，棄去培養基，每孔加100 μL 4%多聚甲醛固定20 min；棄甲醛，每孔加200 μL PBS液清洗兩次；每孔加DAPI溶液(10 μg·mL-1)，避光作用20 min；用PBS溶液清洗兩次，置于倒置熒光顯微鏡下在相同熒光強度和曝光時間下采集圖像信息，激發光波長為345 nm，發射光強度為455 nm。

1.6 微板法檢測乳酸脫氫酶(LDH)含量

按照“1.3.2”試驗步驟對奶牛小腸上皮細胞進行培養和處理后，收集細胞培養上清液，按照試劑盒說明書步驟進行測定。

1.7 流式細胞儀檢測細胞周期

按照“1.3.2”試驗步驟對奶牛小腸上皮細胞進行培養和處理后，用預冷PBS清洗細胞2次，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細胞，預冷的PBS洗滌細胞，加入-20 ℃預冷的75%乙醇固定細胞，4 ℃放置24 h。用冷PBS清洗細胞，2 500×g離心5 min，加入2 μL濃度為1 mg·mL-1的RNase去除RNA。加入100 μL PI染色液，避光染色20 min。用流式細胞儀進行上機檢測，激發波長488 nm，發射波長585 nm。用Modfit軟件分析細胞周期以確定細胞周期分布。

1.8 RT-PCR檢測基因表達

用PBS清洗細胞兩遍，用TRIzol提取總RNA，超微量核酸蛋白濃度測定儀檢測其濃度和純度，OD260 nm/OD280 nm=1.9～2.0 表示RNA純度較高；用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整度。按反轉錄試劑盒說明書步驟將RNA反轉錄成cDNA, 于-20 ℃冰箱保存。根據NCBI公布的牛的目的基因CyclinE1、CyclinB、CyclinG1、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9和內參基因GAPDH的mRNA序列，使用Premier 5.0設計特異性引物，委托生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。實時熒光定量PCR反應體系20 μL:2×SYBR Green Mix 10 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，RNase Free ddH2O 4 μL。每個處理組6個重復。采用2-△△Ct法計算各組基因的mRNA相對表達量。

1.9 ELISA檢測細胞凋亡相關蛋白含量

按照“1.3”試驗步驟對奶牛小腸上皮細胞進行培養和處理后，用預冷PBS清洗細胞2次，用細胞刮板將細胞從6孔板底部刮下，置于1.5 mL的EP管中。用細胞破碎儀破碎，得到待測樣本。按照試劑盒說明書分別檢測細胞內Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的蛋白含量。

1.10 數據統計分析

試驗原始數據先用EXCEL進行整理，然后利用SPSS 20.0軟件對數據進行組間單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法進行多重比較，P<0.05表示統計學檢驗差異顯著。結果用“平均值±標準差”表示。

2 結 果

2.1 精氨酸對熱應激奶牛小腸上皮細胞活力的影響

如圖1所示，與Con組相比，HS組細胞活力顯著降低(P<0.05)；與HS組相比，精氨酸濃度為2、4 mmol·L-1時，細胞活力差異不顯著(P>0.05)；精氨酸濃度為6 mmol·L-1時，細胞活力顯著高于HS組(P<0.05)，且低于Con組(P<0.05)；精氨酸濃度為10 mmol·L-1時，細胞活力受到抑制(P<0.05)。

2.2 精氨酸對熱應激奶牛小腸上皮細胞生長形態的影響

如圖2(Ⅰ)和(Ⅱ)所示，與Con組相比，HS組染色質濃縮、細胞的核形態不規則變化。與HS組相比，6 mmol·L-1L-Arg組染色濃縮、細胞的核形態不規則變化減少。

2.3 精氨酸對細胞上清液中乳酸脫氫酶(LDH)含量的影響

由圖2G可知，與Con組相比，HS組上清液中LDH 的含量顯著升高(P<0.05)。與HS 組相比，6 mmol·L-1L-Arg組上清液LDH的含量顯著降低(P<0.05)，與Con組相比差異不顯著(P>0.05)。

表1 引物序列

數據柱標含有相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同Value columns with the same small letter mean no significant difference (P>0.05)，while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below圖1 精氨酸對熱應激奶牛小腸上皮細胞活力的影響Fig.1 Effect of L-Arg on the activity of bovine intestinal epithelial cells challenged by heat stress

2.4 精氨酸對熱應激奶牛小腸上皮細胞周期細胞比率的影響

由圖3和表2可知，與Con組相比，HS組G1期細胞比率升高(P<0.05)，S期細胞比率顯著降低(P<0.05)，G2期細胞比率無顯著差異(P>0.05)；6 mmol·L-1L-Arg組G1期和G2期細胞比率顯著低于Con組和HS組(P<0.05)，S期細胞比率顯著高于Con組和HS組(P<0.05)。

2.5 精氨酸對熱應激奶牛小腸上皮細胞調控細胞周期相關因子mRNA相對表達量的影響

如圖4所示，HS組和6 mmol·L-1L-Arg組CyclinE1的mRNA相對表達量差異不顯著(P>0.05)，均顯著高于Con組(P<0.05)。與HS組相比，6 mmol·L-1L-Arg組的CyclinB和CyclinG1的mRNA相對表達量均顯著高于HS組(P<0.05)。 與Con組相比，HS組CyclinB和CyclinG1的mRNA相對表達量均差異不顯著(P>0.05)。

2.6 精氨酸對熱應激奶牛小腸上皮細胞凋亡相關因子mRNA相對表達量的影響

由圖5可得，HS組Bax、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2 mRNA相對表達量以及Bax/Bcl-2比值均顯著高于Con組(P<0.05)。與HS組相比，6 mmol·L-1L-Arg組Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA相對表達量以及Bax/Bcl-2比值顯著降低(P<0.05)，而Bcl-2的mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)。

(I).明場圖，(Ⅱ).DAPI染色圖；其中，A、D為對照組；B、E為熱應激組；C、F為6 mmol·L-1精氨酸組；紅色箭頭指的是染色質濃縮、細胞核形態不規則；G.是細胞上清液中乳酸脫氫酶的含量(I) Bright field figure, (Ⅱ) DAPI staining diagram. A, D. Control group; B, E. Heat stress group; C, F. 6 mmol·L-1 L-Arg group. The red arrows refer to chromatin condensation and irregular nuclear morphology. G. The content of lactate dehydrogenase in the supernatant of cells圖2 精氨酸對熱應激奶牛小腸上皮細胞形態及乳酸脫氫酶含量的影響Fig.2 Effects of L-Arg on morphology and lactate dehydrogenase content of intestinal epithelial cells challenged by heat stress

圖3 各組細胞周期檢測Fig.3 Detection of cell cycle in each group

表2 精氨酸對小腸上皮細胞各期細胞比率的影響

圖4 精氨酸對小腸上皮細胞調控細胞周期相關基因表達水平的影響Fig.4 The effect of L-Arg on the expression of cell cycle regulation-related genes in intestinal epithelial cells

圖5 精氨酸對小腸上皮細胞凋亡相關基因表達水平的影響Fig.5 Effect of L-Arg on the expression of apoptotic-related genes in intestinal epithelial cells

2.7 精氨酸對熱應激奶牛小腸上皮細胞凋亡蛋白含量的影響

由圖6可知，與Con組相比，HS組的Bax、Caspase-3、Caspase-9的蛋白含量以及Bax/Bcl-2比值顯著升高(P<0.05)，HS組Bcl-2蛋白含量顯著降低(P<0.05)。6 mmol·L-1L-Arg組Bax、Caspase-3、Caspase-9的蛋白含量及Bax/Bcl-2比值顯著低于HS組(P<0.05)，而Bcl-2蛋白含量顯著高于HS組(P<0.05)；與Con組相比，6 mmol·L-1L-Arg 組Bax蛋白含量顯著升高(P<0.05)，而Caspase-3、Caspase-9蛋白含量及Bax/Bcl-2比值差異不顯著(P>0.05)，Bcl-2蛋白含量顯著降低(P<0.05)。

圖6 精氨酸對小腸上皮細胞凋亡相關蛋白表達水平的影響Fig.6 Effect of L-Arg on the expression of apoptotic-related proteins in intestinal epithelial cells

3 討 論

熱應激會導致腸上皮細胞凋亡，造成腸道黏膜屏障損傷[24]。預防或緩解腸道上皮損傷是解決奶牛熱應激的有效策略。研究表明，功能性氨基酸精氨酸在胃腸道的生長、發育、成熟、修復等方面具有重要的調節作用[25]。本試驗結果顯示，在2～10 mmol·L-1范圍內，精氨酸濃度為6 mmol·L-1時，細胞活力達到最高值；精氨酸濃度低于6 mmol·L-1，細胞活力隨著濃度的增加而增加；精氨酸濃度高于6 mmol·L-1時，細胞活力逐漸降低，這可能是過量的精氨酸會對細胞產生毒性[26]。細胞周期是細胞功能的基本過程，分為G1期、S期(DNA合成)、G2期以及M期(有絲分裂)[27]，細胞周期對進一步研究細胞活力是非常重要的。熱應激會使細胞阻滯在G0/G1期[28]。本研究發現，添加6 mmol·L-1精氨酸后，G1期的細胞比率顯著低于熱應激組，且6 mmol·L-1精氨酸組S期的細胞比率顯著高于熱應激組和對照組，表明精氨酸可以緩解熱應激造成的細胞周期阻滯，促進細胞的增殖，這與前人的研究結果相符[27,29]。整個細胞周期進程有多種細胞周期特異性蛋白(Cyclins)和蛋白依賴性蛋白激酶家族(CDKs)驅動，如G1期到S期主要由CyclinD與CDK4/6的復合物和CyclinE與CDK2的復合物驅動，G2期到M期主要由CyclinB與CDK1的復合物驅動[29]。本研究中，熱應激組S期的細胞比率顯著低于對照組和精氨酸組，但是CyclinE1基因的表達量要高于對照組，而與精氨酸組相比差異不顯著。這可能是熱應激組CyclinE1基因在表達翻譯的過程受到了干擾。精氨酸組的CyclinE1和CyclinB基因的相對表達量均高于熱應激組，表明精氨酸通過調節細胞周期促進了熱應激奶牛小腸上皮細胞的增殖。CyclinG1是新發現的細胞周期蛋白G家族的重要成員，其對細胞的進程的調控具有正、負調節作用，這可能與CyclinG1作用的細胞和組織不同及其表達水平有關。有研究顯示，CyclinG1對小鼠子宮細胞增殖產生負面影響[30-31]。柳朝華[32]在研究CyclinG1在小鼠卵巢的表達及其與卵泡發育和卵母細胞成熟的關系時，發現CyclinG1可能作為細胞周期的正調節因子參與了卵泡生長發育和卵母細胞成熟過程的調控。Yue等[30]發現，CyclinG1呈孕激素依賴性表達，參與孕激素對子宮內膜基質細胞的促增殖作用。本研究中，精氨酸組的CyclinG1基因的相對表達量顯著升高，結合前面的研究結果，CyclinG1可能正向調控了熱應激奶牛小腸上皮細胞的增殖。乳酸脫氫酶(LDH)是一種穩定的細胞質酶。當細胞膜受損時，LDH會迅速釋放到細胞培養上清中，是細胞發生損傷的一種重要特征[33]。精氨酸可以促進細胞損傷修復。Zhang等[34]研究報道，培養基中添加100 μmol·L-1精氨酸能顯著降低脂多糖誘導的綿羊腸上皮細胞LDH的釋放量。梁鑫[35]研究發現，25 mmol·L-1精氨酸顯著降低了100、300 μg·mL-1丙稀晴染毒大鼠心肌細胞培養上清液LDH的活性。本試驗中，6 mmol·L-1精氨酸組的LDH含量顯著低于熱應激組，細胞損傷減少。無論是誘導損傷還是染毒損傷，添加精氨酸可以減少細胞損傷，其添加濃度和損傷程度、作用的靶器官以及物種等的不同均有關系。這表明不同的動物品種、生長階段、損傷誘因等的精氨酸添加量是不同的，需要在明確其作用機制的前提下，探索精氨酸在生產實踐中的合理應用。

凋亡指機體細胞在生長發育過程中或在一定條件下，通過細胞內外因素調控下而發生的一種程序性細胞死亡，其特征在于特定的形態學和生物化學變化，在早期屬于可逆過程[19,36]。研究發現，添加精氨酸可以減少鼠肝缺血再灌注損傷出現的染色質濃縮的凋亡細胞[37]。本試驗也發現，精氨酸組染色質濃縮細胞數要低于熱應激組(圖2)，減少了凋亡的發生。細胞凋亡主要包括兩種途徑：外源性(死亡受體介導)和內源性(線粒體介導)凋亡傳導通路[38]。霍愛華等[39]研究發現，熱應激可導致線粒體凋亡通路的激活。Bcl-2家族的Bax以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族的Caspase-9、Caspase-3在線粒體介導的凋亡通路中起著關鍵的起始調控和執行作用。黃琳[40]研究表明，精氨酸降低了飼喂氧化魚油仔豬腸道Caspase-3的活性，緩解了仔豬腸道的氧化損傷。王萬鐵等[41]研究報道，精氨酸降低了兔肺缺血-再灌注損傷的肺細胞Bax基因表達，提高了Bcl-2基因的表達，有效地減輕了缺血再灌注損傷。而在晏利瓊等[42]的研究發現，精氨酸對熱應激肉雞空腸Caspase-3及Bcl-2 mRNA的表達量均無影響。這可能與精氨酸添加量、動物個體差異以及試驗設計不同有關。本試驗結果顯示，小腸上皮細胞經過熱應激處理后，促凋亡因子Bax、Caspase-3、Caspase-9的相對表達水平和蛋白的含量顯著升高。雖然熱應激組Bcl-2基因表達量升高，但Bcl-2蛋白含量是降低，蛋白質是生理功能的執行者，且Bax/Bcl-2的基因比值是顯著升高的，說明熱應激導致細胞的凋亡增多[43-44]。通過添加精氨酸進行修復處理，促凋亡因子Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白表達量顯著降低，抗凋亡因子Bcl-2 mRNA和蛋白表達量顯著升高。這表明精氨酸可能通過影響細胞內Bax和Bcl-2的表達，抑制了線粒體信號轉導途徑促進Caspase-3酶解級聯反應，減少了細胞的凋亡。可見，精氨酸緩解了熱應激對奶牛小腸上皮細胞的凋亡損傷，這為精氨酸應用于預防或緩解奶牛熱應激提供了體外試驗理論依據。

4 結 論

本研究表明，精氨酸對體外培養的熱應激奶牛小腸上皮細胞的活力具有低濃度促進、高濃度抑制的作用效果。其中，添加6 mmol·L-1精氨酸的細胞活力最高，顯著改善細胞在G1期的阻滯；同時，6 mmol·L-1精氨酸可調控熱應激奶牛小腸上皮細胞與細胞凋亡相關因子的mRNA和蛋白水平的表達，顯著降低熱應激導致的小腸上皮細胞凋亡損傷。